本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法。
背景技术：
神经原基因(proneuralgene)atoh1a，属于bhlh家族转录因子，在脊椎动物毛细胞命运决定过程中起关键作用。已有研究表明，atoh1是毛细胞命运决定因子，过表达atoh1可以诱导过多毛细胞产生，缺失atoh1毛细胞无法形成。在斑马鱼侧线系统形成过程中，fgf信号可以起始notch信号通路配体deltaa表达。deltaa和deltad两者同时激活临近细胞的notch信号通路，抑制atoh1a表达，表达atoh1a的细胞最终将发育成毛细胞(haircells)，其临近notch信号活化的细胞因不能表达atoh1a将发育成助细胞(supportcells)，这就是notch信号通路通过atoh1a在毛细胞命运决定过程中所起的“侧向抑制”作用(lateralinhibition)。atoh1a和notch信号在侧线毛细胞命运决定过程中的作用和内耳中毛细胞命运决定的作用类似。
在哺乳动物中感觉毛细胞丢失或功能受损通常导致不可逆听力损伤或听力障碍。哺乳动物毛细胞只有有限的再生能力，小鼠只有前庭毛细胞(vestibularhaircells)可再生，耳蜗毛细胞(cochlearhaircells)基本不可自然再生。斑马鱼侧线毛细胞在耳毒性药物损伤后可完全再生，且侧线毛细胞在形态和功能上类似哺乳动物内耳毛细胞，研究发现一些导致侧线毛细胞功能障碍的基因突变后同样可导致人类的听力障碍。因此探究斑马鱼侧线毛细胞再生将有利于对毛细胞再生规律的解读。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法。
本发明的技术方案是：
一种atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法，所述方法利用atoh1a反义核苷酸探针，通过整胚原位杂交的方法，观察顺铂诱导斑马鱼侧线毛细胞死亡及再生过程中atoh1a的表达图式，并通过原位杂交和抗体染色共染的方法观察atoh1a的表达细胞类群与神经丘中心成熟毛细胞的空间关系，进一步通过外源添加notch信号抑制剂观察atoh1a表达增多的情况下再生毛细胞数目的变化。
作为优选的技术方案，所述atoh1a反义核苷酸探针合成具体为设计引物扩增atoh1amrna片段，连接ez-t载体，构建质粒，该质粒经线性化后，纯化回收，以该线性化质粒为模板，经t7聚合酶体外转录合成地高辛标记的反义探针，该探针经rnacleanupkit纯化回收，加入rnaseinhibitor-80℃保存。
作为优选的技术方案，所述整胚原位杂交与抗体染色共染方法具体为取10条斑马鱼样本，经4％pfa固定过夜，加入地高辛标记的atoh1a反义链探针孵育过夜，第二天加入碱性磷酸酶偶联二抗室温孵育4-5小时，后加入bcip和nbt底物避光显色；待显色完全后，加入ddh2o终止反应，并用pbs润洗2次；接着用封闭液pbdt×+2％goatserum室温阻断1小时，加入抗体rabbitanti-parvalbumin3于4度孵育过夜，第二天取出后加入二抗alexa
作为优选的技术方案，所述斑马鱼为野生型鱼系tübingen，侧线毛细胞特异性标记的转基因鱼系为sqet4。
作为优选的技术方案，所述顺铂浓度为1mm。
作为优选的技术方案，所述notch信号抑制剂为dapt。
作为优选的技术方案，所述dapt浓度为50μm。
由于采用了上述技术方案，一种atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法，所述方法利用atoh1a反义核苷酸探针，通过整胚原位杂交的方法，观察顺铂诱导斑马鱼侧线毛细胞死亡及再生过程中atoh1a的表达图式，并通过原位杂交和抗体染色共染的方法观察atoh1a的表达细胞类群与神经丘中心成熟毛细胞的空间关系，进一步通过外源添加notch信号抑制剂观察atoh1a表达增多的情况下再生毛细胞数目的变化，为明确atoh1a标记的细胞类群为斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的前体细胞提供在体实验依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明atoh1a在顺铂损伤毛细胞过程中的表达图式；
图2是本发明atoh1a/parvalbumin3在顺铂处理过程中的共染；
图3是本发明atoh1a在毛细胞再生过程中的表达图式；
图4是本发明抑制notch信号后atoh1a表达增加；
图5是本发明在毛细胞再生过程中抑制notch信号对再生毛细胞数目的影响。
具体实施方式
一种atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法，所述方法利用atoh1a反义核苷酸探针，通过整胚原位杂交的方法，观察顺铂诱导斑马鱼侧线毛细胞死亡及再生过程中atoh1a的表达图式，并通过原位杂交和抗体染色共染的方法观察atoh1a的表达细胞类群与神经丘中心成熟毛细胞的空间关系，进一步通过外源添加notch信号抑制剂观察atoh1a表达增多的情况下再生毛细胞数目的变化。
所述atoh1a反义核苷酸探针合成具体为设计引物扩增atoh1amrna片段，连接ez-t载体，构建质粒，该质粒经线性化后，纯化回收，以该线性化质粒为模板，经t7聚合酶体外转录合成地高辛标记的反义探针，该探针经rnacleanupkit纯化回收，加入rnaseinhibitor-80℃保存。
所述整胚原位杂交与抗体染色共染方法具体为取10条斑马鱼样本，经4％pfa固定过夜，加入地高辛标记的atoh1a反义链探针孵育过夜，第二天加入碱性磷酸酶偶联二抗室温孵育4-5小时，后加入bcip和nbt底物避光显色；待显色完全后，加入ddh2o终止反应，并用pbs润洗2次；接着用封闭液pbdt×+2％goatserum室温阻断1小时，加入抗体rabbitanti-parvalbumin3于4度孵育过夜，第二天取出后加入二抗alexa
所述斑马鱼为野生型鱼系tübingen，侧线毛细胞特异性标记的转基因鱼系为sqet4。
所述顺铂浓度为1mm。
所述notch信号抑制剂为dapt。
所述dapt浓度为50μm。
1.实验材料与方法
1.1实验材料：实验所用野生型鱼系为tübingen(简称tu)。侧线毛细胞特异性标记的转基因鱼系为sqet4。恒温28.5℃水环境饲养。顺铂(美国，sigma,479306)、dig-rnalabelingmix(瑞士，roche，11277073901)、trna(美国，sigma，r8759)、rnasein(美国，thermo,n8080119)、碱性磷酸酶抗地高辛抗体(瑞士，roche，11093274910)、肝素(美国，sigma，h3393)、抗体rabbitanti-parvalbumin3(美国，sigma,ab15736)、dapt(美国，selleckchem，s2215)。
1.2溶液的配制：实验所用顺铂浓度为1mm。dapt所用浓度为50μm。用养鱼水(e2)稀释小分子化合物至所需浓度，避光浸泡斑马鱼，就可达到在毛细胞再生过程中阻断该信号通路的目的。实验结束时回收小分子化合物，4℃避光保存备用。
1.3探针合成：设计引物扩增atoh1amrna片段，连接ez-t载体，构建质粒。该质粒经线性化后，纯化回收。以该线性化质粒为模板，经t7聚合酶体外转录合成地高辛标记的反义探针。该探针经rnacleanupkit(qiagen，74204)纯化回收，加入rnaseinhibitor-80℃保存。
1.4整胚原位杂交与抗体染色共染方法：取10条斑马鱼样本，经4％pfa固定过夜，加入地高辛标记的atoh1a反义链探针孵育过夜，第二天加入碱性磷酸酶偶联二抗室温孵育4至5小时，后加入bcip和nbt底物避光显色。待显色完全后，加入ddh2o终止反应，并用pbs润洗2次。接着用封闭液(pbdt×+2％goatserum)室温阻断1小时，加入抗体rabbitanti-parvalbumin3于4度孵育过夜，第二天取出后加入二抗alexa
1.5统计分析：斑马鱼侧线神经丘毛细胞的统计方法为计数后侧线前三个神经丘毛细胞数目取平均值，数据表示为均数±sem，采用studentt检验进行显著性分析。
2结果
2.1atoh1a在顺铂诱导毛细胞死亡过程中的表达图式。在顺铂损伤-再生毛细胞体系中，我们首先检测了atoh1a在毛细胞损伤过程中表达谱的变化。如图1所示，野生型鱼发育到5天时，atoh1a表达在靠近神经丘中心成熟毛细胞的外围(图1a，箭号所指)。顺铂加入杀死中心区域成熟毛细胞的过程中，在神经丘中心细胞的外围区域atoh1a的表达增加(图1c所示，箭号所指)。这种增加的趋势一直延续到顺铂药物处理的终点(图1f)。这说明表达atoh1a细胞类群随着中心毛细胞丢失而增加。
5dpf(dayspostfertilization)野生型鱼在1mm顺铂处理6小时的过程中，每隔1h取样固定，用atoh1a反义探针通过原位杂交的方法检测atoh1amrna表达变化。a：发育到5天，未处理前atoh1a在侧线神经丘的表达图谱。b-f：顺铂处理过程中atoh1a在侧线神经丘的表达图谱。外侧圆圈标示侧线神经丘的大小，内侧圆圈标示神经丘中心毛细胞区域。图1a，箭号所指指示未处理前atoh1a表达在神经丘中心毛细胞的外围，图1c所示，箭号所指指示在顺铂杀死神经丘中心毛细胞的时间段，atoh1a在神经丘中心细胞外围区域表达量增高。cis：cisplatin，顺铂。比例尺，10μm。
2.2atoh1a表达在紧挨成熟毛细胞的细胞类群。随后我们对顺铂处理毛细胞过程中表达atoh1a的细胞进行细胞类型的界定，我们同时利用抗体(anti-pv3)染色的方法标记成熟毛细胞和原位杂交方法标记atoh1a表达的细胞群的方式，观察atoh1a表达的细胞群和成熟毛细胞之间的关系。我们发现顺铂处理导致成熟毛细胞不断丢失过程中，表达atoh1a的细胞群始终靠近成熟的毛细胞群且不断增多，但两者没有重叠(图2)。这说明表达atoh1a的细胞类群紧挨神经丘中心成熟毛细胞，即顺铂诱导中心成熟毛细胞不断死亡的过程中，临近细胞类群开始表达atoh1a。
5dpf野生型鱼顺铂处理6小时的过程中，每隔1h取样固定，先用原位杂交方法检测atoh1a的表达变化，后用毛细胞特异性抗体(anti-pv3)染色方法检测同一神经丘里成熟毛细胞。a：顺铂处理前；b-f：顺铂处理过程中。蓝色圆圈标示侧线神经丘的大小。cis：cisplatin，顺铂。比例尺，10μm。
2.3atoh1a在毛细胞再生过程中的表达图式。如图3所示，去除药物的零点atoh1a在侧线神经丘细胞内的表达相对于对照组增加，到去除药物24小时，atoh1a的表达集中在神经丘中心区域细胞位置，到48小时中心成熟的毛细胞不再表达atoh1a，而其外周细胞仍然有atoh1a的表达。这暗示着外围表达atoh1a细胞前体逐渐成长为神经丘中心成熟毛细胞(图3，箭号指示神经丘中心成熟毛细胞不再表达atoh1a)。由此我们可以得知，在毛细胞再生过程中atoh1a的表达随着毛细胞分化成熟逐渐消失，这种现象类似于毛细胞发育过程中atoh1a在毛细胞前体细胞中表达而在分化成熟的毛细胞中不表达的现象。
5dpf野生型鱼顺铂处理6小时后，在毛细胞再生0小时(re0h)、24小时(re24h)和48小时(re48h)三个时间点取样，用atoh1a反义探针检测atoh1amrna表达变化。上：对照组。下：实验组。圈标示侧线神经丘的大小，箭号指示成熟的毛细胞不再表达atoh1a。re：recovery，恢复。比例尺，10μm。
2.4抑制notch信号后再生过程中atoh1a表达增多且再生毛细胞增加。已有研究表明，notch信号负调控atoh1a表达。我们在毛细胞再生过程中添加dapt抑制剂抑制notch信号强度，观察到相对于未添加抑制剂的再生组，添加dapt抑制剂实验组表达atoh1a细胞类群增多；而同时期正常对照组抑制notch信号后atoh1a表达没有明显变化。这暗示着在毛细胞再生过程中抑制notch信号后atoh1a标示的毛细胞前体增加(图4)。进一步我们观察抑制notch信号后毛细胞再生数目的变化，结果显示，加入dapt实验组毛细胞数目在恢复24小时(re24h)和不加dapt对照组毛细胞数目没有差别，但是在恢复到48小时时(re48h)对照组侧线神经丘平均毛细胞数目为8，而加入dapt实验组侧线神经丘平均毛细胞数目达到14，这种显著性增加一直延续至再生的72小时(如图5)。这说明了抑制notch信号通路后再生毛细胞数目增加，这和抑制notch信号后atoh1a表达毛细胞前体细胞增多相呼应。
实验组用顺铂处理诱导毛细胞丢失后，在毛细胞再生过程中添加50umdapt抑制notch信号，用atoh1a反义探针检测atoh1amrna表达变化。上：同等时期未用顺铂处理的对照组。下：用顺铂处理后的实验组。比例尺，10μm。
图5在毛细胞再生过程中抑制notch信号对再生毛细胞数目的影响。a：图片展示不加dapt(上排)和加入dapt(下排)对再生毛细胞数目的影响。b：统计数据显示在再生过程中加入dapt毛细胞再生数目的变化。比例尺，10μm。***,p＜0.0001，**,p＜0.001，n≥10。
实验结果显示，atoh1a在毛细胞再生过程与其发育过程表达谱的差异主要在于药物处理导致毛细胞死亡阶段；而在去除药物之后毛细胞再生的过程与已有报道毛细胞发育过程的表达谱类似。我们也检测了铜离子损伤毛细胞后atoh1a的表达图式，发现atoh1a在铜离子处理前后并没有显著变化。这也暗示着再生早期的程序与毛细胞死亡的方式密切相关。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。