本发明涉及一种高通量测序标签的应用和文库构建的方法，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：高通量测序(high-throughputsequencing，又称为下一代测序，nextgenerationsequencing,ngs)是在一次实验中同时进行数亿计的dna分子序列测序的功能强大的实验技术。以人类基因组重新测序为例，在得到人类基因组蓝图后，要想知道某个人基因组和人类基因组蓝图的差异，即其自身特异的基因特征，就需要对某个人的基因组进行重新测序。然后，人类基因组包含约30亿个碱基对(basepair，bp)，传统测序方法，每个反应仅能测约1000个碱基对，需要300万个反应才能够完成一个人的基因组重测序，在工作量和成本上都是难以想象的。使用高通量测序技术，在一次实验中即可以完成数百万个dna分子的测序，从而实现了在一个反应中，完成人类基因组重新测序，同时大大降低了测序成本。以人类基因组重新测序为例，常规的高通量测序过程包含：基因组dna提取，dna片段化处理，dna碎片末端补平和磷酸化修饰，将高通量测序仪能够识别的接头序列链接至修复好的dna碎片上，产物纯化，pcr扩增，产物纯化，质检，上机进行高通量测序。pcr扩增后得到的测序文库，其中含有众多的测序片段。pcr扩增和测序的过程中，准确性都不是100％，从而会引入一定比例的错误，后续的测序结果数据分析过程，能够一定程度上降低错误发生的概率。其方法是：首先，将两端的序列一致的测序片段(称为冗余序列)合并成一个测序片段(去冗余)；其次，用在基因组上有交集的不同测序片段相互比对，当某个位置的某个变异次数超过阈值时，判读此位置存在变异。当测序深度超过5000层时，会有大量冗余序列。此外，冗余序列中的错误次数也会增多。冗余序列合并时，当某个位置的错误变异比例超过阈值时，合并后的测序片段也带有错误。冗余序列被认为来自于同一个dna分子，由pcr扩增生成的不同测序片段。然而，在超深度测序过程中，冗余序列也并不一定来源于同一个dna分子。如果能够区分冗余序列是否来源于同一个dna分子，可以仅将同一来源分子进行去冗余操作，然后再通过基因组同一区域中不同测序片段进行相互比对，去除测序错误。然而，现有技术方案无法有效地判断冗余序列中分子的来源，从而无法实现上述功能。因此，提供一种高通量测序标签的应用和文库构建的方法，从多种途径区分位于基因组同一位置的不同dna来源的测序片段，在不增加实验复杂程度和成本的情况下，有效去除测序片段中的测序错误，提高测序的特异性，从而提高测序灵敏性；就成为该
技术领域：
急需解决的技术难题。技术实现要素：本发明的目的之一是提供一种用于高通量测序标签的应用和文库构建的接头序列。本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：方案1：一种用于高通量测序标签的应用和文库构建的接头序列，包括如下：接头序列1：5’acactctttccctacacgacgctcttccgatct3’；见序列表1；接头序列2(含有标记核酸的标签)：5’p-gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac【u7标签】atctcgtatgccgtcttctgcttg3’。优选地，所述u7标签是长度为4-15bp的随机核酸序列。优选地，在同一样本中，所述带有u7标签序列的接头的种类不少于24种：cgtgat，acatcg，gcctaa，tggtca，cactgt，attggc，gatctg，tcaagt，ctgatc，aagcta，gtagcc，tacaag，agtcaa，ggaact，tgacat，ggacgg，gcggac，tttcac，ggccac，cgaaac，cgtacg，ccactc，atcagt，attcct；见序列表1。序列表1优选地，所述接头序列1的3’端序列和接头序列2的5’端序列反意互补。优选地，所述接头序列1的5’端序列和接头序列2的3’端序列不反意互补。优选地，所述接头序列通过连接酶与待测核酸分子相结合。方案2：一种用于高通量测序标签的应用和文库构建的接头序列，包括如下：接头序列3(含有标记核酸的标签)：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac【u5标签】acactctttccctacacgacgctcttccgatct3’；接头序列4：5’p-gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac3’；见序列表2。优选地，所述u5标签是长度为4-15bp的随机核酸序列。优选地，在同一样本中，所述带有u5标签序列的接头的种类不少于24种：cgtgat，acatcg，gcctaa，tggtca，cactgt，attggc，gatctg，tcaagt，ctgatc，aagcta，gtagcc，tacaag，agtcaa，ggaact，tgacat，ggacgg，gcggac，tttcac，ggccac，cgaaac，cgtacg，ccactc，atcagt，attcct；见序列表2：序列表2优选地，所述接头序列3的3’端序列和接头序列4的5’端序列反意互补。优选地，所述接头序列3的5’端序列和接头序列4的3’端序列不反意互补。优选地，所述接头序列通过连接酶与待测核酸分子相结合。本发明的另一目的是提供一种含有区分样本的核酸标签的引物序列，用于扩增连接有标记核酸的标签的接头的核酸。本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：方案1：一种用于高通量测序标签的应用和文库构建的引物序列，如下：引物序列1：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac【s5标签】acactctttccctacacg3’；见序列表3；引物序列2：5’caagcagaagacggcatacgagat3’；见序列表3。序列表3优选地，所述s5标签是长度为4-15bp的随机核酸序列。优选地，s5标签用于区分样本，在同一个样本中，s5标签的序列一致，在不同样本中，s5标签的序列不同。优选地，不需要区分样本时，区分样本的标签可以省去。优选地，所述用于区分样本的标签位于pcr引物上。方案2：一种用于高通量测序标签的应用和文库构建的引物序列，如下：引物序列3：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac3’；见序列表4；引物序列4：5’caagcagaagacggcatacgagat【s7标签】gtgactggagttcagacg3’；见序列表4。序列表4优选地，所述s7标签是长度为4-15bp的随机核酸序列。优选地，s7标签用于区分样本，在同一个样本中，s7标签的序列一致，在不同样本中，s7标签的序列不同。优选地，s5标签和上述u7标签可以联合使用，s7标签和上述u5标签可以联合使用，s5标签和u5标签不可以联合使用；s7标签和u7标签不可以联合使用。优选地，不需要区分样本时，区分样本的标签可以省去。优选地，所述用于区分样本的标签位于pcr引物上。本发明的另一目的是提供一种高通量测序标签的应用和文库构建的方法，从多种途径区分位于基因组同一位置的不同dna来源的测序片段，在不增加实验复杂程度和成本的情况下，有效去除测序片段中的测序错误，提高测序的特异性，从而提高测序灵敏性。本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：一种高通量测序标签的应用和文库构建的方法，其步骤如下：(1)、dna片段化处理某些从样本中提取的dna是长片段(例如gdna)，可以通过物理超声破碎或酶处理的方式将dna打断至所需的片段大小，并进行片段筛选(通常是200-500bp)；当提取的dna是短片段时(例如游离dna，cell-freedna,cfdna)，则不需要进行dna片段化处理；(2)、片段化dna末端修复将片段化的dna修复成平末端，5’端磷酸化修饰，3’端链接上腺苷酸，以满足连接接头序列的需要；(3)、加接头将带有标记核酸标签的接头与完成末端修复的片段化dna相连接；(4)、纯化：去除多余的接头序列；(5)、pcr扩增：使用与接头序列相应的引物，进行pcr，扩增文库；根据是否需要区分样本，引物可以携带区分样本的标签；(6)、纯化：去除多余的引物序列；(7)、测序；依据illumina(依诺米那)测序仪的要求，进行高通量测序。优选地，所述步骤(6)或(7)之后，增加如下步骤，进行分析：(8)、分析：(8.1)根据样本标签和核酸标记标签，拆分出不同样本的数据；(8.2)按照常规的分析流程完成测序结果判读；(8.3)将拆分后的数据中，位于基因组同一位置的测序片段标记为冗余序列，去除冗余序列条数低于2-5个的冗余序列；(8.4)将保留下来的冗余序列合并成一条序列，将冗余序列上各个位置上超过80-95％的序列为合并后序列的序列；(8.5)将含有相同样本标签，不同核酸标签的拆分数据中的合并后序列合并，按照常规的分析流程完成最终测序结果判读。优选地，所述步骤(3)中所述加接头具体如下：在一个样本中，使用含有多个核酸标记标签的接头序列，通过核酸标记标签随机标记片段化dna分子，将位于基因组同一位置的不同片段化dna分子带上含有不同核酸标记标签序列的接头分子。优选地，所述步骤(3)中所述加接头具体如下：在一个样本中，使用含有多个核酸标记标签的接头序列，但是只含有一个样本标记标签的接头序列；在不同样本中，本标记标签的序列不同。优选地，所述步骤(3)中所述接头，包括如下：接头序列1：5’acactctttccctacacgacgctcttccgatct3’；接头序列2(含有标记核酸的标签):5’p-gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac【u7标签】atctcgtatgccgtcttctgcttg3’。或者：接头序列3(含有标记核酸的标签)：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac【u5标签】acactctttccctacacgacgctcttccgatct3’；接头序列4：5’p-gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac3’。优选地，所述步骤(5)中所述引物序列，如下：引物序列1：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac【s5标签】acactctttccctacacg3’；引物序列2：5’caagcagaagacggcatacgagat3’。或者：引物序列3：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac3’；引物序列4：5’caagcagaagacggcatacgagat【s7标签】gtgactggagttcagacg3’。有益效果：本发明的含有用于标记核酸分子的随机核酸标签的高通量测序文库的构建方法，通过改进现有技术的实验和分析流程，从多种途径区分位于基因组同一位置的不同dna来源的测序片段，在不增加实验复杂程度和成本的情况下，解决上述问题。下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步阐述本发明，但这些实施例仅限于说明本发明而不限制本发明的范围。附图说明图1为本发明实施例1中电泳检测和结果。图2-1为常规的高通量测序文库结构，含有区分样本的s5标签和s7标签。图2-2为常规的高通量测序文库结构，仅有区分样本的s7标签。图3-1为本发明的高通量测序文库结构，含有区分核酸的u7标签和区分样本的s5标签。图3-2为本发明的高通量测序文库结构，含有区分核酸的u5标签和区分核酸的u7标签。具体实施方式以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。以下实施例中所用材料、试剂等如无特别说明均可从商业途径得到。实施例11.dna提取1.1ffpe蜡片1.1.1将8-10片，5-10μm厚的蜡片，放入2ml离心管中；1.1.2加入1ml二甲苯，螺旋震荡，10秒；室温，全速离心，2分钟，弃上清；1.1.3加入1ml100％乙醇，螺旋震荡，10秒；室温，全速离心，2分钟，弃上清；1.1.4开盖，室温静置10分钟，待乙醇挥发尽；1.1.5加入180μl缓冲液atl和20μl蛋白酶k，螺旋震荡，10秒，56℃反应，1小时；1.1.690℃反应，1小时；1.1.7瞬时离心；加入200μl缓冲液al，螺旋震荡，10秒；加入200μl的100％的乙醇，螺旋震荡，10秒；1.1.8瞬时离心；将全部液体加入qiagenminelute(凯杰公司)柱中，6000×g离心，1分钟，弃离心液；1.1.9在柱上加入500μl缓冲液aw1，6000×g离心，1分钟，弃离心液；1.1.10在柱上加入500μl缓冲液aw2，6000×g离心，1分钟，弃离心液；1.1.11全速离心，3分钟，干燥柱；1.1.12将柱放入新的离心管中，加入20-100μl缓冲液ate，室温静置，1分钟；全速离心，1分钟，收集离心液；1.2组织1.2.2将不超过15mg的新鲜或者冷冻组织，切成小块(或者液氮冷冻后研磨)后，放入1.5ml离心管中；1.2.3加入180μl缓冲液atl，加入20μl蛋白酶k，螺旋震荡，10秒，56℃反应，3-6小时；1.2.4螺旋震荡，15秒；加入200μl缓冲液al，螺旋震荡，10秒；加入200μl的100％乙醇，螺旋震荡，10秒；1.2.5将全部液体加入qiagendneasymini柱中，6000×g离心，1分钟，弃离心液；1.2.6在柱上加入500μl缓冲液aw1，6000×g离心，1分钟，弃离心液；1.2.7在柱上加入500μl缓冲液aw2，6000×g离心，1分钟，弃离心液；1.2.8全速离心，3分钟，干燥柱；1.2.9将柱放入新的离心管中，加入20-100μl缓冲液ae，室温静置，1分钟；全速离心，1分钟，收集离心液；2.dna片段化2.1按照下表1内容配置反应体系；表1项目体积(μl)dna(5ng-3μg)不超过1610x缓冲液2h2o至182.2按照下表2内容，在pcr仪上进行反应；表2温度时间37℃30min4℃hold2.3磁珠纯化：在2.0ml离心管中，加入16μl磁珠、反应后的产物，混匀，室温静置15分钟，弃上清；200μl80％乙醇(新鲜配置)洗涤2次，弃上清；室温静置5分钟，待乙醇挥发；用25μlpcr级水洗脱，保存于0.5ml薄壁管；3.末端修复3.1按照下表3内容配置反应体系；表3项目体积(μl)片段化dna25末端修复缓冲液3.5末端修复酶1.53.2按照下表4内容，pcr仪上进行反应；表4温度时间20℃30min65℃30min4℃hold4.连接接头和纯化4.1按照下表5内容配置反应体系；表54.2按照下表6内容，在pcr仪上进行反应；表6温度时间20℃15min4℃hold4.3接头序列：接头序列1：5’acactctttccctacacgacgctcttccgatct3’；接头序列2(含有标记核酸的标签):5’p-gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac【u7标签】atctcgtatgccgtcttctgcttg3’。所述u7标签是长度为4-15bp的随机核酸序列，在同一样本中，所述带有u7标签序列的接头的种类不少于24种：例如：cgtgat，acatcg，gcctaa，tggtca，cactgt，attggc，gatctg，tcaagt，ctgatc，aagcta，gtagcc，tacaag，agtcaa，ggaact，tgacat，ggacgg，gcggac，tttcac，ggccac，cgaaac，cgtacg，ccactc，atcagt，attcct。接头序列1的3’端序列和接头序列2的5’端序列反意互补。接头序列1的5’端序列和接头序列2的3’端序列不反意互补。接头序列通过连接酶与待测核酸分子相结合。4.4磁珠纯化：在2.0ml离心管中，加入44μl磁珠、反应后的产物，混匀，室温静置15分钟，弃上清；200μl的80％的乙醇(新鲜配置)洗涤2次，弃上清；室温静置5分钟，待乙醇挥发；用25μlpcr级水，洗脱，保存于0.5ml薄壁管；5.预文库制备5.1按照下表7内容配置反应体系；表75.2按照下表8内容，pcr仪上进行反应；表85.3引物序列如下：引物序列1：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac【s5标签】acactctttccctacacg3’；引物序列2：5’caagcagaagacggcatacgagat3’；所述s5标签是长度为4-15bp的随机核酸序列；不同样本使用不同的s5标签；例如：cgtgat，acatcg，gcctaa，tggtca，cactgt，attggc，gatctg，tcaagt，ctgatc，aagcta，gtagcc，tacaag，agtcaa，ggaact，tgacat，ggacgg，gcggac，tttcac，ggccac，cgaaac，cgtacg，ccactc，atcagt，attcct。5.4磁珠纯化：在2.0ml离心管中，加入55μl磁珠、反应后的产物，混匀，室温静置15分钟，弃上清；200μl80％乙醇(新鲜配置)洗涤2次，弃上清；室温静置5分钟，待乙醇挥发；用40μlpcr级水，洗脱，保存于0.5ml薄壁管；取4μl经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1所示，从左往右的四个泳道中，分别是：dnamarker，片段化的野生型基因组dna为样本的文库，片段化的含有1％egfrc.2369c>t(t790m)基因组dna为样本的文库，血浆游离dna为样本的文库。6.捕获(可选；如果是针对基因组部分区域，则需要进行目标区域捕获，否则不需)6.1在40μl纯化产物中，加入11μl的hybblock，真空离心干燥去除水分，加入10μl的pcr级水，溶解，置于冰上待用；6.2按照下表9内容，在pcr仪上进行反应：表9温度时间95℃5min65℃hold6.3配置杂交探针：在0.2ml薄壁管中，混合5μlrnaseblock(安捷伦公司)和2μl探针，螺旋震荡，瞬离，65℃反应，2分钟；6.4向有杂交探针的0.2ml薄壁管中，加入13μl、经过65℃预热的杂交缓冲液和10μl预文库，65℃反应，过夜；6.5磁珠纯化：取50μlmyonestreptavidint1dynabeads(赛默飞公司)，用200μl结合缓冲液洗涤3次；用200μl结合缓冲液悬浮磁珠，加入过夜后的杂交产物，置于螺旋混匀仪上，30分钟，室温，弃上清；加入200μl洗涤缓冲液1，悬浮磁珠，置于螺旋混匀仪上，15分钟，室温，弃上清；加入200μl的65℃预热的洗涤缓冲液2，悬浮磁珠，置于反应振荡仪上，10分钟，65℃，弃上清，共洗涤3次；200μl的80％乙醇(新鲜配置)，弃上清；用24μlpcr级水洗脱，保存于0.5ml薄壁管；7.扩增和纯化：7.1按照下表10内容配置反应体系：表10组成体积phusionmastermix(2×)25μl正向引物(25μm)0.5μl反向引物(25μm)0.5μl纯化产物24μl7.2引物序列如下序列表5：序列表5正向引物5‘aatgatacggcgaccaccgagatctacac3‘反向引物5‘caagcagaagacggcatacgagat3‘7.3按照下表11内容，在pcr仪上进行反应；表117.4磁珠纯化：在2.0ml离心管中，加入55μl磁珠、反应后的产物，混匀，室温静置15分钟，弃上清；200μl的80％乙醇(新鲜配置)洗涤2次，弃上清；室温静置5分钟，待乙醇挥发；用20μlpcr级水洗脱，保存于0.5ml薄壁管；8.测序：取3μl纯化产物，用测序杂交缓冲液稀释至10nm；加入1μl的2n浓度的naoh，进行变性；加入杂交缓冲液，至20μl；取6μl变性文库，加入1494μl杂交缓冲液；取1400μl稀释后的变性文库，加入测序仪测序试剂板的10号孔中，进行测序；9.数据分析：9.1根据index，将所有测序片段拆分，将相同index的测序片段放置于一起进行后续分析；9.2计算所有测序片段每个位置碱基的平均phred值，去除phred值低于20的碱基；9.3将测序片段与人类基因组参考序列hg19比对，取唯一匹配片段，确定片段在基因组上的起始和终止位置；9.4将同时具有相同起始和终止的片段标记为冗余片段；9.5去除冗余的片段低于2-5条的融合片段；9.6将冗余片段合并成单条测序片段，单条片段上每个位置的碱基序列，为冗余片段中一致性超过90-100％的碱基；9.7根据单条测序片段，计算基因组的覆盖度；9.8将同一样本不同index的结果合并，得到最终结果；10.结果：将通过基因编辑引入egfrc.2369c>t(t790m)dna突变的细胞的基因组dna和野生型细胞基因组dna配比，得到突变频率为1％的样本，并通过数字pcr的方法验证突变频率后，通过本方法检测突变，验证结果如表12所示：表12通过本方法，检查了野生型dna和egfrc2369c>t(t790m)突变频率为1％的dna。在去除冗余片段后，本方法对野生型dna样本egfrc.2369位点测序深度达到982层，未检测到c>t的突变；对于经过数字pcr验证的含有1％c>t的dna样本，本方法测序深度达到了464层，共检测到5次c>t突变，检测到的突变频率为1.8％。如图3-1所示，为本发明的高通量测序文库结构，含有区分核酸的u7标签和区分样本的s5标签，如图3-1所示，为本发明的高通量测序文库结构，含有区分核酸的u5标签和区分核酸的u7标签。实施例2(血浆)1.血浆分离1.1取10ml抗凝外周血，4℃，1,600xg，离心10分钟；1.2将上层血浆，转移至2支2.0ml离心管；4℃，16,000xg，离心10分钟；1.3将上层血浆，转移至2支2.0ml离心管；2.dna提取2.1使用约2ml血浆；2.2按照下表内容配置反应体系，60℃水浴，20分钟：表13试剂体积(μl)proteinasek,20mg/ml10血浆50020％sds*252.3按照下表内容配置反应体系，加入上述产物中：表14试剂体积(μl)结合缓冲液630磁珠102.4螺旋震荡，20秒；震荡混匀，10分钟；2.5瞬时离心，置于磁力架，5分钟，弃上清；2.6加500μl洗涤缓冲液，洗涤，弃上清；2.7加500μl80％乙醇，洗涤，弃上清，2次，静置10分钟，待乙醇挥发尽；2.8加15μlpcr级水洗脱；3.末端修复(同实施例1)4.连接接头和纯化(除了接头序列如下，其余同实施例1)其中接头序列为：接头序列3(含有标记核酸的标签)：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac【u5标签】acactctttccctacacgacgctcttccgatct3’；接头序列4：5’p-gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac3’。u5标签是长度为4-15bp的随机核酸序列。在同一样本中，所述带有u5标签序列的接头的种类不少于24种。例如：cgtgat，acatcg，gcctaa，tggtca，cactgt，attggc，gatctg，tcaagt，ctgatc，aagcta，gtagcc，tacaag，agtcaa，ggaact，tgacat，ggacgg，gcggac，tttcac，ggccac，cgaaac，cgtacg，ccactc，atcagt，attcct。接头序列3的3’端序列和接头序列4的5’端序列反意互补。接头序列3的5’端序列和接头序列4的3’端序列不反意互补。接头序列通过连接酶与待测核酸分子相结合。5.预文库制备(除了引物序列，其余同实施例1)引物序列3：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac3’；引物序列4：5’caagcagaagacggcatacgagat【s7标签】gtgactggagttcagacg3’。s7标签是长度为4-15bp的随机核酸序列。每个样本使用不同的s7序列。所述带有s7标签序列的接头的种类不少于24种：例如：cgtgat，acatcg，gcctaa，tggtca，cactgt，attggc，gatctg，tcaagt，ctgatc，aagcta，gtagcc，tacaag，agtcaa，ggaact，tgacat，ggacgg，gcggac，tttcac，ggccac，cgaaac，cgtacg，ccactc，atcagt，attcct。取4μl经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1所示，其中，第四泳道是本实施例的测试结果。6.捕获(可选；如果是针对基因组部分区域，则需要进行目标区域捕获，否则不需)(同实施例1)；7.扩增和纯化(同实施例1)；8.测序(同实施例1)；9.数据分析(同实施例1)；10.结果：肺癌患者血浆游离dna样本，通过数字pcr的方法验证突变频率后，通过本方法检测突变，验证检测的性能如下表15：表15通过本方法，检查了经过数字pcr验证的野生型dna(0.4个突变拷贝和8448个野生型拷贝)和egfrc2369c>t(t790m)突变频率为0.1％(9个突变拷贝和8096个野生型拷贝)的dna。在去除冗余片段后，本方法对野生型dna样本egfrc.2369位点测序深度达到2390层，未检测到c>t的突变；对于经过数字pcr验证的含有0.1％c>t的dna样本，本方法测序深度达到了1664层，共检测到2次c>t突变，检测到的突变频率为0.12％。序列表<110>古博<120>一种高通量测序标签的应用和文库构建的方法<160>102<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>33<212>dna<213>接头序列1()<400>1acactctttccctacacgacgctcttccgatct33<210>2<211>63<212>dna<213>接头序列2-1()<400>2gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcaccgtgatatctcgtatgccgtcttctgc60ttg63<210>3<211>63<212>dna<213>接头序列2-2()<400>3gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacacatcgatctcgtatgccgtcttctgc60ttg63<210>4<211>63<212>dna<213>接头序列2-3()<400>4gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacgcctaaatctcgtatgccgtcttctgc60ttg63<210>5<211>63<212>dna<213>接头序列2-4()<400>5gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcactggtcaatctcgtatgccgtcttctgc60ttg63<210>6<211>63<212>dna<21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