本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种新型恒温链置换扩增技术及试剂盒。
背景技术：
现代分子诊断学产业价值200亿英镑，并且以每年20％的速度增长。核酸扩增技术是分子生物学领域的一项重要的研究手段。pcr(聚合酶链式反应，science，230，1350-1354，1985)是体外扩增核酸序列最普遍的技术方法，在此基础上分为变温扩增技术以及等温扩增技术两大类。目前变温扩增技术主要包括普通pcr、巢式pcr、多重pcr、实时荧光定量pcr等。这些技术在临床医学，检验医学，基因组学的检测和动植物检疫中发挥着重要的作用。由于核酸的变温扩增技术需要精密复杂的变温分析仪器，对操作人员的专业水平要求比较高且操作过程较繁琐，检测耗时长而不利于在基层推广。而现代医学需要对病原微生物进行快速、准确、及早的检测并确诊。因此建立一种快速、准确、灵敏、操作简便的新型的等温扩增技术对于病原体的检测显得尤为重要。等温扩增成为核酸扩增技术的一个研究热点。
sda是一种基于酶促反应的dna体外等温扩增技术(walkergt,fraiserms,schramjletal.nucleicacidsres,1992；20(7):1691-6)。其基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的dna聚合酶、两对引物、dntp以及钙、镁离子和缓冲系统。其基本过程包括准备单链dna模板、生成两端带酶切位点的目的dna片段、sda循环三个阶段。sda中所用核酸内切酶的切割位点需专一，对识别位点的化学修饰敏感且在打开缺口后能立即解离让位于dna聚合酶，所用dna聚合酶有链置换活性，但没有核酸外切酶活性(如cxo-klenow)。因为3'→5'外切酶活性会使引物单链在反应中降解；5'→3'外切酶活性会使引物-靶序列杂交体中的5'悬端水解。dna聚合酶需满足如下条件才能用于sda反应：无外切核酸酶活性；于缺口处启动反应；可利用dntpas；具有链置换活性，以便提高sda反应的温度以缩短反应时间、提高反应效率和提高sda的特异性。与其它的dna扩增技术相比，sda有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。sda的不足之处1)产物不均一，由于在sda循环中必然产生一些不同的dna，目前的技术不可能根本消除。2)sda由于反应原理和反应体系的复杂性，在没有模板存在的情况下，也会产生扩增信号，因此它的特异性不高。3)传统的sda所用的内切酶需要在模板dna上有匹配的酶切位点，因此它的灵敏度难以达到临床检测要求4)目前sda产物的主导方法是荧光偏振检测法。但该检测方法需要特殊仪器——荧光分光光度计。5)sda可能因标本中含有不明抑制物，使检测不能反映标本中靶dna的真实含量。复合dna中高含量靶dna对低含量靶dna的竟争抑制现象也很常见。以上的这些不足限制了sda在临床的广泛应用.
技术实现要素：
为了解决现有核酸等温扩增的技术缺陷，本发明的一个目的是提供一种新型恒温链置换扩增技术。更具体的目的是提供一种在等温条件下高效扩增核酸的低成本的方法，该方法可实现无需核酸抽提即可特异高效扩增。本发明的试剂盒和检测方法，可同时检测至少2种以上的病原体，具有简便、灵敏、快速、特异性好的特点，可广泛用于临床医学、法医学、动植物检疫等领域。
本发明原理：
本发明利用含有与靶序列互补的rna序列的引物序列用于靶dna序列的扩增，产生含核糖核酸内切酶识別位点的靶dna和rna结合序列，能够被耐热核糖核酸内切酶水解切割识别位点，形成粘性末端，引物与粘性末端连接，在链置换dna聚合酶作用下延伸3′端，并替代另一条dna链，被置换链与引物杂交后又依次成为另一扩增反应的靶源，依赖链置换dna聚合酶在切割处延伸3’端，并替代另一条dna链；被置换链与引物杂交后又依次成为另一扩增反应的靶源，这些步骤在反应体系中不断重复，使靶dna序列呈指数性增长。
本发明具体技术方案如下：
一种恒温链置换扩增技术，包括准备单链dna模板、生成3'端带酶切位点的目的dna片段、sda循环三个阶段，使用一对与dna模板3’-末端序列互补的引物用于dna模板扩增，引物中含有与靶序列互补的rna序列，引物的5’端为与靶序列互补的dna序列，所述引物使扩增产物带有3’端酶切位点，能够被核糖核酸内切酶识别和水解切割，并依赖链置换dna聚合酶在切割处延伸3′端，并替代另一条dna链，被置换链与引物杂交后又依次做为另一扩增反应的靶源，这些步骤在反应体系中不断重复，使靶dna序列呈指数性增长。
进一步的，所述引物的5’端和3’端是与靶序列互补的dna序列，中部为与靶序列互补的rna序列。
优选的，所述引物5’端与靶序列互补的dna序列的长度为8-10bp，3’端与靶序列互补的dna序列的长度为3-5bp，中部与靶序列互补的rna序列的长度为5-7bp。
本发明所述的扩增技术，所述核糖核酸内切酶优选为rnaseh。所述dna聚合酶优选为bstdnapolymerase。
本发明所述恒温链置换扩增技术可在55-64℃恒温下反应。
本发明所述恒温链置换扩增技术的一个具体方案如下：
(1)单链dna模板的制备：将靶dna序列在一定温度下经过热变性形成单链模板t1/t1’；(2)酶切-链置换等温扩增：
a.根据靶序列设计一对与靶序列3’-末端序列完全互补的引物，所述引物的5’端和3’端是与靶序列互补的dna序列，中部为与靶序列互补的rna序列；
b.引物对与单链模板t1/t1’杂交并在链置换dna聚合酶作用下进行延伸形成双链产物，产物的一条链为模板链，一条链为与其互补的带核糖核酸內切酶识別位点的复制链，核糖核酸內切酶识别复制链上相应的识别位点并进行水解切割，形成粘性末端，引物与模板链的5’端互补，引物与粘性末端连接，并在链置换dna聚合酶作用下进行扩增形成双链产物，同时置换出链t2/t2’；
c.引物以链t2/t2’为模板，与其5’端互补并在链置换dna聚合酶作用下延伸形成双链产物；产物的一条链为模板链t2/t2’，一条链为与其互补的带核糖核酸内切酶识別位点的复制链，核糖核酸內切酶识别复制链上相应的识别位点并进行水解切割，形成粘性末端，引物与模板链t2/t2’的5’端互补，引物与粘性末端连接,并在链置换dna聚合酶作用下进行扩增形成双链产物，同时置换出链t3/t3’；
(4)sda循环：
引物分别以t2/t2’和t3/t3’为模板，实现延伸—酶切—链置换循环，使靶dna序列呈指数性增长；
(5)待反应体系里的dntp和/或酶消耗殆尽反应终止。
本发明的另一目的在于提供一种基于本发明所述恒温链置换扩增技术的试剂盒，核糖核酸内切酶、链置换dna聚合酶、荧光染料、至少一个引物对、dntp以及钙、镁离子和缓冲系统，所述引物中含有与靶序列互补的rna序列，所述引物的5’端为与靶序列互补的dna序列，所述引物使扩增产物带有3'端酶切位点，能够被核糖核酸内切酶识别和水解切割。所述核糖核酸内切酶为rnaseh。所述dna聚合酶为bstdnapolymerase。
上述荧光染料包括fam，hex等荧光染料。
进一步的，上述试剂盒中所述引物对和荧光染料的数量可以为多种，可用于同时扩增多个靶基因序列。
本发明优点：
1，避免了以往sda产物的长短不一及非特异性扩增。
2，反应体系在55-64℃进行，使扩增产物特异性明显增加。
3，使用核糖核酸内切酶，只有rna与dna结合位置可以被水解切割并形成粘性末端，进一步增加了扩增产物的特异性。
4，本发明产物的检测主导方法是实时荧光定量检测法。该检测方法只需要普通的荧光pcr仪器，可在临床的广泛应用。
5，本发明可检测低限为数个基因拷贝数的dna，极少量dna检出对界定疾病状态或揭示是否有病原体存在具有重大意义。
本发明简便、灵敏、快速、特异性好，可检测低限为数个基因拷贝数的dna，解决了现有技术下核酸等温扩增的技术缺陷，可广泛用于临床医学、法医学、动植物检疫等领域。
附图说明
图1为使用本发明所述恒温链置换扩增技术对人乳头状瘤病毒18亚型的扩增，并使用荧光染料对其进行荧光定量的检测结果。
图2为使用本发明所述恒温链置换扩增技术对人乳头状瘤病毒18亚型的扩增，并使用荧光探针对其进行荧光定量的检测结果。
图3为使用本发明所述恒温链置换扩增技术对人乳头状瘤病毒16亚型和18亚型同时扩增，并使用荧光探针对其进行荧光定量的检测结果。
图4为本发明所述恒温链置换扩增技术流程步骤图。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
本发明所述恒温链置换扩增技术流程步骤如图4所示。图中各步骤说明如下：
1.单链dna模板生成；
2.依赖链置换dna聚合酶，引物延伸生成和靶dna和rna结合序列互补的dna片段(含核糖核酸内切酶识別位点)；
3.核糖核酸内切酶识別位点被耐等温的核糖核酸内切酶识别；
4.核糖核酸内切酶识别复制链上相应的识别位点并进行水解切割，同时消化切下的片段。复制链上形成粘性末端,。
5.引物与模板链互补并粘连，在链置换dna聚合酶作用下进行链置换，形成双链产物。
6.被置换链形成新的dna模版链t2/t2’，引物和新的dna模版链结合，进入sda循环。
7.依赖链置换dna聚合酶作用引物延伸生成和靶dna和rna结合序列互补的dna片段(含核糖核酸内切酶识別位点)
8.核糖核酸内切酶识别复制链上相应的识别位点并进行水解切割，同时消化切下的片段。
复制链上形成粘性末端,。
9.引物与模板链互补并粘连，在链置换dna聚合酶作用下进行链置换，形成双链产物。
10.链置换同时形成新的dna模版链t3/t3’，进入sda循环。
实施例1人乳头状瘤病毒18亚型的扩增
以人乳头状瘤病毒18亚型为例，使用本发明所述恒温链置换扩增技术对其进行扩增。
hpv18dnafragment(质粒序列)：
5’-aatatgggaacacaggtacgtgggaagtacattttgggaataatgtaattgattgtaatgactctatgtgcagtaccagtgacgacacggtatccgctactcagcttgttaaacagctacagcacaccccctcaccgtattccagcaccgtgtccgtgggcaccgcaaagacctacggccagacgtcggctgctacacgacctggacactgtggactcgcggagaagcagcattgtggacctgtcaacccacttctcggtgcagctacacctacaggcaacaacaaaagacggaaactctgtagtggtaacactacgcctataatacatttaaaaggtgacaga-3’(seqidno：1)
(1)引物设计：
hpv18正义引物：5’-agctacagcarcrarcrcrcrcrcrtrcraccgtattcca-3’(seqidno：2)；
hpv18反义引物：5’-gcgagtccacrargrtrgrtrcrcrargrgtcgtgtagca-3’(seqidno：3)
上述引物5’末端的第10-19位的脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代。
(2)将上述含有核糖核酸内切酶识别位点的正义引物及反义引物用于实时等温扩增反应。扩增反应液的体积是25μl，扩增反应液包括，20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，4mmmgso4，0.1％tritonx-100，0.4mmdntp，0.2m甜菜碱，1xsybrgreendye，1.6μmhpv18正义引物，1.6μmhpv18反义引物，2μl包含有链置换聚合酶bstdnapolymerase(cat#m0537s,neb)和核糖核酸内切酶rnaseh(ca#m0297s)的混合液以及20，000拷贝非变性的含有人乳头状瘤病毒18亚型序列的重组质粒，反应在62℃进行，反应时间60分钟，每60秒在bio-radcfx96实时荧光定量pcr仪上测定sybr绿色荧光信号，本实例说明所用引物可以有效扩增目标dna，并得到实时指数扩增的荧光信号。结果如图1所示。
实施例2加入特殊荧光探针的人乳头状瘤病毒18亚型的扩增
(1)引物设计：
hpv18正义引物：5’-agctacagcarcrarcrcrcrcrcrtrcraccgtattcca-3’(seqidno：2)
hpv18反义引物：5’-gcgagtccacrargrtrgrtrcrcrargrgtcgtgtagca-3’(seqidno：3)
上述引物5’末端的第10-19位的脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代。hpv18探针：
5’-quencher-aagtaggtga-cgtgtccgtgggcaccgcaaagacctacg-tcacctactt-fam-3’(seqidno：4)
将上述含有核糖核酸内切酶识别位点的正义引物、反义引物及荧光探针用于实时等温扩增反应。扩增反应液的体积是25μl，扩增反应液包括：20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，4mmmgso4，0.1％tritonx-100，0.4mmdntp，0.2mbetaine，hpv18荧光fam探针，1.6μmhpv18正义引物，1.6μmhpv18反义引物，2μl包含有链置换聚合酶和核糖核酸内切酶的混合液以及20，000拷贝非变性的含有人乳头状瘤病毒18亚型序列的重组质粒，反应在62℃进行，反应时间60分钟，每60秒在bio-radcfx96pcr仪上测定fam荧光，所用引物可以有效扩增目标dna，并得到实时指数扩增的荧光信号。结果如图2所示。
实施例3一管反应中多个靶基因同时检测
以人乳头状瘤病毒18亚型和16亚型为例，使用本发明所述恒温链置换扩增技术对两者进行扩增。
hpv16dnafragment：
5’-agacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaaccataatctaccatggctgatcctgcaggtaccaatggggaagagggtacgggatgtaatggatggttttatgtagaggctgtagtggaaaaaaaaacaggggatgct-3’(seqidno：5)
(1)引物设计
hpv16正义引物:5’-ccccatctgtrtrcrtrcrargrarararccataatctac-3’(seqidno：6)hpv16反义引物:5’-ctctacataarararcrcrartrcrcrarttacatcccgt(seqidno：7)；hpv16探针：
5’-quencher-ttgatggagt-tggctgatcctgcaggtaccaatgggga-actccatcaa-hex-3’(seqidno：8)
hpv18正义引物：5’-agctacagcarcrarcrcrcrcrcrtrcraccgtattcca-3’(seqidno：2)
hpv18反义引物：5’-gcgagtccacrargrtrgrtrcrcrargrgtcgtgtagca-3’(seqidno：3)
hpv18探针：
5’-quencher-aagtaggtga-cgtgtccgtgggcaccgcaaagacctacg-tcacctactt-fam-3’(seqidno：4)
上述引物5’末端的第10-19位的脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代。将上述含有核糖核酸内切酶识别位点的hpv18正义引物和反义引物、hpv18探针、hpv16正义引物和反义引物以及hpv16探针用于实时等温扩增反应。扩增反应液的体积是25μl，扩增反应液包括：20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，4mmmgso4，0.1％tritonx-100，0.4mmdntp，0.2mbetaine，0.1umhpv18fam荧光探针，1.6μmhpv18正义引物，1.6μmhpv18反义引物，1.6μmhpv16正义引物，1.6μmhpv16反义引物，0.1μmhpv16hex荧光探针，2μl包含有链置换聚合酶和核糖核酸内切酶的混合液以及各20，000拷贝非变性的含有人乳头状瘤病毒18和16亚型序列的重组质粒，反应在62℃进行，反应时间60分钟，每60秒在bio-radcfx96pcr仪上测定fam/hex荧光，所用引物可以有效扩增目标dna，并得到实时指数扩增的荧光信号。结果如图3所示。结果表明本发明所述恒温链置换扩增技术能够同时扩增多个靶基因。
序列表
<110>贠红岩
<120>一种恒温链置换扩增技术及试剂盒
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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aatatgggaacacaggtacgtgggaagtacattttgggaataatgtaattgattgtaatg60
actctatgtgcagtaccagtgacgacacggtatccgctactcagcttgttaaacagctac120
agcacaccccctcaccgtattccagcaccgtgtccgtgggcaccgcaaagacctacggcc180
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ctgtcaacccacttctcggtgcagctacacctacaggcaacaacaaaagacggaaactct300
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