本发明属于核酸扩增技术，具体地说是通过将聚合酶链式反应(pcr)的反应液在两个温度点之间进行反复升温和降温，在变温的过程中实现对目标序列的快速扩增的一种方法。
背景技术：
聚合酶链式反应法(polymerasechainreaction，pcr)是一种分子生物学常用技术，由于其可以特异性地扩增极其微量的dna，目前已经广泛应用于临床病原微生物以及疾病的诊断、法医学鉴定、环境监督、食品药品真伪鉴定等。常规pcr技术依靠热循环仪的升降温，使模板dna序列经过高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤，完成对目标序列的一次扩增，通过20-40次的反复扩增，可以实现对微量dna的指数型扩增。分子生物学经典工具书《分子克隆实验指南》一书中指出一个典型的pcr程序通常为94℃30s、55℃30s、72℃1min，循环30次，加上升降温过程中的时间，一个典型的pcr过程需要1个小时以上。但是，随着pcr技术应用领域的不断延展，需要pcr分析的样本类型及样本量日益增多，这就对样本的分析效率和成本提出了更高的要求。因此，进一步缩短pcr扩增时间，发展快速pcr技术，对于大样本量的快速基因检测以及即时检验(point-of-caretesting)的发展都具有十分重要的意义。
目前，关于快速pcr的研究主要集中在热循环仪的改造上，以大幅提高升降温速率来实现快速的核酸扩增，通常采用的手段包括：①改变加热方式，如采用光加热、空气加热等；②采用传热更快的反应容器；③缩小反应体积等。然而，由于升降温速率大幅度提高，使得聚合酶延伸的时间缩短，并不能保证pcr具有最佳的扩增效率，从而导致了一些长片段序列的扩增失败，限制了快速pcr技术的使用。同时由于已报道的快速pcr技术均需要使用新型的pcr扩增装置以及新型的样品反应装置，实施该技术的经济成本和时间成本都较高，所以现有的快速pcr技术实质上还没有得到广泛的应用，也没有惠及到相应的行业和从业人员。
技术实现要素：
本发明的目的是针对目前快速pcr必须使用特定仪器以及特殊快速dna聚合酶的局限性，提供一种在不改变pcr体系的前提下，利用现有常规pcr仪器即可以实现的快速扩增核酸的方法。
本发明的技术方案如下：将聚合酶链式反应(pcr)的反应液在两个温度点之间进行升温和降温，在变温的过程中实现对目标序列的快速扩增。
本发明所涉及的两个温度点分别为高温点和低温点：高温点可以在目标扩增序列的退火温度(tm)到98℃之间取任意值，低温点可以在引物的退火温度附近取任意值，一般为tm±5℃。
本发明所述的快速核酸扩增方法是一种高温点和低温点不断交替往复的变温过程，且在高温点和低温点处不做时间停留，或者停留时间时间极短(0-2秒)。这一扩增模式不同于传统的pcr扩增模式：(1)三段式。设置三个温度点，使pcr反应液在每个温度点停留几十秒至几分钟不等，依次进行变性、退火、延伸三个过程，经过多个循环此种模式的扩增，实现对目标序列的快速扩增。(2)两段式。设置两个温度点，使pcr反应液在每个温度点停留几十秒至几分钟不等，依次进行变性、(退火+延伸)两个过程，经过多个循环此种模式的扩增，实现对目标序列的快速扩增。
本发明所涉及的两个温度点，在同一个反应的不同循环中，可以是不同的值，只需保证在上述高温点和低温点的可取范围内即可。
本发明所涉及的引物的退火温度可在40-80℃之间变化，最优温度在70℃附近。
本发明所涉及的pcr反应体系可以是现有的pcr反应体系，如包括反应缓冲液、dntp、嗜热dna聚合酶、引物、探针、模板、水等，无需特意添加特殊反应组分或将现有的普通反应组分更换为有特殊功能的物质。
本发明所涉及的聚合酶链式反应(pcr)中使用的引物，可以是普通pcr所使用的引物，为进一步节约时间，也可以在普通pcr所用引物的基础上适当延长，最高可使其退火温度接近70℃。退火温度的计算应充分考虑引物序列本身、引物浓度、缓冲液体系等，具体可以参照promega公司网站(http://www.promega.com/a/apps/biomath/？calc＝tm)所开发的软件进行计算。
本发明所建立的快速扩增核酸的方法可直接在现有常规pcr仪上完成，无需重新开发新的快速核酸扩增仪器。
本发明所建立的快速扩增核酸的方法，同时适用于基于dna非特异性结合染料的定量分析方法和基于荧光染料标记的序列特异性寡核苷酸引物或探针的定量分析方法，不仅可以应用于核酸的定性分析，也可以应用于核酸的定量分析。。
依据本发明所涉及的快速核酸扩增模式，可对包括real-timequantitativepcr、rt-pcr、touch-downpcr、nestpcr、asymmetricpcr、allel-specificpcr、mulitiplexpcr、digitalpcr、测序等所有以pcr为基础的相关技术的扩增模式进行调整，以实现工作效率的提高。
在pcr扩增中，仪器的升温速率会对扩增结果造成影响，过快的升温速率虽然能极限缩短反应时间，但是会导致扩增效率的下降或者非特异性扩增条带的产生。本发明对核酸进行扩增的过程中，为保证扩增效率没有损失，必要时需要根据目标扩增片段的长度对仪器的升温速率进行调整，对降温速率无要求，越快越好。具体的参数设置见图1，即当使用普通dna聚合酶时，对于长度为100-500bp的目标扩增片段，其最大升温速率分别为5.2、2.2、1.3、0.9、0.7℃/s，即在相同条件下，长片段需要的升温速率小于短片段需要的升温速率；使用kapa快速dna聚合酶时，对于长度为100-500bp的目标扩增片段，其最大升温速率分别为10.8、5.9、4.2、3.3、2.7℃/s。目前，普通pcr仪器的升降温速率都不超过2℃/s，而大部分诊断、鉴定的pcr体系中目标扩增片段通常在150bp以内，所以即使采用普通dna聚合酶，对于小于200bp的片段，都无需更改升温速率这一参数。
本发明所涉及的快速扩增核酸的方法，在不改变pcr体系、使用常规pcr仪器的前提下即可在15分钟内完成30个循环的扩增，目前最短时间为8分钟内完成25个循环，实现对lamada噬菌体上一段98bp序列的扩增。
如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。
“dna”：脱氧核糖核酸。是一类带有遗传信息的生物大分子，由4种主要的脱氧核糖核苷酸通过3′,5′-磷酸二酯键连接而成，是遗传信息的载体。
“pcr”：聚合酶链式反应。是体外酶促合成特异dna片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸三步反应组成一个周期，循环进行，使目的dna得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
“目标扩增片段/目标扩增序列”：需要扩增的核酸序列，可以是dna序列、rna序列等。
“引物”：一段短的单链rna或dna片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。“tm值”：使50％的双链dna(double-strandeddna,dsdna)解链形成无规卷曲(randomcoil)或单链dna(singlestrandeddna,ssdna)状态的温度。“dna聚合酶”：一种可以催化脱氧核苷酸合成dna分子的酶，主要用于模板dna的复制。“taqdna聚合酶”：dna聚合酶的一种。是从一种水生栖热菌(thermusaquaticus)株分离提取得到的一种dna聚合酶，该酶在pcr循环的高温条件下仍能保持较高的活性，是目前pcr体系中应用最广泛的一种dna聚合酶，其扩增速率为35-100碱基/s.
“kapa快速dna聚合酶”：dna聚合酶的一种。是一种经分子进化平台筛选出来的dna聚合酶的突变体，其特点是可以快速催化dna的合成，扩增速率可达155碱基/s。
“pcr反应液/pcr反应体系”：包括反应缓冲液、dntp、嗜热dna聚合酶、引物、探针、模板、水等进行目标核酸扩增所需的各种物质组分。
“扩增效率”：定量pcr的扩增效率是指指数扩增期的扩增效率e(％)。e(％)＝[10(-1/k)-1)，其中k为标准曲线y＝kx+b的斜率。普通pcr的扩增效率可以通过对其pcr产物的含量来进行评估，具体的可以利用凝胶定量软件将琼脂糖凝胶电泳上经过相同循环数扩增后的扩增产物条带的亮度与dna标准物质电泳条带的亮度相比较而计算得到。
本发明公开的方法关键在于在现有pcr体系、现有pcr扩增仪基础上，仅需简单改变pcr程序，使pcr反应液仅在两个温度点之间反复升温和降温，不在任何温度做时间停留，或者停留时间极短(0-2s)，在变温的过程中即可实现对目标序列快速扩增。该方法打破常规、理论新颖，操作简单、易行，依靠现有条件和平台即可大幅度节约核酸扩增的时间，提高单位时间生产力。该方法可适用于各种基于pcr技术的核酸扩增体系，对于临床疾病的检测和分析、环境监测、食品药品的物种鉴定等都有很高的实用价值。具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：
(1)新颖性。本方法首先从理论上打破了对于pcr的传统认识。按照传统pcr技术要求，pcr反应液需要在94℃停留20-30s进行双链的变性，50-60℃停留20-30s进行引物的退火，72℃几十秒到几分钟进行引物的延伸。本方法首次提出pcr的三个步骤可以在反复的升降温过程中完成，取消或极大缩短了传统pcr每个循环在各个温度点的停留时间，在不降低dna扩增效率的基础上大幅度缩短了核酸扩增的时间，也简化了pcr扩增程序。
(2)高效性。本发明所述核酸扩增方法通过调整升降温速率保证了每个循环的扩增效率，不因降低扩增时间而牺牲每个循环的扩增效率，所以可以适用于定量核酸的检测，也具有更高的可靠性。同时，由于取消了传统pcr每个循环在各个温度点的停留时间，大幅度缩短了核酸扩增的时间，具有省时高效的特点。
实用性。目前已发展的快速pcr方法均依靠新型仪器的使用才能实现缩短扩增时间的目的，相比于这些方法而言，本发明方法无需改变pcr反应体系中的组成，无需购置新型pcr热循环仪器，在现有体系、现有平台基础上就能直接将扩增时间缩短为传统pcr的三分之一甚至更短，具有高度的实用性。
附图说明
附图1使用普通taqdna聚合酶和kapa快速dna聚合酶时不同长度片段模板的最佳升温速率。
附图2是利用本发明的快速扩增核酸的方法与普通pcr法同时对lamda噬菌体上一段98bp的序列进行扩增的结果。其中泳道1表示普通pcr的阴性对照(以水为模板)，泳道2表示普通pcr扩增结果，泳道3表示快速扩增核酸方法的阴性对照(以水为模板)，泳道4表示快速扩增核酸方法的扩增结果。
附图3是本发明的快速扩增核酸的方法与普通pcr法同时对lamda噬菌体上一段98bp的序列进行扩增的实时监测结果。实线为快速扩增实时荧光扩增曲线，到达荧光检测的时间为15分钟，虚线是普通pcr实时荧光扩增曲线，到达荧光检测的时间为45分钟。
附图4是利用本发明的快速扩增核酸的方法对不同来源(包括质粒、病毒、细菌、植物、动物)的dna进行扩增的结果。其中泳道1为质粒，泳道2为病毒，泳道3为细菌，泳道4为植物，泳道5为动物的扩增结果。
附图5是本发明的实时荧光快速核酸扩增方法(染料法)和普通实时荧光pcr法(染料法)对dna进行定量分析的荧光扩增曲线和标准曲线，模板浓度从左到右依次为5×105-5×101个拷贝。
附图6是本发明的实时荧光快速核酸扩增方法(探针法)和普通实时荧光pcr法(探针法)对dna进行定量分析的荧光扩增曲线和标准曲线，模板浓度从左到右依次为1.59×100-1.59×10-4ng/ul。
具体实施方式
下面结合附图，通过实例进一步说明本发明。本领域的技术人员应理解，这些实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1、快速扩增核酸方法与普通pcr方法的结果比较(终点法)。
1.正反引物、目标扩增序列
正向引物la：5’-catcgtctgcctgtcat-3’
反向引物lra：5’-tcgccagcttcagtt-3’
目标扩增序列lt:5’-catcgtctgcctgtcatgggctgttaatcattaccgtgataacgccattacctacaaagcccagcgcgacaaaaatgccagagaactgaagctggcga-3’
2.扩增反应体系(快速扩增反应体系与普通pcr体系相同)
3.快速扩增反应条件：94℃0秒，60℃0秒，循环30次。(耗时16min51s)
普通pcr反应条件：95℃3分钟；94℃30秒，60℃30秒，循环30次。(耗时66min)
4.扩增产物分析：
取5μl扩增后的样品，与1μl6倍dna上样缓冲液混合，在含有gelview核酸染料的琼脂糖胶上进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如附图2普通pcr与快速扩增核酸方法的阴性对照中都没有扩增条带，而在目的条带位置有相同的条带，表明快速扩增核酸方法与普通pcr相比，能够缩短超过三分之二的时间，但是获得与普通pcr一致的扩增结果。
实施例2、快速扩增核酸方法与普通pcr方法的结果比较(实时荧光法)。
1.正反引物、目标扩增序列
正向引物la：5’-catcgtctgcctgtcat-3’
反向引物lra：5’-tcgccagcttcagtt-3’
目标扩增序列lt:5’-catcgtctgcctgtcatgggctgttaatcattaccgtgataacgccattacctacaaagcccagcgcgacaaaaatgccagagaactgaagctggcga-3’
2.扩增反应体系(快速扩增反应体系与普通pcr体系相同)
3.快速扩增反应条件：94℃0秒，60℃0秒，信号采集，循环40次。(耗时24min10s)
普通pcr反应条件：95℃3分钟；94℃30秒，60℃30秒，信号采集，循环40次。
(耗时88min)
4.结果分析：
附图3是本发明的快速扩增核酸的方法与普通pcr法同时对lamda噬菌体上一段98bp的序列进行扩增的实时监测结果。从图中可以看出，快速扩增方法在15分钟左右即达到荧光检测的阈值，而普通pcr则在45分钟才能达到荧光检测的阈值，证明快速扩增方法确实能节约三分之二的扩增时间。
实施例3用快速扩增核酸的方法扩增不同来源(包括质粒、病毒、细菌、植物、动物)的dna。
1.正反引物、目标扩增序列
模板来源1：质粒-pegfp-n1
正向引物vf：5’-tacctcgctctgctaatcct-3’
反向引物vrf：5’-gcgccttatccggtaactatc-3’
目标扩增序列vt:5’-tacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgc-3’(100bp)
模板来源2：病毒-λc|857sam7基因组dna
正向引物ld：5’-catcgtctgcctgtcatggg-3’
反向引物lrd：5’-tcgccagcttcagttctctgg-3’
目标扩增序列lt:5’-catcgtctgcctgtcatgggctgttaatcattaccgtgataacgccattacctacaaagcccagcgcgacaaaaatgccagagaactgaagctggcga-3’(98bp)
模板来源3：细菌-金黄色葡萄球菌基因组dna
正向引物sta-f-1：5’-ctgcgacattaattaaagcgat-3’
反向引物sta-r-1：5’-aggatgctttgtttcaggtg-3’
目标扩增序列st:5’-ctgcgacattaattaaagcgattgatggtgatacggttaaattaatgtacaaaggtcaaccaatgacattcagactattattagttgatacacctgaaacaaagcatcct-3’(110bp)
模板来源4：植物-红花基因组dna
正向引物f2：5’-tagtggtggttgtaaaggacttc-3’
反向引物r2：5’-cgtcgtaagacgacacgttag-3’
目标扩增序列ft:5’-tagtggtggttgtaaaggacttcgtaacgagccgtgttgatgctagggaattgctctctaaagaccctaacgtgtcgtcttacgacg-3’(87bp)
模板来源5：动物-猪线粒体dna
正向引物pf：5’-cacacatctgtcgagacgtaaa-3’
反向引物pr：5’-cggcctacgtggatgaata-3’
目标扩增序列pt:5’-cacacatctgtcgagacgtaaattacggatgagttattcgctacctacatgcaaacggagcatccatgttctttatttgcctattcatccacgtaggccg-3’(100bp)
2.dna提取
针对5种不同来源的模板dna，分别采用质粒dna提取试剂盒，高温裂解法，高温裂解法，植物基因组dna提取试剂盒，动物dna提取试剂盒进行dna的提取。3.扩增反应体系及条件
质粒(pegfp-n1)扩增反应体系
扩增反应条件：94℃0秒，65℃0秒，循环30次。
病毒(λ噬菌体)扩增反应体系
扩增反应条件：94℃0秒，68℃0秒，循环30次。
细菌(金黄色葡萄球菌)扩增反应体系
扩增反应条件：94℃0秒，61℃0秒，循环30次。
植物(红花)扩增反应体系
扩增反应条件：94℃0秒，65℃0秒，循环30次。
动物(猪)扩增反应体系
扩增反应条件：94℃0秒，64℃0秒，循环30次。
4.扩增产物分析：
取5μl扩增后的样品，与1μl6倍dna上样缓冲液混合，在含有gelview核酸染料的琼脂糖胶上进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，均可看到在目的条带位置有明亮的扩增条带分别为100bp,98bp,110bp,87bp,100bp，表明快速扩增核酸方法能够在缩短三分之二的时间的前提下，获得理想的扩增结果。
实施例4用实时荧光的快速核酸扩增方法对dna进行定量(染料法)。
1.正反引物、目标扩增序列
正向引物ld：5’-catcgtctgcctgtcatggg-3’
反向引物lrd：5’-tcgccagcttcagttctctgg-3’
目标扩增序列lt:5’-catcgtctgcctgtcatgggctgttaatcattaccgtgataacgccattacctacaaagcccagcgcgacaaaaatgccagagaactgaagctggcga-3’(98bp)
2.扩增反应体系及条件(快速扩增反应体系与普通pcr体系相同)
快速扩增反应条件：94℃0秒，68℃0秒，信号采集，循环40次。
普通pcr反应条件：94℃30秒，68℃30秒，信号采集，循环40次。
3.结果分析：
附图5是本发明的实时荧光快速核酸扩增方法和普通实时荧光pcr法对dna进行定量分析的荧光扩增曲线和标准曲线。从图中可以看出，快速扩增方法在15分钟左右即达到荧光检测的阈值，而普通pcr则在40分钟才能达到荧光检测的阈值，证明快速扩增方法确节约三分之二的扩增时间。同时两条标准曲线基本重合，表明快速核酸扩增方法虽然节约了时间，但是没有降低效率，定量分析的检测限和线性关系与普通pcr保持一致。
实施例5用实时荧光的快速核酸扩增方法对dna进行定量(探针法)。
1.正反引物、目标扩增序列
正向引物f1：5’-tcgttgtttgtgcctactctc-3’
反向引物r1：5’-tcgccagcttcagttctctgg-3’
taqman探针p1：(fam)5'-ccttgccctcaacaatgcgacatg-3'(bhq1)
目标扩增序列zt:5’-tcgttgtttgtgcctactctccgtgtccttgccctcaacaatgcgacatgtcgtcgtcggacccctcaccatggacccttccggcttccgaataagaagaaggaaccgtcct-3’(98bp)
2.扩增反应体系及条件(快速扩增反应体系与普通pcr体系相同)
快速扩增反应条件：94℃0秒，60℃0秒，信号采集，循环40次。
普通pcr反应条件：94℃20秒，60℃30秒，信号采集，循环40次。
3.结果分析：
附图6是本发明的实时荧光快速核酸扩增方法和普通实时荧光pcr法对dna进行定量分析的荧光扩增曲线和标准曲线。从图中可以看出，快速扩增方法在15分钟左右即达到荧光检测的阈值，而普通pcr则在40分钟才能达到荧光检测的阈值，证明快速扩增方法确节约三分之二的扩增时间。同时两条标准曲线基本重合，表明快速核酸扩增方法虽然节约了时间，但是没有降低效率，定量分析的检测限和线性关系与普通pcr保持一致。
序列表
<110>中国科学院成都生物研究所
<120>一种快速扩增核酸的方法
<141>2018-06-21
<160>21
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>17
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>1
catcgtctgcctgtcat17
<210>2
<211>15
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>2
tcgccagcttcagtt15
<210>3
<211>98
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>3
catcgtctgcctgtcatgggctgttaatcattaccgtgataacgccattacctacaaagc60
ccagcgcgacaaaaatgccagagaactgaagctggcga98
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>4
tacctcgctctgctaatcct20
<210>5
<211>21
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>5
gcgccttatccggtaactatc21
<210>6
<211>100
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>6
tacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtctt60
accgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgc100
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>7
catcgtctgcctgtcatggg20
<210>8
<211>21
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>8
tcgccagcttcagttctctgg21
<210>9
<211>22
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>9
ctgcgacattaattaaagcgat22
<210>10
<211>20
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>10
aggatgctttgtttcaggtg20
<210>11
<211>110
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>11
ctgcgacattaattaaagcgattgatggtgatacggttaaattaatgtacaaaggtcaac60
caatgacattcagactattattagttgatacacctgaaacaaagcatcct110
<210>12
<211>23
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>12
tagtggtggttgtaaaggacttc23
<210>13
<211>21
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>13
cgtcgtaagacgacacgttag21
<210>14
<211>87
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>14
tagtggtggttgtaaaggacttcgtaacgagccgtgttgatgctagggaattgctctcta60
aagaccctaacgtgtcgtcttacgacg87
<210>15
<211>22
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>15
cacacatctgtcgagacgtaaa22
<210>16
<211>19
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>16
cggcctacgtggatgaata19
<210>17
<211>100
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>17
cacacatctgtcgagacgtaaattacggatgagttattcgctacctacatgcaaacggag60
catccatgttctttatttgcctattcatccacgtaggccg100
<210>18
<211>21
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>18
tcgttgtttgtgcctactctc21
<210>19
<211>21
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>19
tcgccagcttcagttctctgg21
<210>20
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>20
ccttgccctcaacaatgcgacatg24
<210>21
<211>112
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>21
tcgttgtttgtgcctactctccgtgtccttgccctcaacaatgcgacatgtcgtcgtcgg60
acccctcaccatggacccttccggcttccgaataagaagaaggaaccgtcct112