本发明专利属于环境工程技术领域，具体涉及一种猪粪中抗生素抗性基因的定量检测方法。
背景技术：
四环素是一类常见的抗生素，作为兽药和促生长剂大量用于畜牧养殖业。研究证明大部分抗生素难以被动物吸收利用，约25~75%的抗生素未经代谢而以母体化合物形式随粪尿排出体外。在环境中，抗生素会诱导环境中的微生物的耐药性产生选择压力，诱导产生四环素抗性基因（args）。抗性基因具有较强的横向转移能力，其可以在土壤、地下水及各个环境介质中迁移、转化，并很可能随抗性质粒等被带入食物链并最终进入人体，增加人体的抗生素耐药性.一旦这些抗性基因从环境微生物进入到致病菌中，就会对人类健康构成潜在威胁。因此，残留有抗生素的粪尿排放到环境中或使用残留有抗生素的粪便作为有机肥施用到农田中，对人体健康以及整个生态系统构成长期潜在危害。
抗生素抗性基因作为一种新型的环境污染，种类繁多，数量巨大，比如截至目前，四环素类抗性基因就有三大类超过四十种，建立猪粪中抗性基因的定量检测方法，对于进一步系统地监测畜禽养殖污染物中抗生素抗性基因及其评价其生态风险有重要意义，同时对于抗性基因畜禽养殖污染源的控制也有重要意义。目前，猪粪抗性基因提取研究中，没有商品化的猪粪抗性基因标准品，而且普通pcr只能定性的检测基因的有无，而且灵敏度不高。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明专利提供一种猪粪中抗生素抗性基因的定量检测方法。其具体步骤如下：
1)选用经常服用抗生素的猪，服用的抗生素种类应包括目的抗性基因所对应的抗生素；用猪粪基因组提取试剂盒(fastdnaspinkitformanure)提取猪粪的基因组dna，并以猪粪dna为模板，采用pcr扩增目的抗性基因片段，其长度应该在168-171bp，目的抗性基因种类主要有四环素类抗性基因tetm基因、teto基因、tetw基因、tett基因；
2）采用dna凝胶纯化试剂盒纯化扩增后的目的基因片段，将片断连接在pgem–teasy载体上，然后转化感受态大肠杆菌细胞，涂平板后挑选阳性克隆子（白色菌斑）重新接入lb液体培养基中培养，然后使用培养液蘸取少量模板用m13-rv47进行扩增，若为阳性，则用lb培养液扩大培养，然后取1ml菌液测序验证插入基因片断；
3）挑选克隆成功的菌液提取质粒，检测质粒浓度，换算出质粒所携带抗性基因的拷贝数，并按10倍为稀释梯度稀释备用，作为抗性基因标准品；
4）将猪粪样品dna和抗性基因标准品同时进行定量pcr扩增，根据抗性基因标准品的拷贝数和其扩增的ct值生成标准曲线，进而得出猪粪样品的抗性基因的拷贝数。
本发明专利中，质粒浓度换算成每μl质粒溶液所携带的绝对模板拷贝数的公式为：copies/μl＝[x/(a+b)×660]×10-9×6.02×1023，其中x为质粒浓度(ng/μl)；a为载体长度(bp)；b为目的抗性基因长度(bp)。
本发明专利中，pcr扩增的反应体系体积为25μl：包括0.125μl5u·μl-1extaqdna聚合酶，2.5μl缓冲液10×extaqbuffer（含mg2+），2μl浓度为2mmol·l-1的dntps，0.25μl浓度为20μmol·l-1的上下游引物，0.5μl稀释10倍的dna样品，余量为二次重蒸水；而反应条件为：94℃下预变性4min，94℃45s，退火45s，72℃1min，35个循环，最后72℃下延伸6min。
本发明专利中，目的抗性基因为四环素类抗性基因tetm的前后引物序列分别为
acagaaagcttattatataac，tggcgtgtctatgatgttcac；退火温度为45℃；抗性基因为四环素类抗性基因teto基因的前后引物序列分别为
acggaragtttattgtatacc，tggcgtatctataatgttgac；退火温度为45℃；抗性基因为四环素类抗性基因tett基因的前后引物序列分别为
aaggtttattatataaaagtg，aggtgtatctatgatatttac；退火温度40℃；抗性基因为四环素类抗性基因tetw基因的前后引物序列分别为
gagagcctgctatatgccagc，gggcgtatccacaatgttaac；退火温度60℃.而定量pcr的反应体系为25μl，包括2μl（约1.27ng·μl-1）模板dna，12.5μl荧光染料sybrpremixextaq，前后引物各200nmol·l-1。
而定量pcr反应程序：目的抗性基因为四环素类抗性基因tetm基因的定量pcr反应程序为95℃1min后，40个循环为94℃10s，45℃45s，80℃6s；目的抗性基因为四环素类抗性基因teto基因的定量pcr反应程序为95℃1min后，40个循环为94℃10s，45℃45s，81℃10s；目的抗性基因为四环素类抗性基因tett基因的定量pcr反应程序为95℃1min后，40个循环为94℃10s，40℃45s，79℃6s目的抗性基因为四环素类抗性基因tetw基因的定量pcr反应程序为95℃1min后，40个循环为94℃10s，60℃45s，83℃10s。
本发明专利的特点是采用猪粪dna样品准确快速地制得抗性基因标准品，与猪粪样品抗性基因的提取有较好的匹配性。质粒标准品可以在-20℃下保存，一次制备可用10-20次。本发明操作简单，对样品的检测速度高，检测结果的灵敏度高，数量上也更为直观；不依赖于微生物培养，能检测到不可培养微生物所携带的抗性基因，使最终得到的量化结果更为全面和可信。
本发明专利明确了猪粪中四环素类抗性基因tetm基因、teto基因、tetw基因、tett基因的定量检测方法，同时也可为其他抗性基因定量检测提供参考。
具体实施方式
取长期服用抗生素的猪所产生的粪便0.25g，用于质粒提取；取某猪场的猪粪样品三份，每份0.25g；即三个平行。所取猪粪采用土壤基因组提取试剂盒(fastdnaspinkitformanure)提取分别提取dna，溶剂分别为100μl；
分别选取前后引物，
tetm：acagaaagcttattatataac，tggcgtgtctatgatgttcac；产物长度171bp
teto：acggaragtttattgtatacc，tggcgtatctataatgttgac；产物长度171bp
tett：aaggtttattatataaaagtg，aggtgtatctatgatatttac；产物长度169bp
tetw：gagagcctgctatatgccagc，gggcgtatccacaatgttaac；产物长度168bp
用服用抗生素的猪的猪粪样品dna为模板进行pcr扩增，普通pcr反应体系为25μl：包括0.125μl5u·μl-1extaqdna聚合酶，2.5μl缓冲液10×extaqbuffer（含mg2+），2μl浓度为2mmol·l-1的dntps，0.25μl浓度为20μmol·l-1的各引物，0.5μl稀释10倍的dna样品，余量为二次重蒸水；而反应条件为：94℃下预变性4min，94℃45s，退火45s，72℃1min，35个循环，最后72℃下延伸6min。
切胶回收纯化扩增后的基因片段tetm（171bp）、teto（171bp）、tett（169bp）和tetw（168bp）。将片断连接在pgem–teasy载体上，然后转化感受态大肠杆菌细胞，转化后的大肠杆菌经37℃、150pm摇床上培养1h，然后均匀涂至含100mg/l氨苄青霉属、0.5mmiptg和80mg/lx-gal的lb培养基平板上，37℃过夜培养。然后挑选白色菌斑重新接入lb液体培养基中悬浮培养（37℃、16h），取1μl菌液进行菌液pcr验证目的基因。
分别取阳性菌液3ml提取质粒，质粒送到测序公司测序、根据返回来的测序结果在ncbi网站上比对插入基因片断正确后，用nanodrop检测质粒浓度，根据换算公式copies/μl＝[x/(a+b)×660]×10-9×6.02×1023，其中x为质粒浓度；a为pgem–teasy载体的长度（3015bp）；b为目的抗生素抗性基因长度。则换算出质粒所携带目的抗性基因的拷贝数，并按10倍为稀释梯度稀释成为标准品。
将猪粪样品dna和标准品同时进行定量pcr扩增，具体包括25μl，包括2μl（约1.27ng·μl-1）模板dna，12.5μl荧光染料sybrpremixextaq，上下游引物各200nmol·l-1，余量为二次重蒸水。目的抗性基因tetm基因的定量pcr反应程序为95℃1min后，40个循环为94℃10s，45℃45s，80℃6s；teto基因的定量pcr反应程序为95℃1min后，40个循环为94℃10s，45℃45s，81℃10s；tett基因的定量pcr反应程序为95℃1min后，40个循环为94℃10s，40℃45s，79℃6s；tetw基因的定量pcr反应程序为95℃1min后，40个循环为94℃10s，60℃45s，83℃10s。
则得到各目的抗性基因的标准曲线为tetmy=-3.2092x+43.076，r2=0.9917；
tett：y=-2.92x+41.112，r2=0.9938；
teto：y=-3.2968x+42.052，r2=0.9923；
tetw：y=-3.3259x+43.076，r2=0.9932。
以上x为log10目的基因拷贝数，y为临界循环数，即定量pcr仪的ct值读数。由以上曲线可得，ct值和目的基因拷贝数的线性关系很强（r2在0.992~0.994之间），扩增效率e在91.8%~105.0%，根据标准曲线，计算出目的基因拷贝数tett为（4.45±0.25）×107copies·g-1（干样），tetm为（3.92±0.54）×107copies·g-1（干样），teto为（1.65±0.07）×107copies·g-1（干样），tetw为（2.16±0.20）×108copies·g-1（干样）。将猪粪中四种抗性基因进行比较，发现tetw在猪粪中的基因均高于其他基因，较其它基因，在猪粪中更加普遍。
对比实施例1
将实施例中tetm基因、teto基因、tett基因、tetw基因的退火温度均提高5℃，则
tetm基因所对应的标准曲线的r2值为0.917，扩增效率e为76.5%；
teto基因所对应的标准曲线的r2值为0.923，扩增效率e为75.4%；
tett基因所对应的标准曲线的r2值为0.901，扩增效率e为73.2%；
tetw基因所对应的标准曲线的r2值为0.912，扩增效率e为73.6%；
生成标准曲线的r2值应大于0.98，越接近于1，结果可信度越高。扩增效率e的范围应在80%-120%，越接近于1，越理想。因此，最终得到的每克干粪目的抗性基因的拷贝数不可靠。
对比实施例2
将实施例中tetm基因、teto基因、tett基因、tetw基因的退火温度均降低5℃，则
tetm基因所对应的标准曲线的r2值为0.923，扩增效率e为77.6%；
teto基因所对应的标准曲线的r2值为0.945，扩增效率e为76.4%；
tett基因所对应的标准曲线的r2值为0.911，扩增效率e为72.2%；
tetw基因所对应的标准曲线的r2值为0.932，扩增效率e为71.6%；
生成标准曲线的r2值应大于0.98，越接近于1，结果可信度越高。扩增效率e的范围应在80%-120%，越接近于1，越理想。因此，最终得到的每克干粪目的抗性基因的拷贝数不可靠。