本发明涉及基因检测领域，具体而言，涉及一种t790m基因突变的数字pcr检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：t790m基因突变是在肿瘤患者中发现的一种基因突变类型，具体是指表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)第20号外显子第790氨基酸位点由苏氨酸(t)突变为甲硫氨酸(g)，基因水平表现为acg突变为atg。由于甲硫氨酸比苏氨酸空间占位大，因此形成空间位阻，改变egfr激酶区atp的亲和性，导致egfr-酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitor,tki)类小分子药物不能有效阻断egfr活化信号，从而失去对肿瘤细胞杀伤作用。目前研究结果表明，t790m基因突变与肿瘤患者的耐药性、疗效预测、预后相关，而在诸如血液的体液样本中检测t790m基因突变具有显著的优势，适用于肿瘤标本不可评估(较难通过手术或穿刺获得肿瘤组织)的患者，并在一定程度上有效克服肿瘤异质性，可实现无创实时动态检测。因此，检测t790m基因突变，尤其是检测体液样本诸如血液中的t790m基因突变，无论是在临床还是在科研上均具有重要意义。目前，基因突变的检测方法包括直接测序法、变性高效液相色谱法、高分辨率溶解曲线和探针扩增阻滞突变法。其中，直接测序法的检测灵敏度约20％，只能对组织样本进行检测，并且检测步骤多，周期相对较长；变性高效液相色谱法检测灵敏度约5％左右，检测过程需要多次开盖操作，有一定的污染风险，且最终结果还需要测序才能验证；基于荧光定量pcr平台的高分辨率溶解曲线法检测灵敏度也只有5％左右，无法检测到血浆游离dna中含量稀少的突变；基于荧光定量pcr平台的另一个突变检测方法探针扩增阻滞突变法检测灵敏度约为0.1-1％,现在已有cfda批准的血浆游离dna突变检测试剂盒，但是该方法只能做定性检测，无法定量，无法获取突变比例和拷贝数。由此可见，目前对于低丰度目标序列的检测，上述方法都可能会受到背景dna的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精细定量的要求。t790m的检测作为一种对于低丰度目标序列的检测，现有检测方法均不利于t790m基因突变的早期、无创、定量检测。而微滴式数字pcr系统通过液滴化处理，能够使得稀有的核酸序列从大量的背景dna中分离出来，从而提高了检测的灵敏度与精确性。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种检测t790m基因突变的数字pcr检测试剂盒，所述试剂盒具有精确度和灵敏度高，检测时间短，可实现低丰度、低突变率样品的定性和定量检测的优点，有助于实现t790m基因突变的早期、无创、定量检测。本发明的第二目的在于提供一种t790m基因突变的检测方法，所述方法具有检测的精确度和灵敏度高，时间短，可实现低丰度、低突变率样品的定性和定量检测的优点，有助于实现t790m基因突变的早期、无创、定量检测的优点。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种t790m基因突变的数字pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括扩增引物和检测探针，其中，所述扩增引物包括上、下游引物，所述上、下游引物的核苷酸序列分别如seqidno：25～26所示，所述检测探针包括突变型探针和野生型探针，所述突变型探针和野生型探针的核苷酸序列分别如seqidno：65～66所示。本发明前述试剂盒为数字pcr检测试剂盒，通过试剂盒中所述扩增引物和检测探针的配合实现样品的数字pcr检测。数字pcr将单一样本分成若干只含有目标基因的一个拷贝(或者不含)的单元，对每个单元的pcr扩增结果分别进行检测，再根据每个单元的检测结果进行统计和计算，获得样本中目标基因的绝对拷贝数。由于在pcr反应过程，样本被分配到各单元分别进行扩增和检测，极大地降低反应背景并放大检测信号，因此，本发明所述数字pcr检测试剂盒在检测t790m基因突变时，能够实现对低丰度(血液等液体样本)、低突变率(出现耐药性的早期)的样本的准确检测，从而实现t790m基因突变的早期、无创、定量检测。众所周知，在pcr
技术领域：
，引物的好坏极大地影响pcr的扩增效率，继而影响最终的检测结果。对数字pcr而言，单个反应单元的样本含量低，只含有目标基因的一个(或不含)拷贝，在这种情况下，扩增引物的优劣对结果的影响尤为重要。而关于引物的设计，尽管现有技术中已经披露一些引物设计原则，然而，现有的引物设计原则与引物的实际扩增效率之间的对应性不佳。出于一些未知因素的影响，一些符合引物设计原则的引物对的扩增效率不佳，而不符合引物设计原则的引物对可能实际具有良好的扩增效率。因此，pcr引物，尤其是数字pcr引物具有极大的不确定性。本发明前后设计32对扩增引物，与检测探针配合，进行数字pcr反应。最终发现其中一对引物(seqidno：25～26)与所述检测探针配合，具有良好的扩增效果，明显优于其他引物对。而令人意外的是，该对引物的上、下游引物的gc含量相差大，下游引物甚至出现连续的ttt，不符合一般的引物设计规则，却在32对引物中取得最佳的检测效果。在一些具体的实施方式中，所述突变型探针和所述野生型探针为taqman探针或者taqman-mgb探针。在一些具体的实施方式中，所述突变型探针和所述野生型探针为taqman-mgb探针。在一些具体的实施方式中，所述突变型探针的5’端标记fam，3’端标记mgb，所述野生型探针的5’端标记vic，3’端标记mgb。在一些具体的实施方式中，所述上游引物、下游引物、突变型探针和野生型探针的摩尔比为7～12:7～12:2～4.5:2～4.5，优选为9:9:2.5:2.5；更优选地，所述上游引物的浓度为700～1200nm，例如，700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm或1200nm，所述下游引物的浓度为700～1200nm，例如700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm或1200nm，所述突变型探针的浓度为200～450nm，例如200nm、250nm、300nm、350nm、400nm或450nm，所述野生型探针的浓度为200～450nm，例如200nm、250nm、300nm、350nm、400nm或450nm；最优选地，所述上游引物的浓度为900nm、所述下游引物的浓度为900nm，所述突变型探针的浓度为250nm，所述野生型探针的浓度为250nm。在一些具体的实施方式中，所述试剂盒还包括其他辅助检测试剂，优选地，所述其他辅助检测试剂包括以下一种或者多种：taq酶、dntps、缓冲液、水、阴性质控品和阳性质控品；更优选地，所述taq酶、dntps和缓冲液混合为单试剂。在一些具体的实施方式中，所述缓冲液中包括tris·cl、k+和mg2+；优选地，所述k+由kcl提供，所述mg2+由mgso4和mgcl2提供。在一些具体的实施方式中，所述阴性质控品为不含t790m基因突变的人基因组dna，所述阳性质控品为含t790m基因突变的人基因组dna；优选地，所述不含t790m基因突变的人基因组dna为细胞系nci-h2228的基因组dna，所述含t790m基因突变的人基因组dna为细胞系nci-h1975的基因组dna；优选地，所述阳性质控品和/或阴性质控品中人基因组dna的浓度为0.05～2ng/μl，例如，0.05ng/μl、0.1ng/μl、0.5ng/μl、1ng/μl、1.5ng/μl或2ng/μl，优选为1ng/μl。本发明还涉及一种t790m基因突变的检测方法，所述方法包括：(1)使用前述试剂盒对样本进行数字pcr；(2)根据所述数字pcr的扩增结果，判读所述样本的t790m基因突变检测结果。本发明所述检测方法使用特定的引物和检测探针，依托数字pcr对t790m基因突变进行检测从而在短时间内可以精确而灵敏地对低丰度、低突变率样品进行定性和定量的检测，从而实现t790m基因突变的早期、无创、定量检测的优点。在一些具体的实施方式中，所述数字pcr的反应体系包括：700～1200nm上游引物，例如，700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm或1200nm；700～1200nm下游引物，例如，700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm或1200nm；200～450nm突变型探针，例如，200nm、250nm、300nm、350nm、400nm或450nm；200～450nm野生型探针，例如，200nm、250nm、300nm、350nm、400nm或450nm；0.05～2ng/μldna模板，例如，0.05ng/μl、0.1ng/μl、0.5ng/μl、1ng/μl、1.5ng/μl或2ng/μl；优选地，所述数字pcr的反应体系包括：900nm上游引物、900nm下游引物、250nm突变型探针、250nm野生型探针和1ng/μldna模板。在一些具体的实施方式中，所述数字pcr的扩增程序包括：92～97℃预变性5～15分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，92～97℃变性10～60s，50～65℃(或54～59℃，或55～58℃，或55～56℃)退火并延伸30～60s，所述扩增阶段循环35～55次；优选地，所述数字pcr的扩增程序包括：95℃预变性10分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，94℃变性30s，55.6℃退火并延伸60s，所述扩增阶段循环40次。在数字pcr反应过程中，引物和检测探针的浓度以及退火温度影响扩增效率，从而影响最终的检测结果。为获得最佳检测结果，本发明所述方法对引物、探针浓度和退火温度进行优化，发现探针浓度和退火温度对数字pcr的扩增效率具有直接而显著的影响(参见图2～4)。以退火温度为例，退火温度为64℃时，pcr产物的荧光强度在2000～3000之间，而当退火温度为55.6℃时，pcr产物的荧光强度达到6000～7500左右(参见图3)。经过优化后，本发明所述方法的灵敏度高、特异性强、稳定性好。根据说明书实施例4可知，本发明所述方法对20ng0.1％突变率的阳性参考品的阳性检出率达100％，对10ng和20ng阴性参考品的阴性检出率达100％；12份阳性参考品(5％突变频率)的检测结果均为阳性且变异系数为5.82％，10份阴性参考品的检测结果均为阴性，变异系数为2.64％；标准品的突变型检测体系线性r2＝0.9999，野生型检测体系线性r2＝0.9998；检测10ng阴性参考品、20ng阴性参考品、弱阳性参考品(1％突变比率)和邻近位点(c797s)的干扰参考品，结果阴性参考品未见阳性微滴检出，阳性参考品检出突变率分别为：0.95％、1.18％和1.51％，表明本发明所述方法具有良好的特异性；而说明书实验例1的结果表明，其能够对血浆中低至0.21％的突变率进行检测。在一些具体的实施方式中，所述样本为细胞、体液、组织或排泄物，优选地，所述体液包括血清、血浆或组织液。在一些具体的实施方式中，所述数字pcr为微孔板数字pcr、微流控数字pcr或微滴数字pcr。在一些具体的实施反式中，所述检测方法为非诊断目的的检测方法。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明所述试剂盒和所述检测方法依托于数字pcr检测技术，具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作快速简单、安全性高、稳定性好等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性。本发明所述试剂盒和检测方法对引物序列、引物浓度、探针浓度和退火温度等进行优化，显著提高所述试剂盒和检测方法的灵敏度和特异性，最终对低丰度(血液等液体样本)、低突变率(出现耐药性的早期)的样本进行准确检测，实现t790m基因突变的早期、无创、定量检测，取得预料不到的技术效果，效果显著优于同类产品。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为部分引物对的扩增结果，其中a区表示突变型dna微滴，b区表示突变型和野生型dna均为阳性的微滴，c区表示空白微滴，d区表示野生型dna阳性微滴；图2为部分引物对的扩增结果，其中a区表示突变型dna微滴，b区表示突变型和野生型dna均为阳性的微滴，c区表示空白微滴，d区表示野生型dna阳性微滴；图3为部分引物对的扩增结果，其中a区表示突变型dna微滴，b区表示突变型和野生型dna均为阳性的微滴，c区表示空白微滴，d区表示野生型dna阳性微滴；图4为不同浓度上、下游引物对数字pcr检测效果的影响，其中a区表示突变型dna微滴，b区表示突变型和野生型dna均为阳性的微滴，c区表示空白微滴，d区表示野生型dna阳性微滴；图5为不同浓度检测探针对数字pcr检测效果的影响，其中其中a区表示突变型dna微滴，b区表示突变型和野生型dna均为阳性的微滴，c区表示空白微滴，d区表示野生型dna阳性微滴；图6为不同退火温度对数字pcr检测效果的影响，其中a区表示突变型dna阳性微滴，b区表示空白微滴；图7为不同退火温度对数字pcr检测效果的影响，其中a区表示野生型dna阳性微滴，b区表示空白微滴；图8为实施例4所述12份阳性参考品(5％突变频率)的检测结果的阳性重复性；图9为实施例4所述10份阴性参考品的检测结果的阴性重复性；图10为实施例4所述25％突变率的标准品的突变型检测体系的线性检测结果；图11为实施例4所述25％突变率的标准品的野生型检测体系的线性检测结果；图12为实验例第1例样本的检测结果，图12-1为血浆样本(a区表示突变型dna微滴，b区表示突变型和野生型dna均为阳性的微滴，c区表示空白微滴，d区表示野生型dna阳性微滴)；图12-2为阳性质控品(a～d区的设置同图12-1)；图12-3为阴性质控品(a～d区的设置同图12-1)；图12-4为ntc无模板质控(空白微滴)；图13为实验例第4例样本的检测结果，图13-1为血浆样本(a区表示突变型dna微滴，b区表示突变型和野生型dna均为阳性的微滴，c区表示空白微滴，d区表示野生型dna阳性微滴)；图13-2为阳性质控品(a～d区的设置同图13-1)；图13-3为阴性质控品(a～d区的设置同图13-1)；图13-4为ntc无模板质控(空白微滴)；图14为实验例第7例样本的检测结果，图14-1为血浆样本(a区表示空白微滴，b区表示野生型dna阳性微滴)；图14-2为阳性质控品(a区表示突变型dna微滴，b区表示突变型和野生型dna均为阳性的微滴，c区表示空白微滴，d区表示野生型dna阳性微滴)；图14-3为阴性质控品(a～d区的设置同图14-1)；图14-4为ntc无模板质控(空白微滴)。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。下述实施例和实验例涉及的仪器包括：bio-radqx200数字pcr仪、qubit3.0、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。涉及的试剂包括：supermix(bio-rad公司)、dropletgenerationoil(bio-rad公司)、dropletreaderoil(bio-rad公司)、纯化水(thermofisher)，所述引物和检测探针达到电泳级(page)或hplc级，不含杂带。实施例1设计用于数字pcr的t790m扩增引物和检测探针一、引物和探针的设计1.根据人egfr第20个外显子的核苷酸序列，设计扩增产物包括t790m位点的上、下游引物，具体引物序列参见表1。2.根据t790m基因突变处的核苷酸信息设计检测探针：突变型核酸探针(t790m-probe-mu)和野生型核酸探针(t790m-probe-wt)，其中，突变型探针为taqman-mgb探针，其核酸序列的5’端标记fam，3’端标记mgb；野生型探针为taqman-mgb探针，其核酸序列的5’端标记vic，3’端标记mgb，具体探针序列参见表2。表1表2引物探针名称引物序列长度t790m-probe-muctcatcatgcagctcaatgc(seqidno：65)20t790m-probe-wtagctcatcacgcagctcat(seqidno：66)19二、扩增效率的检测通过数字pcr检测所述上、下游引物和检测探针的效率，其中，所述数字pcr的具体检测方法如下所示：检测样本：阳性标准品h1975细胞系dna，阴性标准品h2228细胞系dna。(1)按表3配制t790m检测液，其中，引物终浓度为25μm，探针浓度达到100μm，模板起始量为20ng/20μl，按表4配制pcr反应体系。t790m检测液配制完成后，涡旋振荡混匀10s后瞬时离心，分装至1.5mlep管或8连管中，每管分装11μl。向对应的1.5mlep管或8连管中加入已处理好的cfdna样本(体积≤9μl)或阴性/阳性/空白对照品，用ultrapuretmdnase/rnase-freedistilledwater补足至20μl，涡旋混匀10s后瞬时离心。表3表4试剂组分1人份pcrmix(μl)n人份pcrmix(μl)ddpcrtmsupermixforprobes(nodutp)1010×(n+0.5)/(n+1)egfrt790m检测液1(n+0.5)/(n+1)total1111×(n+0.5)/(n+1)(2)微滴生成1)将dg8cartridge放置于底座上，将配制好的20μlpcr体系加入到dg8cartridge中间一排孔内，不足8个样本时凑足8个或用稀释一倍的20μl1×buffercontrol补足，不允许有空孔。建议使用rainin的8通道20μl排枪和20μl枪头，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。在dg8cartridge最底一排8个孔中各加入70μl微滴生成油，不允许有空孔。加样本及微滴生成油时都要避免产生气泡。2)盖上胶垫(gasket)，注意两边的小孔都要钩牢。3)将dg8cartridge及底座轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴。运行指示灯常绿时，微滴生成结束，一般2分钟之内完成。仪器所处环境温度必须处于20-30℃之间。微滴生成于cartridge最上面一排孔内，建议使用rainin的8通道p-50排枪和200μl枪头小心缓慢吸取，调整吸取体积为40μl，将holder放平，枪头以与孔壁呈30～45°角放入，轻触孔底，约5秒吸取40μl，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内(约5秒)，枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的cartridge和胶垫。(3)反应条件1)封膜操作：打开pcr热封仪，设置温度为180℃，预热。转移微滴进入96孔板内完成后，将膜有红线标记的一面(反光亮面)朝上置于96孔板上并固定好(注意将红线标记保持于96孔板偏上位置)，用预热好的px1热封仪对其进行封膜，需确认各样品孔是否密封好，若未密封好则需颠倒方向二次封膜。封好膜后在30分钟内进行pcr反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行pcr反应，可在任意一台96孔pcr仪上完成，注意升降温速度≤2.5℃/s。2)pcr程序设置：按表5所示条件设置pcr反应程序，并进行pcr反应：表5三、检测结果根据检测结果，反复调整与所述检测探针配套使用的上、下游引物，最终从32对上下游引物中挑选出检测效果最佳的上、下游引物(表1第13对)：1)最佳引物的阴性和阳性微滴区域区分效果良好，荧光值差异明显，不存在或很少存在散点拖尾现象，对于结果判读明确便捷；采用最佳引物测试了不同突变比例的阳性和阴性标准品，检测结果显示阳性和阴性微滴区分明显，表6列举了部分检测结果。2)非最佳引物的阴性和阳性微滴间存在拖尾现象，影响最终突变比例和拷贝数计算，容易造成人为的假阳性和假阴性等结果误判(部分结果如图1～3所示)。结论：本实施例所述第13对引物，其上游引物和下游引物在gc含量差异大，下游引物出现连续的ttt，并非常规意义上最佳引物对，但该引物对在特异性和扩增效率上均明显优于其他引物对(尽管其他引物对的上下游引物的gc含量差异小，表面上更符合引物设计的原则)。表6实施例2引物浓度和探针浓度的优化1.引物浓度优化对实施例1所述上、下游引物(第13对)进行梯度稀释，使所述上、下游引物在反应体系中的终浓度分别为700、800、900、1000、1100或1200nm，并通过数字pcr检测不同浓度下的检测效果，具体检测结果参见图4。根据图4所示结果可知，引物浓度对荧光值及微滴区分影响较小，最终选择900nm作为优化后的引物浓度。其中具体检测样本、反应体系的配置、微滴生成方式以及反应条件如实施例1所示，梯度稀释方法如下所示：取引物干粉，根据引物合成公司提供的引物nmol值将引物稀释至10μm(nmol值/10)，作为储液，再将所述储液按表7进行稀释。表710μm储液使用量te溶液使用量引物终浓度10μl132.86μl700nm10μl115μl800nm10μl101.11μl900nm10μl90μl1000nm10μl80.91μl1100nm10μl73.33μl1200nm2.探针浓度优化对实施例1所述检测探针(t790m-probe-mu和t790m-probe-wt)进行梯度稀释，使所述检测探针在反应体系中的终浓度分别为200nm、250nm、300nm、350nm、400nm或450nm，并过数字pcr检测不同浓度下的检测效果，具体检测结果参见图5。根据图5所示结果可知，检测探针的浓度对荧光值及微滴区分有直接影响，最终选择250nm作为优化后的探针浓度。其中，具体检测样本、反应体系的配置、微滴生成方式以及反应条件如实施例1所示，稀释方法如下所示：取收到的探针储液(探针合成公司提供浓度为100μm的探针储液)10μl，按表8进行稀释。表8实施例3反应体系退火温度的优化按照以下方法优化数字pcr的退火温度：将pcr仪设置温度梯度，从55.0℃至64.0℃，以h1975细胞系的基因组dna为检测模板进行数字pcr扩增检测，根据微滴区分情况确定最佳退火温度为55.6℃。具体检测结果参见图6～7。其中，具体检测样本、反应体系、微滴生成和封膜操作如实施例2所示，而具体的pcr反应程序如表7所示。表7实施例4数字pcr检测方法的建立1.t790m基因突变的数字pcr检测方法的建立1)设置待测dna样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板空白对照，均设置3个复孔。2)配制数字pcr反应体系，具体反应体系如表9所示。3)制备微滴：①将8个样品(20μl)反应体系加入到dg8cartridge中间一排的8个孔内；②在dg8cartridge最底一排8个孔中各加入70μl微滴生成油；③盖上胶垫(gasket)，将dg8cartridge轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2分钟之内完成。④微滴生成于cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴转移到96孔板中并进行封膜处理，随后进行下一步pcr反应。4)根据以上反应体系进行上机，反应程序：95℃预变性10分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，94℃变性30s，55.6℃退火并延伸60s，所述扩增阶段循环40次。5)实验结束以后，按以下步骤进行检测结果的分析、判定(以bio-radqx200仪器为例进行说明)：1.判读空白对照：空白对照在fam(对应ch1)和vic/hex(对应ch2)通道没有微滴或微滴数小于3个。2.判读阴性对照：阴性对照在vic/hex通道有荧光，且微滴数≥3个。3.判读阳性对照：阳性对照在fam通道有荧光信号，且微滴数≥3个4.判读样品fam通道阳性微滴与空白微滴区分是否明显，根据阳性参考品设定区分区域并统计阳性微滴数量。5.判读样品vic通道阴性微滴与空白微滴区分是否明显，根据阴性参考品设定区分区域并统计阴性微滴数量。6.判读样本fam和vic双通道均有荧光信号的微滴数量，根据阳性和阴性参考品设定区分区域统计微滴数量并按照泊松方程计算拷贝数。7.不符合上述第1项要求，建议重做本次实验。不符合第2或3项要求，建议重新从样本中提取dna，再次检测。表9数字pcr反应体系2.评价数字pcr检测方法的阳性符合率、阴性符合率、重复性和特异性按前述数字pcr检测方法，分别检测20例0.1％突变率的投入量为20ng的阳性参考品，并对检测结果进行统计分析，结果显示，所述检测结果的阳性符合率100％。具体检测结果参见表10。表103.按照以上数字pcr检测方法，分别检测投入量为10ng和20ng的阴性参考品，并对检测结果进行统计分析，结果显示，阴性符合率100％。具体检测结果参见表11。表114.按照以上数字pcr检测方法，分别检测12份阳性参考品(5％突变频率)和10份阴性参考品，并对检测结果进行统计分析，计算其变异系数(阳性参考品的具体检测结果参见表12、图8；阴性参考品的具体检测结果参见表13、图9)，结果显示，所述阳性参考品的阳性符合率为100％，变异系数为5.82％；10份阴性参考品的阴性符合率为100％，变异系数为2.64％。表12表135.按照以上数字pcr检测方法，分别检测100ng、50ng、10ng、5ng和1ng上样量下25％突变比率的标准品，分析结果并统计突变型和野生型拷贝数，计算检测体系的线性，结果显示，突变型检测体系线性r2＝0.9999，野生型检测体系线性r2＝0.9998。具体检测结果参见图表14和图10～11。表146.按照以上数字pcr检测方法，分别检测各3份10ng阴性参考品、20ng阴性参考品、弱阳性参考品(1％突变比率)和邻近位点(c797s)的干扰参考品，考察检测体系特异性，结果阴性参考品未见阳性微滴检出，阳性参考品检出突变率分别为：0.95％、1.18％和1.51％，邻近位点未检测出阳性微滴。具体检测结果参见表15。表15实验例1肺腺癌患者一代tki靶向药耐药位点检测受试样本：本实验例涉及8例临床肺腺癌患者的血浆样本，由不同的医院提供，患者均为服用一代tki靶向药(易瑞沙/特罗凯/凯美纳)后出现耐药，经临床影像学确认疾病进展。抽取患者10ml外周血全血后分离血浆，立即放入-80度冰箱中保存。实验方法：参照实施例4所述数字pcr检测方法检测前述8例患者血浆游离dna中t790m基因的突变情况。实验结果与分析：具体检测结果参见表16，图12～14，根据表16可知，8例样本有6例检测出t790m基因突变，突变频率最低约为0.21％，2例未检到突变。表168例临床样本t790m基因突变检测结果图12～14示出部分样本的检测结果(图12对应样本1，图13对应样本4，图14对应样本7)反映本次检测方法的检测质量。图12～14显示野生型微滴、突变型微滴与空白微滴区分良好，其中突变型微滴与空白微滴荧光信号差值在6000以上，能够很好的将未扩增以及非特异性扩增的微滴区分开，提高检测的准确性。检测到最低的突变比例约为0.21％，比直接测序法、突变高效液相色谱图、高效分辨率溶解曲线和探针扩增阻滞突变法的检测灵敏度提升10倍以上，检测效果显著，此外，本次检测结果中包含野生和突变拷贝数绝对值，通过换算可以得到患者体内每毫升外周血中突变的数量，用以指导临床医生用药以及耐药监控。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>江苏先声医学诊断有限公司南京先声医学诊断有限公司北京先声医学检验实验室有限公司<120>一种t790m基因突变的数字pcr检测试剂盒及其检测方法<160>66<170>patentinversion3.3<210>1<211>17<212>dna<213>人工序列<400>1tacgtgatggccagcgt17<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2cggacatagtccaggaggca20<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3aagcctacgtgatggccagcgt22<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4gacatagtccaggaggcagc20<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5agcctacgtgatggccagcgt21<210>6<211>17<212>dna<213>人工序列<400>6agccgaagggcatgagc17<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<400>7cgtgatggccagcgtgga18<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8cggacatagtccaggaggca20<210>9<211>17<212>dna<213>人工序列<400>9gtgatggccagcgtgga17<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10ggacatagtccaggaggcag20<210>11<211>17<212>dna<213>人工序列<400>11gtgatggccagcgtgga17<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12cccggacatagtccaggagg20<210>13<211>21<212>dna<213>人工序列<400>13agcctacgtgatggccagcgt21<210>14<211>19<212>dna<213>人工序列<400>14gtccaggaggcagccgaag19<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15ctacgtgatggccagcgtgg20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16atagtccaggaggcagccga20<210>17<211>17<212>dna<213>人工序列<400>17gtgatggccagcgtgga17<210>18<211>19<212>dna<213>人工序列<400>18atagtccaggaggcagccg19<210>19<211>19<212>dna<213>人工序列<400>19cctacgtgatggccagcgt19<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<400>20catagtccaggaggcagccg20<210>21<211>19<212>dna<213>人工序列<400>21ctacgtgatggccagcgtg19<210>22<211>19<212>dna<213>人工序列<400>22atagtccaggaggcagccg19<210>23<211>17<212>dna<213>人工序列<400>23gtgatggccagcgtgga17<210>24<211>20<212>dna<213>人工序列<400>24cggacatagtccaggaggca20<210>25<211>24<212>dna<213>人工序列<400>25gcatctgcctcacctccaccgtgc24<210>26<211>22<212>dna<213>人工序列<400>26tttgcgatctgcacacaccagt22<210>27<211>22<212>dna<213>人工序列<400>27gcctacgtgatggccagcgtgg22<210>28<211>18<212>dna<213>人工序列<400>28tagtccaggaggcagccg18<210>29<211>19<212>dna<213>人工序列<400>29cctacgtgatggccagcgt19<210>30<211>20<212>dna<213>人工序列<400>30gacatagtccaggaggcagc20<210>31<211>17<212>dna<213>人工序列<400>31gtgatggccagcgtgga17<210>32<211>20<212>dna<213>人工序列<400>32gacatagtccaggaggcagc20<210>33<211>20<212>dna<213>人工序列<400>33cctacgtgatggccagcgtg20<210>34<211>20<212>dna<213>人工序列<400>34ggacatagtccaggaggcag20<210>35<211>17<212>dna<213>人工序列<400>35gtgatggccagcgtgga17<210>36<211>18<212>dna<213>人工序列<400>36tagtccaggaggcagccg18<210>37<211>20<212>dna<213>人工序列<400>37ctacgtgatggccagcgtgg20<210>38<211>21<212>dna<213>人工序列<400>38cggacatagtccaggaggcag21<210>39<211>19<212>dna<213>人工序列<400>39ctacgtgatggccagcgtg19<210>40<211>17<212>dna<213>人工序列<400>40caggaggcagccgaagg17<210>41<211>21<212>dna<213>人工序列<400>41ctacgtgatggccagcgtgga21<210>42<211>20<212>dna<213>人工序列<400>42cggacatagtccaggaggca20<210>43<211>16<212>dna<213>人工序列<400>43acgtgatggccagcgt16<210>44<211>20<212>dna<213>人工序列<400>44gacatagtccaggaggcagc20<210>45<211>18<212>dna<213>人工序列<400>45ctacgtgatggccagcgt18<210>46<211>19<212>dna<213>人工序列<400>46tagtccaggaggcagccga19<210>47<211>19<212>dna<213>人工序列<400>47ctacgtgatggccagcgtg19<210>48<211>18<212>dna<213>人工序列<400>48gtccaggaggcagccgaa18<210>49<211>17<212>dna<213>人工序列<400>49tacgtgatggccagcgt17<210>50<211>19<212>dna<213>人工序列<400>50cggacatagtccaggaggc19<210>51<211>24<212>dna<213>人工序列<400>51agcctacgtgatggccagcgtgga24<210>52<211>19<212>dna<213>人工序列<400>52cggacatagtccaggaggc19<210>53<211>20<212>dna<213>人工序列<400>53ctacgtgatggccagcgtgg20<210>54<211>18<212>dna<213>人工序列<400>54cagccgaagggcatgagc18<210>55<211>17<212>dna<213>人工序列<400>55gtgatggccagcgtgga17<210>56<211>20<212>dna<213>人工序列<400>56atagtccaggaggcagccga20<210>57<211>17<212>dna<213>人工序列<400>57tacgtgatggccagcgt17<210>58<211>20<212>dna<213>人工序列<400>58ggacatagtccaggaggcag20<210>59<211>17<212>dna<213>人工序列<400>59gtgatggccagcgtgga17<210>60<211>20<212>dna<213>人工序列<400>60catagtccaggaggcagccg20<210>61<211>18<212>dna<213>人工序列<400>61ctacgtgatggccagcgt18<210>62<211>19<212>dna<213>人工序列<400>62acatagtccaggaggcagc19<210>63<211>25<212>dna<213>人工序列<400>63agcctacgtgatggccagcgtggac25<210>64<211>20<212>dna<213>人工序列<400>64tagtccaggaggcagccgaa20<210>65<211>20<212>dna<213>人工序列<400>65ctcatcatgcagctcaatgc20<210>66<211>19<212>dna<213>人工序列<400>66agctcatcacgcagctcat19当前第1页12