本发明涉及一种颗粒性角膜营养不良ii型核酸检测试剂盒。
背景技术：
颗粒状角膜营养不良(granularcornealdystrophy,gcd)是一组以进行性角膜浑浊，最终导致严重的视力损害的少见的遗传性、双眼对称性、具有组织病理学特征的原发性疾病，中国人群以gcd-ii型最为常见。avellino角膜营养不良(avellinocornealdystrophy,acd)为角膜营养不良的一种，即通常所称的颗粒性角膜营养不良ⅱ型(gcd-ⅱ型)，其多于青少年期发病，双眼角膜中央区出现进行性沉积性颗粒状、杆状或雪花状浑浊，最终导致严重视力损害，早期诊断发现并治疗，防止或延缓视力损害。
目前对引起gcd-ii疾病的基因研究最多的是转化生长因子β诱导蛋白基因(tgfβi)，并发现avellino角膜营养不良疾病与tgfβi基因5q31区域上第4外显子突变有关，突变类型为p.r124h(cgc>cac)。临床数据研究发现，tgfβi基因的p.r124h位点纯合突变造成的角膜营养不良相比于相应的杂合子点突变造成的角膜营养不良，其发病时间更早、症状更加严重，而且行角膜成形术后复发时角膜浑浊的出现速度可能更快，程度更加严重，表明acd疾病的发病可能存在突变剂量累积效应。
携带有avellino角膜不良症突变基因的患者，其角膜在受外伤或者受到紫外线、激光等的刺激后，会出现非正常蛋白质类物质沉积在角膜上，导致患者角膜混浊、视力严重下降，甚至失明。因此，携带有avellino角膜不良遗传突变基因的患者，是绝对禁止进行准分子(包括lasik、lasek或prk等)、半飞秒、飞秒等激光屈光手术。因此，有针对地进行颗粒性角膜营养不良(gcd)ii型核酸的检测对激光屈光手术具有重要意义。
目前，颗粒性角膜营养不良(gcd)ii型核酸检测的方法不多，方法如pcr法、dna芯片法等。其中，pcr方法较为成熟，具有快速、简便、灵敏等特点。由于单重pcr通量不高的局限性，一般在进行pcr反应后还需要做进一步实验才能鉴别gcdii型的野生型和突变型。dna芯片法就是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的dna探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息，但是，dna芯片法步骤繁琐，包括样品中扩增dna的步骤、使扩增的dna与dna芯片杂交的步骤、清洗杂交的dna芯片的步骤等。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中颗粒性角膜营养不良(gcd)ii型核酸检测方法较为繁琐的缺陷，提供一种高通量的颗粒性角膜营养不良ii型核酸检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种颗粒性角膜营养不良ii型核酸检测试剂盒，包括引物gcd124-pf1、引物gcd124-pr1、探针gcd124-w1、探针gcd124-m1、内参引物m-26f、内参引物m-26r、内参探针m-01d；扩增预混液、探针引物预混液、和阴、阳性质控，其中
引物gcd124-pf1的序列5'-3'具体为：agaggccatccctccttct；
引物gcd124-pr1的序列5'-3'具体为：gttgctaggggcgaagatg；
探针gcd124-w1的序列5'-3'具体为：vic-ctccgtgcggtc-mgb；
探针gcd124-m1的序列5'-3'具体为：fam-cggaccacacgg-mgb；
内参引物m-26f的序列5'-3'具体为：ctgacacaactgtgttcactagca
内参引物m-26r的序列5'-3'具体为：gcctcaccaccaacttcat
内参探针m-01d的序列5'-3'具体为：cy5-ccacagggcagtaacggcagact-bhq2
试剂盒中还包括扩增预混液(apmix)、探针引物预混液(ppmix)和阴、阳性质控。其中，扩增预混液(apmix)包括pcr缓冲液、mgcl2、甜菜碱、dntps、taq酶等，探针引物预混液(ppmix)包括引物组合、探针组合等，阴性质控为te缓冲液，阳性质控为gcd124-w和gcd124-m质粒。
gcd124-w质粒序列如下：
ctctctgtcagagaagggagggtgtggttgggctggacccccagaggccatccctccttctgtcttctgctcctgcagccctaccactctcaaacctttacgagaccctgggagtcgttggatccaccaccactcagctgtacacggaccgcacggagaagctgaggcctgagatggaggggcccggcagcttcaccatcttcgcccctagcaacgaggcctgggcctccttgccagctgtgagatgacctccgtctgcccgggggactcttatggggaactgccttacttccccgagggg
gcd124-m质粒序列如下：
ctctctgtcagagaagggagggtgtggttgggctggacccccagaggccatccctccttctgtcttctgctcctgcagccctaccactctcaaacctttacgagaccctgggagtcgttggatccaccaccactcagctgtacacggaccacacggagaagctgaggcctgagatggaggggcccggcagcttcaccatcttcgcccctagcaacgaggcctgggcctccttgccagctgtgagatgacctccgtctgcccgggggactcttatggggaactgccttacttccccgagggg
本发明在荧光定量pcr的平台上结合了一种多重荧光pcr技术，特异性的fam标记的taqman探针对待检测样本进行gcdii型的野生型和突变型检测。pcr多重反应是指在同一个反应中实现两个或更多基因序列的扩增和特异性检测。其中，最常见的类型是两重反应。与单重pcr技术相比，多重pcr技术具有更高的通量、更低的样本用量和试剂用量以及检测更加快捷等明显的优点。
荧光pcr技术的荧光探针现已发展成多种类型，如taqmanmgb探针、beacon探针等。taq-man探针根据其3’端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的taqman探针和taqmanmgb探针。其中，taqmanmgb探针的原理一是在探针的3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子mgb修饰基团，以取代常规可发光的tamra荧光标记，可大大降低本底信号的强度，同时mgb基团可以将探针的tm值提高10℃左右，因此为了获得同样的tm值，mgb探针可以比普通taqman探针设计的更短，既降低了合成成本，大大增加了探针的稳定性，也使得探针设计的成功率大为提高。该方法具有如下优点：(1)容易设计；(2)探针短；(3)提高配对与非配对模板间的tm值差异；(4)高特异性和高准确性；(5)稳定性好；(6)结果重复性好等。
本发明所达到的有益效果是：本发明的试剂盒，可采用多个不同的荧光对多个不同的探针进行标记，能够同时对gcdii型的野生型和突变型进行检测；经过核酸提取和纯化后的检测过程不超过2小时。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明试剂盒检测时gcdii野生型样本检测结果(vic通道)；
图2是本发明试剂盒检测时gcdii突变型样本检测结果(fam通道)；
图3是本发明试剂盒检测时gcdii野生型检测灵敏度(vic通道)；
图4是本发明试剂盒检测时gcdii突变型检测灵敏度(fam通道)；
图5是是本发明试剂盒检测时阳性质控(pc)的扩增曲线。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一种颗粒性角膜营养不良ii型核酸检测试剂盒，包括引物gcd124-pf1、引物gcd124-pr1、内参引物m-26f、内参引物m-26r、探针gcd124-w1、探针gcd124-m1、内参探针m-01d，扩增预混液、探针引物预混液、和阴、阳性质控，其中
1)、引物序列设计如表1所示：
表1.引物序列设计
2)、样本制备：
适用样本为经直肠指检后含前列腺液的初段尿50ml，用适当的方法先获取含有前列腺脱落上皮细胞的尿沉渣，然后提取前列腺脱落上皮细胞dna，可选用含有非离子型去垢剂的细胞裂解液，或柱纯化试剂盒，具体提取方式请参照提取试剂盒说明书，提取的dna体积应在50ul左右，所提dna需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其dnaod260/od280的值应在1.8～2.0，浓度建议在2.5ug/ml-250ug/ml。若浓度低于2.5ug/ml，建议用酒精沉淀浓缩提取的dna，使之浓度符合要求。若浓度高于250ug/ml，应用te予以适当稀释至规定的浓度范围。
3)、仪器
abi7500、nanodrop2000、高速离心机、低速离心机、恒温干浴器、漩涡震荡仪、冰箱。
4)、pcr扩增体系组分
pcr扩增体系组分，见表2所示。
表2：pcr扩增体系组分
5)、检测过程
将2ul提取的样本dna小心加入至对应的pcr反应孔中，封上荧光定量pcr级别的封闭膜或盖上管盖，以2000转/分，离心30秒，以确保反应混合液全部离入管底。为了检验实验操作是否成功以及结果判断，在每次实验时，需设置pc和nc对照。
将pcr管或pcr96孔板按顺序放入pcr仪，根据pcr仪设定表3中的反应程序：
表3pcr扩增程序
表3pcr扩增程序
注：阶段3的退火、延伸及荧光检测程序设置中：荧光检测通道：fam和vic。
运行pcr反应程序，保存文件。
6)、结果判定
(1)质控标准
①阳性对照的测定结果为阳性，且ct≤39.00。
②阴性对照的测定结果为阴性，ct无数值或ct≥42.00。
③扩增曲线应有明显的指数期；基线和指数期应有明显清晰的拐点。
④应同时满足上述3项条件，否则试验无效。
(2)结果判断
①ct无数值或ct≥42.00的标本为阴性。
②ct＜42.00，但扩增曲线无明显的指数期或基线和指数期无明显清晰拐点的标本为阴性。
③ct≤39.00，且扩增曲线有明显的指数期，基线和指数期有明显清晰拐点的标本为阳性。
④39.00＜ct＜42.00的标本建议复测，复测结果ct＜39.00为阳性，否则均为阴性。
试剂盒主要在荧光定量pcr的平台上结合了多重荧光pcr技术、特异性的fam、vic标记的taqmanmgb探针可同时对待检测样本进行hpv6型和hpv11型的检测。
图1是本发明试剂盒检测时gcdii野生型样本检测结果(vic通道)；
从图1可以看出，本发明试剂盒检测gcdii野生型样本时，在vic通道有典型的扩增曲线，ct值＜31，无非特异性扩增，且准确度达到0.5％；
图2是本发明试剂盒检测时gcdii突变型样本检测结果(fam通道)；
从图2可以看出，本发明试剂盒检测gcdii突变型样本时，在fam通道有典型的扩增曲线，ct值＜31，无非特异性扩增，且准确度达到0.5％；
图3是本发明试剂盒检测时gcdii野生型检测灵敏度(vic通道)；
从图3可以看出，将gcdii野生型质粒稀释为1000拷贝/ul、250拷贝/ul、125拷贝/ul，加样2ul，梯度检测，vic通道有典型的扩增曲线，ct值均＜34，无非特异性扩增。
图4是本发明试剂盒检测时gcdii突变型检测灵敏度(fam通道)；
从图4可以看出，将gcdii突变型质粒稀释为1000拷贝/ul、250拷贝/ul、125拷贝/ul，加样2ul，梯度检测，fam通道有典型的扩增曲线，ct值均＜34，无非特异性扩增。
图5是是本发明试剂盒检测时阳性质控(pc)的扩增曲线。
从图5可以看出，本发明试剂盒检测gcdii野生型和突变型阳性质控时，在vic和fam通道有典型的扩增曲线，ct值＜31，无非特异性扩增，且准确度达到0.5％。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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