本发明涉及细胞薄片的制备技术领域，尤其涉及一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法。
背景技术：
年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，amd)是老龄化人群中最常见的致盲性眼病，属于视网膜退行性疾病的范畴，此类疾病的病理基础是视网膜神经元细胞的不可逆性损伤。目前常用的治疗手段：针对渗出性amd的治疗目前有两大类：抗新生血管治疗和视网膜转位手术治疗。然而，前者需要长期使用才能抑制疾病；后者虽然修复了黄斑，但并不能防止疾病复发。针对萎缩性amd目前尚无有效治疗手段。
目前，视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium，rpe)细胞移植为amd患者治疗的新希望，rpe细胞移植是将具有正常结构和功能的rpe细胞移植至病损区，以替代被破坏了的rpe细胞，重建其功能。无论动物研究还是临床手术都发现，通过自体或异体rpe细胞移植来修复病变的rpe细胞均能挽救光感受器变性，不仅能延缓视力的进一步下降，还能促进视力的提高。然而，自体rpe细胞来源困难，数量有限，如何获得充足的低免疫排斥和成瘤性的rpe细胞也是目前亟待解决的问题。
2015年，schwartz等人以hesc-rpe细胞悬液已移植到萎缩性amd和stargardt‘s病患者体内，但细胞存活和视力恢复的程度尚不清楚。2018年，kashani研究团队和cruz研究团队在此基础上分别在sciencetranslationalmedicine和naturebiotechnology都发表了一种hesc-rpe薄片用于amd治疗，并对hesc-rpe薄片的有效性、成瘤性和移植手术的可行性进行了分析说明rpe移植治疗amd是切实可行的。临床i期研究结果都发现hesc-rpe在移植后在视网膜下腔可以很好的存活，且患者视力得到明显的改善。但是，hescs来源的rpe薄片在移植过后机体都会呈现免疫排斥，需长期使用免疫抑制药才能长期维持hesc-rpe存活保持疗效。除此之外，人胚胎干细胞并不是来源于流产的胚胎，也不会对胚胎构成损害，但社会伦理问题始终没有解决。
因此，开发一种新的视网膜色素上皮细胞薄片的制备方法，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
技术实现要素：
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法，以减少视网膜色素上皮细胞移植后的免疫排斥，同时避免社会伦理问题。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法，包括如下步骤：
s1、从病人自身外周血获取自体免疫细胞，经过体外去分化为多功能诱导干细胞；
s2、将步骤s1得到的多功能诱导干细胞经定向诱导分化生成视网膜色素上皮细胞，从而制备得到视网膜色素上皮细胞薄片。
本发明中，作为优选的技术方案，步骤s1中，从病人自身外周血获取自体免疫细胞包括如下步骤：
首先将病人自身外周血利用生理盐水稀释，然后加在淋巴细胞分离液上，室温水平离心，分层；
然后吸取白膜层(即免疫细胞)，洗涤细胞，每次混匀后离心，离心后弃去上清，收集自体免疫细胞。
更详细的说，本发明中，作为优选的技术方案，步骤s1中，从病人自身外周血获取自体免疫细胞，步骤如下：
采集病人自身外周血50ml，用tbd样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，获取自体免疫细胞：
1)将外周血50ml与生理盐水按1:1的比例稀释。将稀释后的血液小心地加在同等体积淋巴细胞分离液上，形成明显分层，室温水平离心1200rpm/min，20min。此时离心管中自上而下形成4层；血清、由免疫细胞构成的白膜层、淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞沉淀层。
2)用吸管小心吸取白膜层，尽量全部吸出免疫细胞。加2倍量生理盐水，洗涤细胞2次，每次混匀后离心、800rpm/min，10min。低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板和淋巴细胞分离液，离心后弃去上清，收集自体免疫细胞。
本发明中，作为优选的技术方案，步骤s1中，将自体免疫细胞体外去分化为多功能诱导干细胞，包括如下步骤：
用rpmi(gibco)培养基得的免疫细胞进行过夜培养后，用分别带有转化因子oct4、sox2、klf4和c-myc的4种慢病毒对细胞进行转染，构建分别带有转化因子oct4、sox2、klf4和c-myc的四种质粒，经测序正确后备用；
采用慢病毒包装试剂盒，将慢病毒包装细胞系293t接种于培养皿中，培养，利用得到的分别带有转化因子oct4、sox2、klf4和c-myc的四种质粒分别转染慢病毒包装细胞系293t，得到重组plent-oct4慢病毒、重组plent-sox2慢病毒、重组plent-klf4慢病毒、重组plent-c-myc慢病毒；
将四种重组慢病毒按等浓度混匀，再将混匀后重组慢病毒感染免疫细胞，培养，得到多功能诱导干细胞。
更详细的说，本发明中，作为优选的技术方案，步骤s1中，将自体免疫细胞体外去分化为多功能诱导干细胞，步骤如下：
1)分别带有转化因子oct4、sox2、klf4和c-myc的4种慢病毒载体的构建
oct4(seqidno.1)、sox2(seqidno.2)、klf4(seqidno.3)和c-myc(seqidno.4)的4种核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司分别合成并插入标准载体puc上，因此命名为puc-oct4、puc-sox2、puc-klf4和puc-c-myc。同时将puc-oct4、puc-sox2、puc-klf4、puc-c-myc和plent-c-gfp载体进行fastdigestasisi(购自thermofisher公司)和fastdigestnoti(购自thermofisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；dna6μg；asisi酶：3μl；noti酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳分别把含有oct4、sox2、klf4、c-mycdna片段和线性化的plent-c-gfpdna片段的琼胶部位切下，放在五个离心管中，采用dnaextractionkit(购自thermofisher公司)将dna从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μldfbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入dfcolumn，并套上collectiontube，8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μlwashbuffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将dfcolumn转移至上另一干净的微量离心管，加入25μlelutionbuffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体分别为纯化的oct4、sox2、klf4、c-mycdna片段和线性化的plent-c-gfpdna片段。
将上述oct4、sox2、klf4、c-mycdna片段分别与线性化的plent-c-gfpdna片段在16℃进行过夜连接形成plent-oct4、plent-sox2、plent-klf4和plent-c-myc四种质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；t4连接酶：1μl；目的基因dna：4μl；线性化的plent-c-gfpdna：4μl。
将上述plent-oct4、plent-sox2、plent-klf4和plent-c-myc四种质粒分别转化到e.coli(dh5α)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体lb培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄lb固体平板。
次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自qiagen公司)提取plent-oct4、plent-sox2、plent-klf4和plent-c-myc四种质粒，具体步骤如下：
a.取1.5ml菌液室温10000g离心1min。
b.去上清，加250μl溶液ⅰ(含rnasea)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。
c.加入250μl溶液ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。
d.加350μl溶液ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000g离心10min。
e.特别小心吸取上清液，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。
f.弃滤过液，加500μlbufferhbc，10000g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证dna的纯度。
h.弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μlwashbuffer清洗吸收柱，10000g离心1min。
i.再加750μlwashbuffer清洗吸收柱。
j.必须将吸收柱10000g离心2min确保乙醇被去除。
k.将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或te缓冲液在滤膜上，10000g离心5min，收集质粒dna。
l.和预知浓度dna样品(marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出plent-oct4、plent-sox2、plent-klf4和plent-c-myc四种质粒浓度分别为367ng/μl、390ng/μl、357ng/μl和457ng/μl。
将上述的plent-oct4、plent-sox2、plent-klf4和plent-c-myc四种质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。
2)四种慢病毒包装、滴度检测
采用lentiviralpackagingkit慢病毒包装试剂盒，具体方法如下：将慢病毒包装细胞系293t接种于含有dmem+10％fbs10cm培养皿中，37℃，5％的co2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染。
将plent-oct4、plent-sox2、plent-klf4和plent-c-myc四种质粒分别按下列组分配制反应体系：无血清dmem：4ml；慢病毒载体质粒：30μg；gmeasytmlentiviralmix：10μl(10μg)；hgtransgenetmreagent：60μl。
混匀后，室温放置20min后，四种反应体系分别均匀滴加到含有293t细胞培养皿中，后置于co2培养箱中培养。
转染24小时后，分别小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有10％血清新鲜的培养基继续培养。
换液48h后，分别吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。此时四种上清液都可以直接去检测病毒滴度。
将上述四种上清液采用tcid50测定病毒滴度，将处于对数生长期的293t细胞以1×104cells/孔的量接种于96孔细胞培养板，样品用5％fbsdmem按10倍倍比稀释系列浓度，加样于96孔细胞中，每个浓度加样10孔，设2孔空白对照。于37℃、5％co2培养，逐日观察细胞出现毒斑情况，一般需要观察5-7天，据出现毒斑的浓度和孔数计算样品的tcid50结果。
3)ips的制备与培养
将4种重组慢病毒按等浓度混匀，再按moi＝20的比例将混匀后重组慢病毒感染免疫细胞，培养24h后，弃旧培养基，加入e8培养基中继续培养，隔天换液，并持续观察细胞形态，14天后，诱导多功能诱导干细胞形成，并用玻璃针挑单克隆至vitronectin包被培养皿里。至于低氧培养箱内，条件为37℃、5％co2，每天更换培养基，显微镜观察细胞形态并拍照。诱导期间第4天出现ips小克隆形态
本发明中，作为优选的技术方案，步骤s2中，多功能诱导干细胞经定向诱导分化生成视网膜色素上皮细胞，包括如下步骤：
用分离液分离鉴定成功诱导多功能诱导干细胞，用移液器吹打细胞，使细胞团变成含有10-20个细胞大小的细胞团；
得到的细胞种植在用0.1％凝胶覆盖的培养皿中，先用原始分化诱导培养基培养，再依序用次级分化诱导培养液半量换液、第三分化诱导培养液半量换液、第四分化诱导培养液半量换液、第五分化诱导培养液半量换液、第六分化诱导培养液隔天半量换液；
培养的细胞开始有色素形成时，换成视网膜色素上皮维持培养液，直至培养成熟。
本发明中，作为优选的技术方案，步骤s2中，各培养液的组分为：
诱导多功能诱导干细胞分离液包括：pbs液，另含有0.25％胰蛋白酶，1mg/m1胶原酶iv，20％ksr(血清代用品)，1mm氯化钙；
原始分化诱导培养基包括：reprostemmedium，reprocel1，另含有10umy-27632，5umsb431542，3umcki-7；
次级分化诱导培养基包括：reproce1l，另含有20％ksr，10umy-27632、5umsb431542，3umcki-7；
第三分化诱导培养基包括：基础培养基，另含有15％ksr，10umy-27632，5umsb431542，3umcki-7；
第四分化诱导培养基包括：基础培养基，另含有10％ksr，10umy-27632，5umsb431542，3umcki-7；
第五分化诱导培养基包括：基础培养基，另含有10％ksr，5umsb431542，3umcki-7；
第六分化诱导培养基包括：基础培养基，另含有10％ksr；
维持培养液包括：包括67％低糖dmem，29％f12，1.9mml-谷氨酰胺，1.9％b-27补充物，96u/m1青霉素钠，96ug/ml硫酸链霉素；
上述，基础培养基包括：gmem培养液，另含有ksr，0.1mmmem非必须氨基酸，1mm丙酮酸钠，0.1m2-巯基乙醇，100u/ml青霉素1000ug/ml链霉素。
更详细的说，本发明中，作为优选的技术方案，多功能诱导干细胞经定向诱导分化生成视网膜色素上皮细胞，步骤如下：
先用分离液分离鉴定成功诱导多功能诱导干细胞；再用reproce11(reprostem培养基)重悬细胞，用移液器吹打细胞，使细胞团变成含有10-20个细胞大小的细胞团。得到的细胞种植在用0.1％凝胶覆盖的培养皿中，用原始分化诱导培养基，在37℃，％co2环境中培养一天(定义为day0)。在day1和day3，用次级分化诱导培养液半量换液。在days5、7、9、用第三分化诱导培养液半量换液。在day11、用第四分化诱导培养液半量换液。在days13、15、17、用第五分化诱导培养液半量换液。从day19开始，用第六分化诱导培养液，隔天半量换液。当培养的细胞开始有色素形成时，细胞培养液开始换成视网膜色素上皮维持培养液(色素细胞成熟期)。之后，用维持培养液每3-4天完全换液(所有的培养基换掉)，直到培养第40天完全成熟。
其中，诱导多功能诱导干细胞分离液包括：pbs液，另含有0.25％胰蛋白酶，1mg/m1胶原酶iv，20％ksr(血清代用品)，1mm氯化钙；
原始分化诱导培养基包括：reprostemmedium，reprocel1，另含有10umy-27632，5umsb431542，3umcki-7；
次级分化诱导培养基包括：reproce1l，另含有20％ksr，10umy-27632、5umsb431542，3umcki-7；
第三分化诱导培养基包括：基础培养基，另含有15％ksr，10umy-27632，5umsb431542，3umcki-7；
第四分化诱导培养基包括：基础培养基，另含有10％ksr，10umy-27632，5umsb431542，3umcki-7；
第五分化诱导培养基包括：基础培养基，另含有10％ksr，5umsb431542，3umcki-7；
第六分化诱导培养基包括：基础培养基，另含有10％ksr；
维持培养液包括：包括67％低糖dmem，29％f12，1.9mml-谷氨酰胺，1.9％b-27补充物，96u/m1青霉素钠，96ug/ml硫酸链霉素；
上述，基础培养基包括：gmem培养液，另含有ksr，0.1mmmem非必须氨基酸，1mm丙酮酸钠，0.1m2-巯基乙醇，100u/ml青霉素1000ug/ml链霉素。
本发明中，作为优选的技术方案，步骤s2中，制备视网膜色素上皮细胞薄片，包括如下步骤：
将聚乙烯对苯二甲酸酯薄膜裁剪成圆形小片，置入transwell板上室底部，乙醇浸泡、并挥发后，加入pbs缓冲液浸泡；
取视网膜色素上皮细胞接种于含有聚乙烯对苯二甲酸酯薄膜的transwell中，孵育后，将薄膜切成小块放在储存液里备用，即为视网膜色素上皮细胞薄片。
更详细的说，本发明中，作为优选的技术方案，制备视网膜色素上皮细胞薄片，步骤如下：
将聚乙烯对苯二甲酸酯薄膜裁剪成直径与24孔板孔径大小一致的圆形小片，置入24孔的transwell板上室底部，75％乙醇浸泡90min后，吸除乙醇，超净台上待乙醇完全挥发，加入pbs缓冲液浸泡两次。
取1×105视网膜色素上皮细胞接种于含有聚乙烯对苯二甲酸酯薄膜的transwell中，在37℃中孵育并每周更换维持培养基两次，待细胞长满膜表面、细胞间形成紧密链接后，使用切割器将薄膜切成6×3mm小块放在储存液里备用。
本发明中，作为优选的技术方案，步骤s2中，所述聚乙烯对苯二甲酸酯薄膜(sterlitech,kent,washington,usa.)，厚度为10μm，孔径为0.4μm。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
本发明rpe来源是病人自身的静脉外周血，经过体外去分化为多功能诱导干细胞，再经定向诱导分化生成视网膜色素上皮细胞，然后移植到病人体内，也就是说：本发明使用的rpe来源于病人自身免疫细胞，然后移植到同一个病人，这样降低病人的免疫排斥反应。除此之外，不存在组织配型和伦理方面的问题；因此，本发明试验在伦理方面和术后的结果，对开展此类临床试验都没有任何障碍。并且，此发明对黄斑病变的治疗有很好的前景。
附图说明
图1为ips小克隆形态图。
图2为对ips细胞相关基因nanog、oct4、sox2和rex1表达量分析图，用hesc细胞的表达量作为阳性参照，ips细胞的表达量与hesc细胞表达量相似，对于阴性参照病人免疫细胞组，细胞的表达量显著提高(p＜0.05)。
图3为rpe细胞形成图，有色素产生。
图4为对rpe细胞相关基因rpe65、cralbp、mertk、best1、pedf和mitf表达量分析图，用ips细胞的表达量作为阴性参照，hrpe细胞的表达量作为阳性参照，对于阴性参照，rpe细胞相关基因表达量上调，与阳性参照细胞的表达量相似，进一步说明ips成功分化为rpe细胞。
图5为视网膜色素上皮细胞薄片上rpe的生长图。细胞长满膜表面且细胞间紧密链接。
图6为培养2周后视网膜色素上皮细胞薄片吞噬光感受器细胞外节图，胞浆内可见荧光素颗粒。
具体实施方式
一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法，包括如下步骤：s1、从病人自身外周血获取自体免疫细胞，经过体外去分化为多功能诱导干细胞；s2、将步骤s1得到的多功能诱导干细胞经定向诱导分化生成视网膜色素上皮细胞，从而制备得到视网膜色素上皮细胞薄片。
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1从病人自身外周血获取自体免疫细胞
从病人自身外周血获取自体免疫细胞包括如下步骤：
首先将病人自身外周血利用生理盐水稀释，然后加在淋巴细胞分离液上，室温水平离心，分层；然后吸取白膜层(即免疫细胞)，洗涤细胞，每次混匀后离心，离心后弃去上清，收集自体免疫细胞。
本实施例的详细步骤为：
采集病人自身外周血50ml，用tbd样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，获取自体免疫细胞：
1)将外周血50ml与生理盐水按1:1的比例稀释。将稀释后的血液小心地加在同等体积淋巴细胞分离液上，形成明显分层，室温水平离心1200rpm/min，20min。此时离心管中自上而下形成4层；血清、由免疫细胞构成的白膜层、淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞沉淀层。
2)用吸管小心吸取白膜层，尽量全部吸出免疫细胞。加2倍量生理盐水，洗涤细胞2次，每次混匀后离心、800rpm/min，10min。低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板和淋巴细胞分离液，离心后弃去上清，收集自体免疫细胞。
实施例2将自体免疫细胞体外去分化为多功能诱导干细胞
将自体免疫细胞体外去分化为多功能诱导干细胞，包括如下步骤：
用rpmi(gibco)培养基得的免疫细胞进行过夜培养后，用分别带有转化因子oct4、sox2、klf4和c-myc的4种慢病毒对细胞进行转染，构建分别带有转化因子oct4、sox2、klf4和c-myc的四种质粒，经测序正确后备用；
采用慢病毒包装试剂盒，将慢病毒包装细胞系293t接种于培养皿中，培养，利用得到的分别带有转化因子oct4、sox2、klf4和c-myc的四种质粒分别转染慢病毒包装细胞系293t，得到重组plent-oct4慢病毒、重组plent-sox2慢病毒、重组plent-klf4慢病毒、重组plent-c-myc慢病毒；
将四种重组慢病毒按等浓度混匀，再将混匀后重组慢病毒感染免疫细胞，培养，得到多功能诱导干细胞。
本实施例中，采用如下详细步骤：
1)分别带有转化因子oct4、sox2、klf4和c-myc的4种慢病毒载体的构建
oct4(seqidno.1)、sox2(seqidno.2)、klf4(seqidno.3)和c-myc(seqidno.4)的4种核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司分别合成并插入标准载体puc上，因此命名为puc-oct4、puc-sox2、puc-klf4和puc-c-myc。同时将puc-oct4、puc-sox2、puc-klf4、puc-c-myc和plent-c-gfp载体进行fastdigestasisi(购自thermofisher公司)和fastdigestnoti(购自thermofisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；dna6μg；asisi酶：3μl；noti酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳分别把含有oct4、sox2、klf4、c-mycdna片段和线性化的plent-c-gfpdna片段的琼胶部位切下，放在五个离心管中，采用dnaextractionkit(购自thermofisher公司)将dna从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μldfbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入dfcolumn，并套上collectiontube，8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μlwashbuffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将dfcolumn转移至上另一干净的微量离心管，加入25μlelutionbuffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体分别为纯化的oct4、sox2、klf4、c-mycdna片段和线性化的plent-c-gfpdna片段。
将上述oct4、sox2、klf4、c-mycdna片段分别与线性化的plent-c-gfpdna片段在16℃进行过夜连接形成plent-oct4、plent-sox2、plent-klf4和plent-c-myc四种质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；t4连接酶：1μl；目的基因dna：4μl；线性化的plent-c-gfpdna：4μl。
将上述plent-oct4、plent-sox2、plent-klf4和plent-c-myc四种质粒分别转化到e.coli(dh5α)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体lb培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄lb固体平板。
次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自qiagen公司)提取plent-oct4、plent-sox2、plent-klf4和plent-c-myc四种质粒，具体步骤如下：
a.取1.5ml菌液室温10000g离心1min。
b.去上清，加250μl溶液ⅰ(含rnasea)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。
c.加入250μl溶液ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。
d.加350μl溶液ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000g离心10min。
e.特别小心吸取上清液，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。
f.弃滤过液，加500μlbufferhbc，10000g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证dna的纯度。
h.弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μlwashbuffer清洗吸收柱，10000g离心1min。
i.再加750μlwashbuffer清洗吸收柱。
j.必须将吸收柱10000g离心2min确保乙醇被去除。
k.将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或te缓冲液在滤膜上，10000g离心5min，收集质粒dna。
l.和预知浓度dna样品(marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出plent-oct4、plent-sox2、plent-klf4和plent-c-myc四种质粒浓度分别为367ng/μl、390ng/μl、357ng/μl和457ng/μl。
将上述的plent-oct4、plent-sox2、plent-klf4和plent-c-myc四种质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。
2)4种慢病毒包装、滴度检测
采用lentiviralpackagingkit慢病毒包装试剂盒，具体方法如下：将慢病毒包装细胞系293t接种于含有dmem+10％fbs10cm培养皿中，37℃，5％的co2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染。
将plent-oct4、plent-sox2、plent-klf4和plent-c-myc四种质粒分别按下列组分配制反应体系：无血清dmem：4ml；慢病毒载体质粒：30μg；gmeasytmlentiviralmix：10μl(10μg)；hgtransgenetmreagent：60μl。
混匀后，室温放置20min后，四种反应体系分别均匀滴加到含有293t细胞培养皿中，后置于co2培养箱中培养。
转染24小时后，分别小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有10％血清新鲜的培养基继续培养。
换液48h后，分别吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。此时四种上清液都可以直接去检测病毒滴度。
将上述四种上清液采用tcid50测定病毒滴度，将处于对数生长期的293t细胞以1×104cells/孔的量接种于96孔细胞培养板，样品用5％fbsdmem按10倍倍比稀释系列浓度，加样于96孔细胞中，每个浓度加样10孔，设2孔空白对照。于37℃、5％co2培养，逐日观察细胞出现毒斑情况，一般需要观察5-7天，据出现毒斑的浓度和孔数计算样品的tcid50结果。结果表明，重组plent-oct4慢病毒的滴度为5.13×106tcid50/ml，重组plent-sox2慢病毒的滴度为5.21×106tcid50/ml，重组plent-klf4慢病毒的滴度为5.34×106tcid50/ml和重组plent-c-myc慢病毒的滴度为4.95×106tcid50/ml。
3)ips的制备与培养
将4种重组慢病毒按等浓度混匀，再按moi＝20的比例将混匀后重组慢病毒感染免疫细胞，培养24h后，弃旧培养基，加入e8培养基中继续培养，隔天换液，并持续观察细胞形态，14天后，诱导多功能诱导干细胞形成，并用玻璃针挑单克隆至vitronectin包被培养皿里。至于低氧培养箱内，条件为37℃、5％co2，每天更换培养基，显微镜观察细胞形态并拍照。诱导期间第4天出现ips小克隆形态，如图1所示。
实施例3ips(多功能诱导干细胞)的鉴定
将实施例2得到的ips细胞传代至第4代后进行荧光定量pcr检测。
本实施例中，具体方法：离心收集ips细胞到ep管中，用rnaisotmplus将细胞裂解提取总rna。将上述ep管放入离心机中4℃,12000rpm离心10min，上清转移到一个新的ep管中，弃沉淀。在上清中加入等体积的氯仿溶液，涡旋震荡，室温静置7min。4℃,12000rpm离心15min，此时ep管中的液体分3层，中间一层白色的为蛋白层，取上层的水相转移到新的ep管中(rna存在于水相中)；加入等体积的异丙醇到转移的上清中，温和的使其混匀，在光下能稍微看到絮状沉淀后室温静置7min；4℃,12000rpm离心10min，弃上清；加入750μl75％的乙醇洗涤，4℃,12000rpm离心5min，重复一次；弃乙醇，真空干燥5min，加入50μl无rnaase水溶解，即获得ips的总rna，放在-20℃冰箱中保存备用。以提取的总rna作模板，primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser合成第一链cdna,具体步骤如：在rna的专区操作，使用depc水处理过的ep管，移液枪。取提取的ips总rna2μl，10mmol/ldntpmix分别和1μloligodtprimer放入的ep管中混匀，在65℃变性5min，取出至于冰上冰浴3min，然后在试管中分别加入加入下列试剂：primescriptrtase(20u/μl)0.5μl，5×primescriptbuffer2μl，rnaaseinhibitor0.25μl，用rnaasefreewater补足10.0μl体积。混匀，42℃1h，72℃10min，16℃10min，取出放于-20℃冰箱保存备用。
rt-qpcr反应体系：20μl反应体系中含10μl
2)rt-qpcr反应程序：95℃预变性5min，95℃变性10s，50℃-60℃(取决于所用引物)退火10s，72℃延伸15s(取决于所扩产物大小)，45个循环。
oct4
forward:tctttccaccaggcccccggctc
reverse:tgcgggcggacatggggagatcc
sox2
forward:agagctagactccgggcgatga
reverse:ttgccttaaacaagaccacgaaa
nanog
forward:ctgagatgcctcacacggag
reverse:tctgtttcttgactgggaccttgtc
rex1
forward:cagatggggcggggatttc
reverse:gaaggacgcttcctgactcc
rt-qpcr仪自动生成熔解曲线。每个样品进行3次重复，用无转录反应模板和无模板作阴性对照。2-△△ct的方法分析在免疫细胞向ips细胞脱分化后基因水平的改变。
本实施例对干细胞相关基因nanog、oct4、sox2和rex1表达量进行比较，用hesc细胞的表达量作为阳性参照，ips细胞的表达量与hesc细胞表达量相似，对于阴性参照病人免疫细胞组，细胞的表达量显著提高(p＜0.05)，结果如图2所示。
实施例4多功能诱导干细胞定向诱导分化生成视网膜色素上皮细胞
多功能诱导干细胞定向诱导分化生成视网膜色素上皮细胞，包括如下步骤：用分离液分离鉴定成功诱导多功能诱导干细胞，用移液器吹打细胞，使细胞团变成含有10-20个细胞大小的细胞团；得到的细胞种植在用0.1％凝胶覆盖的培养皿中，先用原始分化诱导培养基培养，再依序用次级分化诱导培养液半量换液、第三分化诱导培养液半量换液、第四分化诱导培养液半量换液、第五分化诱导培养液半量换液、第六分化诱导培养液隔天半量换液；培养的细胞开始有色素形成时，换成视网膜色素上皮维持培养液，直至培养成熟。
本实施例中，详细的步骤为：先用诱导多功能诱导干细胞分离液分离鉴定成功诱导多功能诱导干细胞；再用reproce11(reprostem培养基)重悬细胞，用移液器吹打细胞，使细胞团变成含有10-20个细胞大小的细胞团。得到的细胞种植在用0.1％凝胶覆盖的培养皿中，用原始分化诱导培养基，在37℃，5％co2环境中培养一天(定义为day0)。在day1和day3，用次级分化诱导培养液半量换液。在days5、7、9、用第三分化诱导培养液半量换液。在day11、用第四分化诱导培养液半量换液。在days13、15、17、用第五分化诱导培养液半量换液。从day19开始，用第六分化诱导培养液，隔天半量换液。当培养的细胞开始有色素形成时(见图3)，细胞培养液开始换成视网膜色素上皮维持培养液(色素细胞成熟期)。之后，用维持培养液每3-4天完全换液(所有的培养基换掉)，直到培养第40天完全成熟。
其中，诱导多功能诱导干细胞分离液包括：pbs液，另含有0.25％胰蛋白酶，1mg/m1胶原酶iv，20％ksr(血清代用品)，1mm氯化钙；
原始分化诱导培养基包括：reprostemmedium，reprocel1，另含有10umy-27632，5umsb431542，3umcki-7；
次级分化诱导培养基包括：reproce1l，另含有20％ksr，10umy-27632、5umsb431542，3umcki-7；
第三分化诱导培养基包括：基础培养基，另含有15％ksr，10umy-27632，5umsb431542，3umcki-7；
第四分化诱导培养基包括：基础培养基，另含有10％ksr，10umy-27632，5umsb431542，3umcki-7；
第五分化诱导培养基包括：基础培养基，另含有10％ksr，5umsb431542，3umcki-7；
第六分化诱导培养基包括：基础培养基，另含有10％ksr；
维持培养液包括：包括67％低糖dmem，29％f12，1.9mml-谷氨酰胺，1.9％b-27补充物，96u/m1青霉素钠，96ug/ml硫酸链霉素；
上述，基础培养基包括：gmem培养液，另含有ksr，0.1mmmem非必须氨基酸，1mm丙酮酸钠，0.1m2-巯基乙醇，100u/ml青霉素1000ug/ml链霉素。
实施例5视网膜色素上皮细胞标志基因的检测
采用rt-qpcr检测视网膜色素上皮细胞特异的基因rpe65、cralbp、mertk、best1、pedf、mitf。
本实施例的具体方法：离心收集视网膜色素上皮细胞到ep管中，用rnaisotmplus将细胞裂解提取总rna。将上述ep管放入离心机中4℃,12000rpm离心10min，上清转移到一个新的ep管中，弃沉淀。在上清中加入等体积的氯仿溶液，涡旋震荡，室温静置7min。4℃,12000rpm离心15min，此时ep管中的液体分3层，中间一层白色的为蛋白层，取上层的水相转移到新的ep管中(rna存在于水相中)；加入等体积的异丙醇到转移的上清中，温和的使其混匀，在光下能稍微看到絮状沉淀后室温静置7min；4℃,12000rpm离心10min，弃上清；加入750μl75％的乙醇洗涤，4℃,12000rpm离心5min，重复一次；弃乙醇，真空干燥5min，加入50μl无rnaase水溶解，即获得rpe的总rna，放在-20℃冰箱中保存备用。以提取的总rna作模板，primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser合成第一链cdna,具体步骤如：在rna的专区操作，使用depc水处理过的ep管，移液枪。取提取的rpe总rna2μl，10mmol/ldntpmix分别和1μloligodtprimer放入的ep管中混匀，在65℃变性5min，取出至于冰上冰浴3min，然后在试管中分别加入加入下列试剂：primescriptrtase(20u/μl)0.5μl，5×primescriptbuffer2μl，rnaaseinhibitor0.25μl，用rnaasefreewater补足10.0μl体积。混匀，42℃1h，72℃10min，16℃10min，取出放于-20℃冰箱保存备用。
rt-qpcr反应体系：20μl反应体系中含10μl
2)rt-qpcr反应程序：95℃预变性5min，95℃变性10s，50℃-60℃(取决于所用引物)退火10s，72℃延伸15s(取决于所扩产物大小)，45个循环。
rpe65：
forward:tccccaatacaactgccact
reverse:ccttggcattcagaatcagg
cralbp：
forward:gagggtgcaagagaaggaca
reverse:tgcagaagccattgatttga
mertk：
forward:tccttggccatcagaaaaag
reverse:catttgggtggctgaagtct
best1：
forward:tagaaccatcagcgccgtc
reverse:tgagtgtagtgtgtatgttgg
mitf：
forward:cccaggcccagctaccttcc
reverse:ggcacgatccccgattcggac
pedf：
forward:gggagcggagcagcgaacag
reverse:ggtccaagcgagggttgccc
rt-qpcr仪自动生成熔解曲线。每个样品进行3次重复，用无转录反应模板和无模板作阴性对照。2-△△ct的方法分析在ips向rpe细胞分化后基因水平的改变。
如图4所示，用ips细胞的表达量作为阴性参照，hrpe细胞的表达量作为阳性参照，对于阴性参照，rpe细胞相关基因表达量上调，与阳性参照细胞的表达量相似，进一步说明ips成功分化为rpe细胞。
实施例6制备视网膜色素上皮细胞薄片
制备视网膜色素上皮细胞薄片，包括如下步骤：
将聚乙烯对苯二甲酸酯薄膜裁剪成圆形小片，置入transwell板上室底部，乙醇浸泡、并挥发后，加入pbs缓冲液浸泡；
取视网膜色素上皮细胞接种于含有聚乙烯对苯二甲酸酯薄膜的transwell中，孵育后，将薄膜切成小块放在储存液里备用，即为视网膜色素上皮细胞薄片。
本实施例中，采用的步骤如下：
将聚乙烯对苯二甲酸酯薄膜裁剪成直径与24孔板孔径大小一致的圆形小片，置入24孔的transwell板上室底部，75％乙醇浸泡90min后，吸除乙醇，超净台上待乙醇完全挥发，加入pbs缓冲液浸泡两次。
取1×105视网膜色素上皮细胞接种于含有聚乙烯对苯二甲酸酯薄膜的transwell中，在37℃中孵育并每周更换维持培养基两次，待细胞长满膜表面、细胞间形成紧密链接后(见图5)，使用切割器将薄膜切成6×3mm小块放在储存液里备用。
其中，所述聚乙烯对苯二甲酸酯薄膜(sterlitech,kent,washington,usa.)，厚度为10μm，孔径为0.4μm。
实施例7视网膜色素上皮细胞薄片吞噬光感受器细胞外节的能力评价
将实施例6得到的视网膜色素上皮细胞薄片培养2周后，对视网膜色素上皮细胞薄片吞噬光感受器细胞外节的能力评价，详细步骤为：
屠宰场获取新鲜猪眼球，分离视网膜光感受器细胞外节(ros)，利用异硫氰酸荧光素(fitc)标记外节，得到fitc-ros；将fitc-ros与聚乙烯对苯二甲酸酯薄膜的细胞37℃的二氧化碳培养箱中共孵育24小时；为了除去细胞外fitc-pos荧光，加入0.2％的台盼蓝溶液(pbs配置)孵育10min；倒置荧光显微镜下观察rpe细胞对fitc-ros的吞噬情况。
实验结果如图6所示，视网膜色素上皮细胞细胞在上聚乙烯对苯二甲酸酯薄膜，培养2周后能吞噬fitc-ros，胞浆内可见荧光素颗粒，且吞噬效果较好。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。
序列表
<110>山东兴瑞生物科技有限公司
<120>利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法
<130>2018
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