本发明属于细胞治疗领域，涉及从废弃的脐带血中分离造血干细胞诱导成dc树突状细胞，用于细胞治疗的一种新用途，特别涉及从脐带血中分离cd34造血干细胞扩大培养后大规模诱导制备树突状细胞方法。
背景技术：
：树突状细胞是由加拿大学者steinman于1973年发现的，是目前所知的功能最强的抗原提呈细胞，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。树突状细胞(dendriticcell,dc)在免疫应答的首要环节—抗原提呈中扮演重要角色，是目前公认的体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞(antigen-presentingcell,apc)。它能激活静息型t细胞，主要参与细胞免疫和t细胞依赖的体液免疫反应，在抗肿瘤免疫应答中起关键作用。倒置相差镜下，树突状细胞悬浮生长，大小不等，形态极不规则，向四周伸出不同数量的粗细不一、形态迥异的胞质突起，有的短而粗，末端呈钝圆的伪足样；有的细而长，形成许多参差不齐的多分支的树枝状，表面呈毛刺样；也有的两者兼有。细胞突起在培养液中不停地摆动或迅速持续地伸缩，致使其方向和形态不断地改变。核大而不规则，常呈扭曲状，有折光和明显搏动。胞质内有致密颗粒，为线粒体；偶有折光性强的脂滴存在。dc的产生分两个阶段：从祖细胞分化为未成熟dc阶段和未成熟dc受外界刺激(如细菌产物、肿瘤细胞裂解物及及各种细胞因子)分化成熟阶段。体内dc起源于多能造血干细胞。按来源其分化途径分为两条：①髓样干细胞在gm-csf因子的刺激下分化为dc，称为髓样dc，也称dcl，与单核细胞和粒细胞有共同的前体细胞；包括朗格汉斯细胞，间皮(或真皮)dcs以及单核细胞衍生的dcs等。②来源于淋巴样干细胞，称为淋巴样dc或浆细胞样dc，即dc2，与t细胞和nk细胞有共同的前体细胞。树突状细胞(dc)尽管数量不足外周血单核细胞的1％，但表面具有丰富的抗原递呈分子(mhc-ⅰ和mhc-ⅱ)、共刺激因子(cd80/b7-1、cd86/b7-2、cd40、cd40l等)和粘附因子(icam-1、icam-2、icam-3、lfa-1、lfa-3等)，是功能强大的专职抗原递呈细胞(apc)。目前对dc亚群及分化的研究主要来源于体外培养的方法，体内天然dc亚群的分类仍有待于进一步研究。dc的发育分为成熟与未成熟阶段，两者具有不同的生物学特征和细胞表型。正常情况下，体内大多数dc细胞处于未成熟阶段，其广泛分布于全身各个外周组织，未成熟dc可表达mhcⅰ/ⅱ类分子、iggfc受体(fcγr)、c3b受体(c3br)和某些toll样受体如tlr2、tlr4及tlr9，高表达吞噬相关受体(fc受体、补体受体、甘露糖受体)，而不表达或低表达共刺激分子和黏附分子(cd14、cd54、cd40、cd80)。未成熟dc摄取、加工处理抗原能力强，而提呈抗原激发免疫应答能力弱。经过抗原摄取、炎性因子活化等一系列过程，dc从未成熟状态转变为成熟细胞，成熟的dc则高表达主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)ⅱ类分子和cd54、cd40、cd80、cd86等共刺激分子和黏附分子，cd83、cd25为成熟dc的特征性标志。其摄取、加工处理抗原能力弱，而提呈抗原、启动免疫应答能力强。dc的成熟过程同时伴有迁徙，在外周组织中摄取抗原后，通过延长树突状突起，改变趋化因子受体表达等方式进入淋巴结及淋巴管中成熟，并激发t细胞反应。dc是一大类重要的专职抗原呈递细胞apc，虽在体内的数量较少，但其抗原提呈能力远强于其他apc。未成熟dc具有极强的内吞能力，通过膜皱缩和形成大囊泡，形成液相内吞作用，可使极低浓度的抗原得到呈递，也可通过受体介导对糖基化抗原进行内吞。被dc摄取的抗原分子经过mhcⅱ类途径处理、加工成为抗原多肽，再以mhcⅱ类分子-抗原肽复合物形式呈递在dc表面，并可以维持较长时间(24～48h)的免疫激发功能。未成熟dc具有吞饮速度快，吞饮量大特点，是体内抗原的主要摄取者。在摄取抗原后，未成熟的dc逐渐向成熟dc转变，并表现出很强的免疫激活能力。dc树突状细胞除提供mhcⅱ类分子-抗原肽复合物的第一信号外，dc细胞还通过其高表达的共刺激分子(cd80/b7-1、cd86/b7-2、cd40等)为t细胞提供充足第二信号，来促进t细胞的激活。并且dc细胞还可以分泌细胞因子促进nk细胞的活化并增强nk细胞毒作用，dc还参与b细胞的生长与分化及抗体生成。dc是体内唯一能激活静息型t细胞产生初次免疫应答的细胞，并且能通过点状放大刺激，激活t细胞增殖。因此，在诱导t细胞活化或耐受过程中，dc发挥着十分重要的作用。dc作为重要的胸腺间质细胞，对t细胞在胸腺中的选择过程起着重要作用。dc表面高表达mhc-ii类分子，双阳性胸腺细胞在tcr重排后识别dc表面的自身mhc分子，通过阳性选择而存活；在阴性选择中，t细胞识别dc表面的自身肽-mhc复合物，经过阴性选择，通过凋亡机制而被淘汰。胸腺中的dc通过与t细胞表达的icam-1、cd40l、cd30和fas相互作用，参与t细胞对自身肽的中枢耐受。dc树突状细胞抗肿瘤免疫流程：①肿瘤相关抗原的摄取与呈递；②激活肿瘤相关抗原特异性t细胞；③引导肿瘤相关抗原特异性t细胞至肿瘤部位，杀灭肿瘤细胞。机体抗肿瘤免疫主要依靠细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxictlymphocyte，ctl)的免疫应答来杀伤肿瘤细胞，而ctl本身并不能识别完整的肿瘤抗原分子，只能通过由mhc分子呈递的肿瘤抗原多肽来识别肿瘤细胞并杀伤。在大部分恶性肿瘤中，肿瘤细胞表面的mhc抗原肽、共刺激分子和黏附分子表达较低，不能有效地诱导t细胞活化，故需要抗原呈递细胞的协同作用。人体内大部分dc处于非成熟状态，表达低水平的共刺激因子和粘附因子，体外激发同种混合淋巴细胞增殖反应的能力较低，但未成熟dc具有极强的抗原吞噬能力，在摄取抗原(包括体外加工)或受到某些因素刺激时即分化为成熟dc，而成熟的dc表达高水平的共刺激因子和粘附因子。dc在成熟的过程中，由接触抗原的外周组织迁移进入次级淋巴器官，与t细胞接触并激发免疫应答。除诱导细胞免疫外，dc还可以增强体液免疫:：一方面，dc通过促进抗原特异性cd4+th的产生，促进抗体生成；另一方面，dc高表达fcr、cr，可使dc膜表面可长时间附着一定量抗原,通过长时间刺激记忆b细胞，使b细胞维持免疫记忆，促进静止b细胞表达b7分子，使其具有抗原提呈功能，通过释放可溶性因子直接调节b细胞生长与分化。dc树突状细胞抗肿瘤的机制如下：①dc树突状细胞可以高表达mhc-ⅰ类和mhc-ⅱ类分子，mhc分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽-mhc分子复合物，并递呈给t细胞，从而启动mhc-i类限制性ctl反应和mhc-ⅱ类限制性的cd4+thl反应。同时，dc还通过其高表达的共刺激分子(cd80/b7-1、cd86/b7-2、cd40等)提供t细胞活化所必须的第二信号，启动了免疫应答。②dc与t细胞结合可大量分泌il-12、il-18激活t细胞增殖，诱导ctl生成，主导th1型免疫应答，利于肿瘤清除；并能够活化nk细胞，激活穿孔素p颗粒酶b和fasl/fas介导的途径增强nk细胞毒作用；③dc分泌趋化因子(chemotacticcytokines，cck)专一趋化初始型t细胞促进t细胞聚集，增强了t细胞的激发。保持效应t细胞在肿瘤部位长期存在，可能通过释放某些抗血管生成物质(如il-12、ifn-γ)及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。上述cck进一步以正反馈旁分泌的方式活化dc，上调il-12及cd80、cd86的表达；同时dc也直接向cd8+t细胞呈递抗原肽，在活化的cd4+t细胞辅助下使cd8+t细胞活化，cd4+和cd8+t细胞还可以进一步通过分泌细胞因子或直接杀伤，增强机体抗肿瘤免疫应答。dc树突状细胞广泛分布于脑以外的全身各脏器，仅占外周血单个核细胞的1％，由于体内数量较少，不能满足科研和临床的需要。所以体外大规模诱导培养dc树突状细胞技术的进步使dc疫苗抗肿瘤治疗成为可能。目前用于治疗的dc树突状细胞多来自骨髓或外周血cd34+造血祖细胞以及外周血单核细胞，其中以单核细胞来源的dc应用最广。获取dc树突状细胞的的方法有；①将来源于骨髓或外周血cd34+造血祖细胞在体外通过scf因子与gm-csf因子和肿瘤坏死因子α共同培养，获得大量dc。②将从外周血中分离的单核细胞在gm-csf因子和il-4共同作用下诱导分化为未成熟dc，并加入肿瘤抗原和肿瘤坏死因子α共同刺激分化为成熟dc。另外，有研究使用脐血来源的单个核细胞制备dc，用脐血单个核细胞，在gm-csf因子、il-4和脐血中的细胞因子作用下分化成未成熟dc，用脐血浆取代肿瘤坏死因子α在较短时间内促进脐血单个核细胞分化成dc，充分利用脐血中富含的细胞因子，减少了重组细胞因子的用量，提供了一个由脐带血制备dc的相对简单、高效的途径。用肿瘤已知的特异性多肽物质作为抗原负载物，靶向性较好，可避免自身免疫反应的发生，较安全。庄志祥等用前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原与前列腺酸性磷酸酶多肽联合致敏自体dc治疗激素难治性前列腺癌，结果明显改善了患者免疫功能，有效激发了特异性t细胞免疫应答，病情得到控制和缓解。用完整肿瘤细胞作为抗原负载dc树突状细胞：经放射线照射灭活的肿瘤细胞、肿瘤细胞反复冻融上清或肿瘤细胞冻融后膜碎片或超声破碎方法制备肿瘤细胞的蛋白提取物直接体内免疫后都只产生极弱的抗肿瘤免疫效应，已极少作为肿瘤疫苗单独用于临床。但如果用它们在体外冲击致敏树突状细胞，这些负载了细胞性肿瘤抗原的树突状细胞瘤苗回输体内，则可产生较强的抗肿瘤疗效。由于目前大多数肿瘤类型尚未明确其特异性肿瘤抗原，且全细胞肿瘤抗原易于获取和制备，在无需明确肿瘤抗原情况下，把全细胞抗原负载于树突状细胞，让树突状细胞去对多种肿瘤抗原进行提取、加工和呈递，从而诱发针对不同抗原决定簇的ctl克隆，不失为方便有效的方法，适合临床应用。抗原基因导入dc树突状细胞：将肿瘤特异性抗原的基因通过病毒载体导入树突状细胞中，让特异性肿瘤抗原在dc树突状细胞内表达，进而刺激激活t细胞。导入的方法主要是通过反转录病毒、腺病毒等。有研究证实，使用携带肿瘤特异性抗原基因的重组病毒转染的dc疫苗诱导ctl能力高于抗原肽或全抗原负载的dc。其原因可能为转染后抗原的表达在dc树突状细胞内部，内源性抗原更有利于dc树突状细胞对抗原的加工。虽然病毒壳蛋白可作为免疫原刺激dc树突状细胞活化，导致病毒特异性免疫应答产生，但病毒与宿主细胞有整合的危险，该方法尚待完善。用肿瘤细胞mrna代替肿瘤抗原刺激树突状细胞，可通过核酸扩增，从来源有限的肿瘤组织中扩增到足够数量的mrna，且可通过差异筛选等方法获得肿瘤细胞特异性表达的肿瘤mrna，用这种经差异筛选的肿瘤mrna冲击树突状细胞，可避免自身抗原刺激树突状细胞诱发自身免疫性疾病的危险，有其独特的应用价值。细胞因子基因导入dc：负载肿瘤抗原刺激dc分泌的il-2、il-12、tnf-α等细胞因子可增强dc树突状细胞诱导的ctl反应。dc树突状细胞的生长也需要多种细胞因子联合刺激，向dc树突状细胞中导入细胞因子或趋化因子的基因，可增强其抗肿瘤效应。曹大勇等使用反复冻融的肝癌细胞冲击致敏导入了il-2基因的dc树突状细胞，诱导出较肝癌细胞致敏dc更高水平的ctl。随着细胞治疗研究的不断深入，人们对dcs细胞如何启动nk细胞活化产生了高度重视。越来越多的研究表明dcs主要通过细胞因子和细胞-细胞接触两种方式诱导nk细胞激活。最初人们认为il-12在nk细胞活化中发挥重要作用，并且il-12可聚集于免疫突触以高浓度方式作用于nk细胞，从而促进nk细胞的激活。在nk细胞的激活过程中有科学家研究发现il-12并不起主要作用，mailliard等人研究发现dcs分泌的ifn-a/ifn-b、il-18和il-15也能促进nk细胞分化增殖、迁移和产生ifn-r及增强nk细胞介导的细胞毒效应。进一步研究发现ifn-a/ifn-b、il-18和il-15可以调节nk细胞nkg2d受体的配体表达，使nk细胞活化，il-18能够增强nk细胞对ccl21敏感性而促进nk向外周淋巴器官迁移，促进nk细胞与dcs接触而使其活化。nucci等研究发现dc分泌的il2也参与nk细胞活化过程。另外，dcs激活nk细胞的另一个重要条件是细胞-细胞之间接触。dcs通过细胞间接触激活nk细胞过程中，除了细胞骨架成分参与外，还需要一些黏附分子的参与。未成熟dc能表达cd48和cd70分子.两者分别能与nk细胞表面受体2b4、cd27结合，诱导nk细胞活化。成熟的dc细胞能上调和下调自身表面的一些分子表达，以供nk细胞受体的结合。jinushi等研究发现，dc在i型ifn的作用下，能够上调其表面micb的表达(micb是nk细胞活化受体nkg2d的配体)，而下调其表面c型凝集素相关分子的表达(c型凝集素相关分子是nk细胞抑制性受体nkr2-p1b和nkr2p1d的配体)，从而增强nk细胞活化信号而减少其抑制信号的活化，从而使nk细胞活化。随着树突状细胞(dc)分离、体外扩增、培养技术的成熟完善，它在感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤防治及移植排斥反应调控等领域的研究蔚然兴起。特别因其在增强机体特异性抗肿瘤免疫能力的重要作用而成为肿瘤生物治疗的研究重点。美国斯坦福大学医学院的以levy为首的研究小组于1996年首次应用抗独特型抗体体外冲击致敏的自体dc树突状细胞过继回输的方法，治疗非何杰金氏b淋巴瘤患者，结果诱导患者产生了显著的细胞与体液免疫反应，经治疗的4例患者中有1例瘤体完全消失，另1例瘤体明显缩小，未见副作用。近几年，国外开展了众多应用树突状细胞(dc)治疗癌症的研究。iadhams等用自体肿瘤细胞负载树突状细胞(dc)治疗不能切除的hcc肝癌细胞取得明显效果。lee等用破裂的hcc肝癌细胞产物负载树突状细胞(dc)治疗晚期hcc肝癌患者，ⅰ期临床试验效果良好。chi等发现常规放疗结合瘤内注射过继免疫树突状细胞(dc)治疗难治性hcc肝癌，呈现出良好的应用前景。kuang等将甲醛固定的自体hcc肝癌细胞负载树突状细胞(dc)后用于预防术后复发的ⅱ期随机临床试验，其效果较对照组显着。nakamoto等将自体外周血获得的树突状细胞(dc)体外扩增后行导管肝动脉栓塞术回输，结果发现dc树突状细胞在瘤体周围及瘤体内部存在达17天之久，并伴有单核细胞及淋巴细胞的浸润，临床并未见任何血清学及自身免疫不良反应的依据，充分证实树突状细胞(dc)回输方案的安全、高效，展现出良好的应用前景。德国学者应用独特型蛋白多肽体外致敏的自体dc树突状细胞，回输治疗了7例多发性骨髓瘤患者。其作法是从多发性骨髓瘤患者血清中分离出独特型蛋白，酶消化降解后用蛋白纯化系统纯化出多肽，然后再用此多肽体外致敏cd34+细胞来源的自体dc树突状细胞，将此类dc树突状细胞给多发性骨髓瘤患者皮下注射，并随后每隔2周皮下注射一次独特型蛋白多肽，连续3次，结果发现在受检查的4例多发性骨髓瘤患者中，有2例血中抗独特型igm和igg抗体的水平分别升高约8倍和12倍，而且还观察到独特型蛋白的特异性t细胞免疫反应，表明该疗法的有效性和临床应用前景。近年来有关dc树突状细胞用于白血病治疗研究的报道较多，鉴于未成熟dc树突状细胞具有一定的吞噬能力，fujii等报道，为了用dc树突状细胞在体外诱导出自体细胞毒t细胞然后用于白血病的免疫治疗，将外周血cd34+细胞用粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)，肿瘤坏死因子(tnf-α)体外培养出dc树突状细胞，这种混合dc群体(包括典型的成熟dc树突状细胞及未成熟的dc树突状细胞)能摄取外源性蛋白抗原—钥孔戚血蓝素(keyholdlimpethemocyanin,klh)并将之提呈给cd4+和cd8+t细胞，诱导出钥孔戚血蓝素(klh)特异性细胞毒性t淋巴细胞。并且他们选择3例急性髓系细胞白血病(aml)患者，将放射性灭活的白血病细胞与dc树突状细胞、t细胞共同孵育后，结果其中2例诱导出能杀伤白血病细胞的自体细胞毒性t淋巴细胞，从而为细胞毒性t淋巴细胞过继免疫治疗奠定基础。marten等采用自体肿瘤细胞冻融抗原脉冲dc树突状细胞制备dc细胞瘤苗的ⅰ、ⅱ期临床实验治疗了15例晚期肾癌患者，结果1例部分缓解，7例病变稳定，7例病变进展，3例迟发型超敏反应(dth)阳性，未见不良反应发生。国内近年围绕树突状细胞(dc)开展的基础性研究亦很多。曹雪涛院士主持国家“863”九五重大项目“基因修饰的抗原提呈细胞系统介导的肿瘤基因治疗研究”。曹雪涛院士在进行抗原致敏的dc治疗晚期大肠癌患者的临床研究，结果显示治疗组的有效率达到46.2％，化疗组的有效率为22.5％。叶胜龙等以黑色素瘤抗原-1(mage-1)、白介素12(il-12)、白介素18(il-18)等基因修饰树突状细胞(dc)在体外诱导出较强的对hcc肝癌细胞特异性杀伤的ctl，这一成果有望作为一种新型瘤苗在hcc肝癌防治中应用。谢斌等证实了酪氨酸蛋白激酶受体(c-met)、e-钙黏蛋白、β-连环蛋白在hcc肝癌细胞侵袭转移中的作用，为将上述蛋白负载树突状细胞(dc)后对肝癌细胞侵袭转移的控制提供了良好思路。大量研究表明：hcc肝癌的免疫治疗利用树突状细胞(dc)递呈肿瘤抗原可明显诱导抗肿瘤的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，临床效果良好且无明显副作用，基于树突状细胞(dc)构建的肿瘤疫苗已经成为理想的治疗肝癌的免疫辅助疗法。庄志祥等用前列腺特异性抗原(前列腺特异性膜抗原)与前列腺酸性磷酸酶多肽联合致敏自体dc树突状细胞治疗激素难治性前列腺癌，结果明显改善了患者免疫功能，有效激发了特异性t细胞免疫应答，病情得到控制和缓解。陆道培等以自体dc树突状细胞联合cik细胞治疗了111例急性白血患者，其中94例完全缓解，5年无病生存概率(dfs)为66％，明显高于单纯化疗或自体造血干细胞移植治疗者；14/16例残留的白血病染色体和(或)基因标记均转阴；3/6例肝脾肿大患者的肝脾和髓外白血病者的髓外肿块均明显缩小甚至消失，而且无病生存至今。青岛市中心医院生物治疗中心采用自体dc树突状细胞和cik细胞联合化疗的方法，成功地治疗了1例晚期肺腺癌，经过一个疗程的治疗，患者颈部淋巴结由核桃大小缩小至花生米大小，治疗结果判定为部分缓解。这种治疗方法弥补了单一的生物治疗对晚期肿瘤有效率较低的缺陷，同时也提高了由于化疗而降低的机体免疫力。dc细胞临床应用产业化的研究与开发，将脐带血或外周血来源的免疫细胞经体外大规模培养扩增后输入癌症患者体内，使其在患者体内发挥抗肿瘤作用。经多年临床研究对比得出，dc细胞治疗广泛适用临床各型肿瘤治疗，对大多肿瘤疗效显著，尤其对恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、各种肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等治疗效果较好。与其它抗肿瘤药物相比，过继免疫疗法可以直接杀伤癌细胞，并且调节和增强机体自身的免疫功能，已成为肿瘤手术、放疗、化疗的重要辅助治疗方法。体内树突状细胞的分布虽然广泛，但数量却极微。如在人外周血单个核细胞中，树突状细胞仅占1％以下，如此微量的树突状细胞，致使树突状细胞在70年代末被确认后，虽以其强有力的抗原提呈功能引起高度重视，但终因细胞数量少，分离培养方法不成熟而给研究带来重重困难，导致一度陷入困境，甚至有些学者对于树突状细胞的研究是否能够深入下去产生了怀疑的态度，乃于80年代中期对树突状细胞的研究转入低谷。直到1992年，steinman实验室首先建立了用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)从小鼠骨髓中大规模培养制备树突状细胞的方法，此后很快成功地利用gm-csf加白细胞介素4(il-4)从人外周血单个核细胞，或用gm-csf加肿瘤坏死因子α(tnf-α)从cd34+造血干细胞中扩增到大量树突状细胞，才使树突状细胞的研究重新进入高潮，并取得突飞猛进的进展。目前临床上获得dc树突状细胞的主要方法是采用肿瘤病人的自体外周血单个核细胞,但存在数量少、抗原递呈能力差等问题。近些年已有文献报道通过一些方法将造血干细胞在体外经过大规模的扩增后，加入特定的细胞因子可以诱导出数量大、功能强的dc树突状细胞，使细胞的大规模生产、储存和临床应用成为可能。而被当做产后废弃物的新鲜脐带血中含有大量的造血干细胞，比起外周血和骨髓中的干细胞具有更强的增殖潜能和分化潜能。徐莉，康自珍，王斌，蔡海波，谭文松，2002年9月在《免疫学杂志》第18卷第5期发表了一篇《两步法从cd34+造血干细胞诱导树突状细胞》，其中公开了研究目的：研究如何从有限的造血干细胞获得大量的树突状细胞(dc)，为进一步研究树突状细胞的生化特性及临床应用提供技术支持。方法利用免疫磁珠法((macs)富集cd34十细胞，先在培养体系中加入flt3配体(fl)、血小板生成素(tpo)及干细胞因子(scf)等细胞因子，然后对富集的细胞进行扩增，扩增后的细胞在gm-csf和il-4的作用下诱导7d，诱导后的细胞用流式细胞仪分析树突状细胞特征性表面标记cdia。结果两步法能够获得大量的dc，在第一步中用tpo/fi/scf/il3/il6来扩增cd34+细胞能获得最多的dc。在相同的培养时间下((3周)，两步法能扩增出274倍的dc，大大的超过了直接诱导的扩增倍数(24倍)。并且，随着培养时间的增长，dc的扩增倍数不断上升。其所采用的技术方案是：1、细胞来源健康产妇分娩以后，立即无菌采取新生儿(加肝素钠20u/ml)脐带血，平均采血量为40-80ml,样品在采集8h内分选，脐血用pbs缓冲液稀释，ficoll(相对密度1.077密度梯度离心，收集界面层单个核细胞(mnc)，洗涤备用。2、cd34+细胞的分离纯化利用吸附单克隆抗体磁珠分离系统(cmacs)进行分离，所用抗cd34+抗体为qbend/10,磁珠为鼠抗人igg1免疫磁珠(miltenyibiotech公司)。标记细胞通过固定于高强度磁场中的minimacs分离柱，洗脱去除cd34-细胞，将分离柱移出磁场，用macs缓冲液冲洗分离柱，收集cd34+细胞。3、cd34+细胞的扩增:cd34+细胞以5x104cells/ml的密度接种于24孔板中，基础培养基为imdm(gibco公司)，添加10％fbs(gibco公司)、2mmol/l谷氨酞氨、100u/ml青霉素、10微克g/ml链霉素和50微摩尔/l二琉基乙醇，于37℃,5％co2饱和湿度的培养箱中培养1-3周。细胞由scf(20ng/ml)，il-3(5ng/ml)，il-6(20ng/ml)，flt3-l(25ng/ml),tpo(10u/ml)构成不同的细胞因子组合进行扩增。树突状细胞的诱导:扩增1-3周以及未扩增过的cd34+细胞以2x105cells/ml的起始密度接种于24孔板中，细胞由gm-csf(50ng/ml)及il-4(20ng/ml)构成的细胞因子组合诱导6-7d。技术实现要素：本发明属于细胞治疗领域，是通过从脐带血中分离cd34造血干细胞扩大培养后诱导制备树突状细胞。主要采用wealthlin细胞处理试剂盒从脐带血中分离有核细胞，然后利用磁珠分离试剂盒从有核细胞中分离得到cd34+造血干细胞，加入扩增培养基对cd34+造血干细胞连续扩增培养31天，扩增过程中收获cd34-细胞，加入诱导培养基对前体细胞进行诱导，从而大规模制备dc树突状细胞。该方法可以大量制备dc树突状细胞，解决了从脐带血中分离单核细胞诱导dc树突状细胞数量少，纯度低的问题。本发明的技术方案是从脐带血中分离cd34造血干细胞扩大培养后大规模诱导制备树突状细胞方法,包括以下步骤：(1)通过wealthlin细胞处理试剂盒分离脐带血，获得足量纯度更高的单核细胞；(2)通过磁珠分离试剂盒对得到的单核细胞进行分离，获得纯度更高的cd34+造血干细胞；(3)使用il-3，scf，flt3，tpo扩增培养基对纯化得到的cd34+造血干细胞进行扩增，每2-3天更换新鲜的扩增培养基，当细胞数量达到传代要求后，将悬浮细胞转移到6cm板，t25瓶，t75瓶，1l培养袋中继续进行培养；(4)从1l培养袋中取出细胞悬液，离心收集细胞，用培养基重悬细胞后加入六孔板中；4-6小时后，吸去悬浮细胞，收集贴壁细胞，加入gm-csf，il-4，flt3诱导培养基进行诱导，隔2-3天半量换液，5天加入cea癌胚抗原，6天加入gm-csf、il-4、tnf-a、flt3、il6、il-1β、pge2诱导培养基进行诱导，隔2-3天半量换液，8-12天收集成熟的树突状细胞。进一步地，所述步骤(1)中，将肝素抗凝的脐带血100ml以2094g离心10min，吸取上层液体，60℃灭活30min，4℃(2851g)离心30min，吸取上清得到血浆备用；将上述步骤中离心剩余的血细胞用与吸取的血浆等体积的生理盐水重悬，将脐带血缓慢加入a液中，然后再倒入b液，缓慢旋转混匀，混匀后将盖子旋松，将混合液室温静置30min，将得到的上清液转移至8-9个干净的50ml离心管中，1210g离心5min，去掉上清液，保留管底的细胞，用生理盐水将管底细胞悬浮合并至一个50ml离心管，将c液分别加入2个新的50ml离心管，每管加入25ml，并将细胞悬液缓慢加入c液中，720g离心20min，使细胞分层，用无菌吸管吸取白膜层细胞，并用生理盐水定容至50ml，1210g离心5min，洗涤细胞3遍；所述a液为细胞保养液，可以为磷酸缓冲液(pbs)；所述b液为红细胞沉淀剂，含0.4％的羧甲基淀粉与0.4％葡萄糖酸钙的水溶液，该水溶液ph7.4；所述c液为泛影酸钠-聚蔗糖400#，含0.3％的泛影酸钠和8％的聚蔗糖400#的水溶液，ph为7。进一步地，所述步骤(2)中，用缓冲液重悬有核细胞，吸取1x108个细胞的悬浮液在离心力300g离心10分钟，完全吸出上清液，加入300ul缓冲液重悬细胞，添加100ul的fcr试剂，100ul的cd34+微珠，充分混合后用锡箔纸包裹，在4℃冰箱中孵育30min，加入10ml的缓冲液进行洗涤，并在离心力300g离心10min，完全吸取上清液，用移液器加入500ul缓冲液重悬细胞；用500ul缓冲液冲洗准备的ms柱子，将使用的细胞液加入到柱子中，收集流过柱子的未标记细胞，用500ul缓冲液冲洗柱子，重复三遍，从分离器上移去柱子，并将其放在适合的收集管上，吸取1ml缓冲液到柱子上，通过将柱塞推进柱子中，快速冲洗出用磁性标签标记的cd34造血干细胞。进一步地，所述步骤(3)中,扩增培养基为lonzax-vivotm15无血清细胞培养基，10％的自体血浆，il-3的使用浓度为20ng/ml，scf的使用浓度为50ng/ml，flt3的使用浓度为50ng/ml，tpo的使用浓度为80ng/ml；所述lonzax-vivotm15无血清细胞培养基为1l，含l-谷氨酰胺，酚红。进一步地，所述步骤(4)中,诱导培养基为lonzax-vivotm15无血清细胞培养基，10％的自体血浆，cea癌胚抗原的使用浓度为2ug/ml，gm-csf的使用浓度为100ng/ml，il-4的使用浓度为50ng/ml，tnf-a的使用浓度为50ng/ml，flt3的使用浓度为50ng/ml，il6的使用浓度为20ng/ml，il-1β的使用浓度为10ng/ml，pge2的使用浓度为1ug/ml；所述lonzax-vivotm15无血清细胞培养基为1l，含l-谷氨酰胺，酚红。与现有技术相比，该方法可以大量制备dc树突状细胞，解决了从脐带血中分离单核细胞诱导dc树突状细胞数量少，纯度低的问题。附图说明图1为dc树突状细胞形态特征图；图2为第0天从脐带血中分离单核细胞进行cd14流式检测；图3第0天从脐带血中分离得到单核细胞进行cd34流式检测；图4第0天利用美天旎磁珠纯化试剂盒从脐带血中分离纯化得到cd34+细胞进行cd34流式检测；图5第0天从脐带血中分离得到单核细胞对dc细胞表面标志物检测；图6从脐带血中分离得到cd34+细胞扩增培养后加入细胞因子诱导10天；图7单核细胞加入细胞因子诱导10天；图8从脐带血中分离得到cd34+细胞扩增培养后加入细胞因子诱导12天；图9单核细胞加入细胞因子诱导12天；图10cd34造血干细胞来源的dc树突状细胞与单核细胞来源的dc树突状细胞表面标志物表达情况统计比较；图11cd34造血干细胞来源的dc树突状细胞与单核细胞来源的dc树突状细胞细胞数对比图。具体实施方式实施例一单核细胞的分离采用wealthlin细胞处理试剂盒分离一份脐带血，获得足量纯度更高的单核细胞，并计数细胞数及细胞存活率。cd34造血干细胞的分离采用美天旎磁珠分选试剂盒对得到的单核细胞进行纯化，获得纯度更高的cd34造血干细胞，并计数细胞及细胞存活率。cd34+造血干细胞的扩增使用il-3，scf，flt3，tpo，自体血浆扩增培养基对纯化得到的cd34造血干细胞进行扩增，每2-3天更换新鲜的il-3，scf，flt3，tpo，自体血浆扩增培养基，当细胞数量达到传代要求后，将悬浮细胞转移到6cm板，t25瓶，t75瓶，1l培养袋中继续进行培养。cd34-细胞的收获及诱导从1l培养袋中取出细胞悬液，细胞计数及细胞存活率后，离心收集细胞，用培养基重悬细胞后加入六孔板中。4-6小时后，吸去悬浮细胞，收集贴壁细胞，加入gm-csf，il-4，flt3诱导培养基进行诱导，隔2-3天半量换液，5天加入cea癌胚抗原，6天加入gm-csf、il-4、tnf-a、flt3、il6、il-1β、pge2、自体血浆诱导培养基进行诱导，隔2-3天半量换液，8-12天收集成熟的树突状细胞。具体操作步骤一.cd34造血干细胞来源的dc树突状细胞诱导培养1.有核细胞的分离(1)将肝素抗凝的脐带血100-135ml以2094g离心10min，吸取上层液体，60℃灭活30min，4℃(2851g)离心30min，吸取上清得到血浆备用；(2)将上述步骤中离心剩余的血细胞用等体积(吸取的血浆体积)的生理盐水重悬；(3)将脐带血缓慢加入a液中；(4)将b液缓慢加入(3)步骤混合液中，缓慢旋转混匀，混匀后将盖子旋松，将混合液室温静置30min；(5)将得到的上清液转移至8-9个干净的50ml离心管中，1210g离心5min；(6)去掉上清液，保留管底的细胞，用生理盐水将管底细胞悬浮合并至一个50ml离心管；(7)将c液分别加入2个新的50ml离心管，每管加入25ml，并将(6)步骤所得液体缓慢加入c液中，720g离心20min，使细胞分层；(8)用无菌吸管吸取白膜层细胞，并用生理盐水定容至50ml，1210g离心5min，洗涤细胞；(9)重复(8)步骤，洗涤细胞2-3遍；(10)计算获得的有核细胞总数，并用苔盼蓝染色计算细胞存活率。2.cd34造血干细胞的分离(1)用缓冲液重悬单核细胞，吸取1x108个细胞的悬浮液在离心力300g离心10分钟，完全吸出上清液；(2)用移液器加入300ul缓冲液重悬细胞；(3)用移液器添加100ul的fcr试剂，100ul的cd34+微珠；(4)充分混合后用锡箔纸包裹，在2-8℃冰箱中孵育30min；(5)加入10ml的缓冲液进行洗涤，并在离心力300g离心10min，完全吸取上清液；(6)用移液器加入500ul缓冲液重悬细胞；(7)用500ul缓冲液冲洗准备的ms柱子；(8)将使用的细胞液加入到柱子中，收集流过柱子的未标记细胞；(9)用500ul缓冲液冲洗柱子，重复三遍；(10)从分离器上移去柱子，并将其放在适合的收集管上；(11)吸取1ml缓冲液到柱子上，通过将柱塞推进柱子中，快速冲洗出用磁性标签标记的cd34造血干细胞；(12)计算获得的cd34造血干细胞总数，并用苔盼蓝染色计算细胞存活率。3.cd34+造血干细胞的扩增(1)将得到的cd34造血干细胞用(20ng/mlil-3，50ng/mlscf，50ng/mlflt3，80ng/mltpo，10％自体血浆)扩增培养基调整至3x105/ml个细胞接种至六孔板中,每孔中接种2.5ml，置于37℃,5％co2培养箱培养；,在培养过程中每12h轻轻晃动六孔板；(2)3-4天当六孔板中的细胞密度达到80-100％的时候，将六孔板中的悬浮细胞吸出，进行细胞计数并用苔盼蓝染色计算细胞存活率，和进行流式cd34指标的检测，然后用(20ng/mlil-3，50ng/mlscf，50ng/mlflt3，80ng/mltpo，10％自体血浆)扩增培养基重悬细胞后按1x106/ml个细胞接种到t25瓶子中，置于37℃、5％co2培养箱培养；(3)3-4天当t25瓶子中的细胞密度达到80-100％的时候，将t25瓶子中的悬浮细胞吸出，进行细胞计数并用苔盼蓝染色计算细胞存活率，和进行流式cd34指标的检测，然后用(20ng/mlil-3，50ng/mlscf，50ng/mlflt3，80ng/mltpo，10％自体血浆)扩增培养基重悬细胞后按1x106/ml个细胞接种到t75瓶子中，置于37℃、5％co2培养箱培养；(4)3-4天当t75瓶子中的细胞密度达到80-100％的时候，将t75瓶子中的悬浮细胞吸出，进行细胞计数并用苔盼蓝染色计算细胞存活率，和进行流式cd34指标的检测，然后用(20ng/mlil-3，50ng/mlscf，50ng/mlflt3，80ng/mltpo，10％自体血浆)扩增培养基重悬细胞后按1x106/ml个细胞接种到1l的gt-t610(a)细胞培养袋中，每天使用显微镜进行观察，隔3天取样进行细胞计数，用苔盼蓝染色计算细胞存活率，和进行流式cd34指标的检测，并进行半量换液，加入新的(20ng/mlil-3，50ng/mlscf，50ng/mlflt3，80ng/mltpo，10％自体血浆)扩增培养基进行培养，连续培养至第31天(表1细胞扩增过程中的细胞计数统计)。cd34-细胞的收获及dc细胞的诱导在扩增第12天后，从gt-t610(a)细胞培养袋中吸出悬浮细胞，进行细胞计数并用苔盼蓝染色计算细胞存活率，按3x106个/ml的接种量接种到六孔板中，每个孔接2.5ml，第二天将悬浮细胞吸去，收集贴壁细胞，加入(100ng/mlgm-csf、50ng/mlil-4和50ng/mlflt3)诱导培养基进行诱导；置于37℃、5％co2培养箱培养；在诱导第3天，对六孔板中的细胞进行半量换液，补加(100ng/mlgm-csf、50ng/mlil-4、50ng/mlflt3)诱导培养基，置于37℃、5％co2培养箱培养；在诱导第5天时，加入癌胚抗原(cea)，置于37℃、5％co2培养箱培养；在诱导第6天时，加入(g100ng/mlgm-csf、50ng/mlil-4、50ng/mltnf-a、50ng/mlflt3、20ng/mlil6、10ng/mlil-1β、1ug/mlpge2，10％自体血浆)诱导培养基进行诱导，隔2-3天半量换液，8-12天收集成熟的树突状细胞，进行细胞计数和苔盼蓝染色计算细胞存活率，并进行流式检测(hla-dr，cd80，cd83，cd86)。二.单核细胞来源的dc树突状细胞的诱导培养1.单核细胞的分离(1)将肝素抗凝的脐带血100-135ml以2094g离心10min，吸取上层液体，60℃灭活30min，4℃(2851g)离心30min，吸取上清得到血浆备用；(2)将上述步骤中离心剩余的血细胞用等体积(吸取的血浆体积)的生理盐水重悬；(3)将脐带血缓慢加入a液中；(4)将b液缓慢加入(3)步骤混合液中，缓慢旋转混匀，混匀后将盖子旋松，将混合液室温静置30min；(5)将得到的上清液转移至8-9个干净的50ml离心管中，1210g离心5min；(6)去掉上清液，保留管底的细胞，用生理盐水将管底细胞悬浮合并至一个50ml离心管；(7)将c液分别加入2个新的50ml离心管，每管加入25ml，并将(6)步骤所得液体缓慢加入c液中，720g离心20min，使细胞分层；(8)用无菌吸管吸取白膜层细胞，并用生理盐水定容至50ml，1210g离心5min，洗涤细胞；(9)重复(8)步骤，洗涤细胞2-3遍；(10)计算获得的有核细胞总数，并用苔盼蓝染色计算细胞存活率。2.dc树突状细胞的诱导(1)将上述得到的单核细胞用无血清培养基重悬，按照:3×106/ml密度接种细胞于六孔板中，并放入细胞培养箱静置3-4小时；(2)细胞贴壁结束后，洗掉上层细胞液，用添加了因子100ng/mlgm-csf、50ng/mlil-4和50ng/mlflt3的无血清培养基培养贴壁细胞，置于37℃、5％co2培养箱培养；(3)在诱导第3天，对六孔板中的细胞进行半量换液，补加(100ng/mlgm-csf，50ng/mlil-4，50ng/mlflt3)诱导培养基，置于37℃、5％co2培养箱培养；(4)在诱导第5天时，加入2ug/ml癌胚抗原(cea)，置于37℃、5％co2培养箱培养；(5)在诱导第6天时，加入(100ng/mlgm-csf、50ng/mlil-4、50ng/mltnf-a、50ng/mlflt3、20ng/mlil6、10ng/mlil-1β、1ug/mlpge2，10％自体血浆)诱导培养基进行诱导，隔2-3天半量换液，8-12天收集成熟的树突状细胞，进行细胞计数和苔盼蓝染色计算细胞存活率，并进行流式检测(hla-dr，cd80，cd83，cd86)。三.cd34造血干细胞来源的dc树突状细胞与单核细胞来源的dc树突状细胞比较图1为dc树突状细胞形态特征图。a是(400x)倒置显微镜下cd34造血干细胞来源的dc树突状细胞形态图，b是(400x)倒置显微镜下单核细胞来源的dc树突状细胞形态图(树突状细胞悬浮或半贴壁生长，大小不等，形态极不规则，向四周伸出不同数量的粗细不一、形态迥异的胞质突起，有的短而粗，末端呈钝圆的伪足样；有的细而长，形成许多参差不齐的多分支的树枝状，表面呈毛刺样；也有的两者兼有)。图2为第0天从脐带血中分离单核细胞进行cd14流式检测，其中图a.p1为流式圈门图b.对照图c.cd14流式检测。图3第0天从脐带血中分离得到单核细胞进行cd34流式检测，其中图a.p3为流式圈门图b.对照图c.cd34流式检测。图4第0天利用美天旎磁珠纯化试剂盒从脐带血中分离纯化得到cd34+细胞进行cd34流式检测，其中图a.p4为流式圈门图b.对照图c.cd34流式检测。图5第0天从脐带血中分离得到单核细胞对dc细胞表面标志物检测，其中图a.cd80流式检测图b.cd83流式检测图c.cd86流式检测图d.hla-dr流式检测。图6从脐带血中分离得到cd34+细胞扩增培养后加入细胞因子诱导10天图a.cd34造血干细胞来源的dc细胞cd80流式检测图b.cd34造血干细胞来源的dc细胞cd83流式检测图c.cd34造血干细胞来源的dc细胞cd86流式检测图d.cd34造血干细胞来源的dc细胞hla-dr流式检测。图7单核细胞加入细胞因子诱导10天图a.单核细胞来源的dc细胞cd80流式检测图b.单核细胞来源的dc细胞cd83流式检测图c.单核细胞来源的dc细胞cd86流式检测图d.单核细胞来源的dc细胞hla-dr流式检测。图8从脐带血中分离得到cd34+细胞扩增培养后加入细胞因子诱导12天图a.cd34造血干细胞来源的dc细胞cd80流式检测图b.cd34造血干细胞来源的dc细胞cd83流式检测图c.cd34造血干细胞来源的dc细胞cd86流式检测图d.cd34造血干细胞来源的dc细胞hla-dr流式检测。图9单核细胞加入细胞因子诱导12天图9.a单核细胞来源的dc细胞cd80流式检测图9.b单核细胞来源的dc细胞cd83流式检测图9.c单核细胞来源的dc细胞cd86流式检测图9.d单核细胞来源的dc细胞hla-dr流式检测。图10cd34造血干细胞来源的dc树突状细胞与单核细胞来源的dc树突状细胞表面标志物表达情况统计比较。图11cd34造血干细胞来源的dc树突状细胞与单核细胞来源的dc树突状细胞细胞数对比图。最终结论样品编号dc1dc2dc3dc4cd34+来源dc细胞2.11×108个1.57×108个1.03×108个9.1×107个单核细胞来源dc细胞1.65×107个1.32×107个1.11×107个7.9×106个当前第1页12