本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种细胞的扩增方法，更具体地说，本发明涉及一种外周血来源nk细胞高效扩增的方法。
背景技术：
nk细胞即自然杀伤细胞(naturalkillercell，nkcell)，属于固有免疫系统，是人体免疫系统的第一道防线。nk细胞属于非吞噬淋巴细胞，胞浆富含穿孔素和颗粒酶，具有识别和溶解肿瘤细胞的功能，其主要来源于骨髓cd34+的淋巴细胞，主要存在与外周血，占外周血淋巴细胞的10％～15％，在外周组织，例如脾脏、肝脏、虹膜等中均有表达。由于nk细胞识别靶细胞无mhc限制性，可以在预先无致敏状态下直接杀伤肿瘤细胞，且在nk细胞发挥免疫效应的同时可产生一系列细胞因子，调节适应性免疫，进而成为连接基体固有免疫和适应性免疫的桥梁。由此可见，nk细胞具有直接杀伤与免疫调节的特性，使其有望成为肿瘤过继性免疫治疗的效应细胞，在肿瘤生物治疗中具有广阔的应用前景。
目前，体外nk细胞扩增系统主要通过3种方法实现，但均存在缺陷：(1)采用k562作为饲养层细胞与外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，pbmc)共培养，可以获得高纯度的nk细胞，但是k562属于白血病肿瘤细胞，作为临床使用安全风险极大；(2)分离得到的pbmc，通过磁珠分选出cd56+细胞，再进行扩增，虽然这种方法能有效扩增高纯度nk细胞，但是此方法生产成本极高、分选后细胞扩增数量不足、不可控因素较多，不适宜临床nk细胞治疗；(3)部分诱导方案nk细胞扩增倍数极低，两周培养后仅扩增十倍左右，无法满足临床需求。
基于现有技术存在的上述缺陷，特提出本申请。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一种操作简单、工艺成本低、安全有效的临床级nk细胞培养扩增技术，本发明具体是采用临床级组合激活剂的方法高效活化、扩增nk细胞。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种外周血来源nk细胞高效扩增的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)抗体包被：
将含人源化her2单抗和cd16单抗的包被液，加入到培养瓶中包被过夜；
(2)外周血液采集及单个核细胞分离：
无菌采集50～80ml外周血液，采用密度梯度离心法收集单个核细胞(pbmc)；
(3)单个核细胞诱导及细胞扩增：
将步骤(2)收集的单个核细胞重悬于lonzax-vivotm15无血清培养基中，调整细胞密度为2×106～3×106/ml，加入第一激活剂，转移至步骤(1)包被过夜的培养瓶内静置接种培养2～4天；然后补加无血清培养基和第二激活剂，置于培养箱内继续静置培养至第5～7天；离心换液，将细胞转移至细胞培养袋内，加入第一扩增完全培养基，再在上述相同的培养条件下继续培养；以后每2～3天根据细胞生长情况向培养袋内添加第二扩增完全培养基；
其中：所述的第一激活剂由cd3单抗、okt432、cd28单抗、il-2、il-7、il-15、il-21、r-inf、以及灭活自体血清组成；
所述的第二激活剂由her2、cd16、okt-432、il-2、il-7、il-15、pha、5％自体灭活血清组成；
所述的第一扩增完全培养基由无血清培养基，il-2，il-7，il-15和自体灭活血清组成；
所述的第二扩增完全培养基由无血清培养基，il-2和自体灭活血清组成；
(4)细胞收集、检测。
经过15～18天的培养，即可收集细胞。
进一步地，上述技术方案步骤(1)所述的包被液中，人源化her2单抗的浓度为1～10μg/ml，cd16单抗的浓度为1～10μg/ml。
优选地，上述技术方案步骤(1)所述的包被液中，人源化her2单抗的浓度为5μg/m，cd16单抗的浓度为5μg/ml。
更进一步地，上述技术方案步骤(3)所述的第一激活剂中各组分的终浓度分别如下：cd3为0.5～2ng/ml，okt432为0.005～0.02ke/ml，cd28为1～10ng/ml，il-2为1000～2000u/ml，il-7为10～50ng/ml，il-15为10～50ng/ml，il-21为10～30ng/ml，r-inf为500～2000u/ml，自体血清为1～10％。
优选地，上述技术方案步骤(3)所述的第一激活剂中各组分的终浓度分别如下：cd3为1ng/ml，okt432为0.01ke/ml，cd28为5ng/ml，il-2为1500u/ml，il-7为30ng/ml，il-15为30ng/ml，il-21为20ng/ml，r-inf为1000u/ml，自体血清为5％。
进一步地，上述技术方案步骤(3)所述的接种培养条件具体为：在37℃、5％二氧化碳培养箱内静置培养。
进一步地，上述技术方案步骤(3)所述的接种培养时间优选为3天。
更进一步地，上述技术方案步骤(3)所述的第二激活剂中各组分的终浓度分别如下：her2为10～100ng/ml，cd16为10～100ng/ml，okt-432为0.005～0.02ke/ml，il-2为1000～3000u/ml，il-7为10～50ng/ml，il-15为10～50ng/ml，pha为10～100μg/ml，自体灭活血清为1～10％。
优选地，上述技术方案步骤(3)所述的第二激活剂中各组分的终浓度分别如下：her2为50ng/ml，cd16为50ng/ml，okt-432为0.01ke/ml，il-2为1500u/ml，il-7为30ng/ml，il-15为30ng/ml，pha为50μg/ml，自体灭活血清为5％。
进一步地，上述技术方案步骤(3)所述的第一扩增完全培养基由无血清培养基，500～2000u/mlil-2，10～50ng/mlil-7，10～50ng/mlil-15和1～10％自体灭活血清组成。
优选地，上述技术方案步骤(3)所述的第一扩增完全培养基由无血清培养基，1000u/mlil-2，30ng/mlil-7，30ng/mlil-15和5％自体灭活血清组成。
进一步地，上述技术方案步骤(3)所述的第二扩增完全培养基由无血清培养基，500～2000u/mlil-2和1～10％自体灭活血清组成。
进一步地，上述技术方案步骤(3)所述的第二扩增完全培养基由无血清培养基，1000u/mlil-2和5％自体灭活血清组成。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过采集外周血液，经过2次诱导培养、2次扩增培养，15～18天即可迅速扩增至100亿以上、纯度达80％的nk细胞。另外，本发明培养方法操作简单，使用临床级细胞因子及抗体，安全可控，具有极大的市场前景和经济价值。
附图说明
图1为本发明实施例1的细胞增殖曲线图；
图2(a)、(b)、(c)、(d)分别为本发明实施例1的细胞在培养第0天、3天、6天、12天的细胞照片；
图3为本发明实施例1的细胞流式检测图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细地说明。以下实施例仅是本发明较佳的实施例，并非是对本发明做其他形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
本实施例的一种外周血来源nk细胞高效扩增的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)抗体包被：包被液配方含5μg/ml人源化her2单抗和5μg/mlcd16单抗，将混合包被液加入t75瓶，每瓶8ml，4℃过夜；
(2)外周血液采集及单个核细胞分离：
a.无菌采集外周血液50ml，将外周血转入无菌50ml离心管内，2500rpm/min，离心10分钟。
b.收集上层血浆，灭活处理后再次3500rpm/min，离心15分钟去除血小板，得到灭活自体血清，转入无菌50ml离心管备用。
c.下层血浆加入生理盐水补齐至原全血量，混匀后采用密度梯度离心法收集单个核细胞(pbmc)，对收集的pbmc计数。
(2)单个核细胞诱导及细胞扩增；
a.吸去t-75瓶内包被液，用生理盐水轻晃培养瓶，吸去生理盐水，洗涤两次；
b.按2×106～3×106/ml细胞数加入lonzax-vivotm15无血清培养基重悬pbmc，并补加cd3单抗、okt432、cd28单抗、il-2、il-7、il-15、il-21、r-inf、以及灭活自体血清进行第一次诱导，按20ml/瓶接种至包被的t-75瓶内，37℃、5％二氧化碳培养箱静置培养，计为第0天；
所述第一激活剂组合终浓度分别为cd31ng/ml、okt4320.01ke/ml、cd285ng/ml、il-21500u/ml、il-730ng/ml、il-1530ng/ml、il-2120ng/ml、r-inf1000u/ml、自体血清为5％；
c.第三天，补加无血清培养基至50ml，进行第二次诱导，补加第二激活剂组合，37℃、5％二氧化碳培养箱静置培养；
所述第二激活剂组合终浓度分别为her250ng/ml、cd1650ng/ml、okt-4320.01ke/ml、il-21500u/ml、il-730ng/ml、il-1530ng/ml、pha50μg/ml、5％自体灭活血清；
d.第六天，离心换液，并将细胞转移至1.5l细胞培养袋内，加入400ml第一扩增完全培养基，37℃、5％二氧化碳培养箱静置培养；
所述第一扩增完全培养基为：无血清培养基、il-21000u/ml、il-730ng/ml、il-1530ng/ml、5％自体灭活血清；
e.以后每2～3天根据细胞生长情况向培养袋内添加第二扩增完全培养基，37℃二氧化碳培养箱静置培养；
所述第二扩增完全培养基包含：无血清培养基、il-21000u/ml以及5％自体灭活血清；
(4)细胞收集、检测；
经过15～18天培养后，即可收集细胞；
a.将培养袋中的细胞分装到若干个50ml离心管中；
b.1200rpm，离心10min，弃上清。收集沉淀细胞至无菌50ml离心管内；
c.加生理盐水重悬细胞至45ml。1200rpm，离心10min，弃上清；
d.用生理盐水重悬细胞，补加2％注射用人血白蛋白混匀后，将细胞悬液转入一次性转移袋内，并补加生理盐水至180～200ml，检查无异物及明显细胞团后，用热合机封口，贴标签，备用。
本实施例收集前取少量细胞悬液用于流式检测、微生物检测、支原体检测、细菌内毒素检测、细胞活率检测、细胞数量检测。
细胞生长过程每隔两天取100μl悬液用细胞计数仪进行计数，如图1所示，细胞生长16天，得到细胞总数约1.3×1010，而50ml血液分离得到的pbmc约6×107，细胞增殖216倍。
流式检测：取培养16天的细胞悬液计数，离心收集细胞，用dpbs缓冲液制备成1×106/ml的细胞悬液，取500μl细胞悬液放于1.5mlep管内，离心后弃上清，沉淀用100μldpbs重悬，分别加入cd3-fitc抗体和cd56-pe抗体各10μl，室温避光孵育30min。加入500μldpbs重悬细胞，1500rpm/min离心7min，沉淀用200μldpbs重悬，流式细胞仪上机检测，检测结果如图3所示；由图3可以看出，收集的细胞中cd56+细胞占比92.14％，其中cd3-cd56+nk细胞约71.95％，cd3+cd56+cik细胞约20.19％。
实施例2
本实施例的一种外周血来源nk细胞高效扩增的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)抗体包被：包被液配方含1μg/ml人源化her2单抗和10μg/mlcd16单抗，将混合包被液加入t75瓶，每瓶8ml，4℃过夜；
(2)外周血液采集及单个核细胞分离：
a.无菌采集外周血液50ml，将外周血转入无菌50ml离心管内，2500rpm/min，离心10分钟。
b.收集上层血浆，灭活处理后再次3500rpm/min，离心15分钟去除血小板，得到灭活自体血清，转入无菌50ml离心管备用。
c.下层血浆加入生理盐水补齐至原全血量，混匀后采用密度梯度离心法收集单个核细胞(pbmc)，对收集的pbmc计数。
(2)单个核细胞诱导及细胞扩增；
a.吸去t-75瓶内包被液，用生理盐水轻晃培养瓶，吸去生理盐水，洗涤两次；
b.按2×106～3×106/ml细胞数加入lonzax-vivotm15无血清培养基重悬pbmc，并补加cd3单抗、okt432、cd28单抗、il-2、il-7、il-15、il-21、r-inf、以及灭活自体血清进行第一次诱导，按20ml/瓶接种至包被的t-75瓶内，37℃、5％二氧化碳培养箱静置培养，计为第0天；
所述第一激活剂组合终浓度分别为cd30.5ng/ml、okt4320.005ke/ml、cd281ng/ml、il-21000u/ml、il-710ng/ml、il-1510ng/ml、il-2110ng/ml、r-inf500u/ml、自体血清为1％；
c.第2天，补加无血清培养基至50ml，进行第二次诱导，补加第二激活剂组合，37℃、5％二氧化碳培养箱静置培养；
所述第二激活剂组合终浓度分别为her210ng/ml、cd1610ng/ml、okt-4320.005ke/ml、il-21000u/ml、il-710ng/ml、il-1510ng/ml、pha10μg/ml、1％自体灭活血清；
d.第六天，离心换液，并将细胞转移至1.5l细胞培养袋内，加入400ml第一扩增完全培养基，37℃、5％二氧化碳培养箱静置培养；
所述第一扩增完全培养基为：无血清培养基、il-2500u/ml、il-710ng/ml、il-1510ng/ml、1％自体灭活血清；
e.以后每2～3天根据细胞生长情况向培养袋内添加第二扩增完全培养基，37℃二氧化碳培养箱静置培养；
所述第二扩增完全培养基包含：无血清培养基、il-2500u/ml以及1％自体灭活血清；
(4)细胞收集、检测；
经过15～18天培养后，即可收集细胞；
e.将培养袋中的细胞分装到若干个50ml离心管中；
f.1200rpm，离心10min，弃上清。收集沉淀细胞至无菌50ml离心管内；
g.加生理盐水重悬细胞至45ml。1200rpm，离心10min，弃上清；
h.用生理盐水重悬细胞，补加2％注射用人血白蛋白混匀后，将细胞悬液转入一次性转移袋内，并补加生理盐水至180～200ml，检查无异物及明显细胞团后，用热合机封口，贴标签，备用。
实施例3
本实施例的一种外周血来源nk细胞高效扩增的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)抗体包被：包被液配方含10μg/ml人源化her2单抗和1μg/mlcd16单抗，将混合包被液加入t75瓶，每瓶8ml，4℃过夜；
(2)外周血液采集及单个核细胞分离：
a.无菌采集外周血液80ml，将外周血转入无菌50ml心管内，2500rpm/min，离心10分钟。
b.收集上层血浆，灭活处理后再次3500rpm/min，离心15分钟去除血小板，得到灭活自体血清，转入无菌50ml离心管备用。
c.下层血浆加入生理盐水补齐至原全血量，混匀后采用密度梯度离心法收集单个核细胞(pbmc)，对收集的pbmc计数。
(2)单个核细胞诱导及细胞扩增；
a.吸去t-75瓶内包被液，用生理盐水轻晃培养瓶，吸去生理盐水，洗涤两次；
b.按2×106～3×106/ml细胞数加入lonzax-vivotm15无血清培养基重悬pbmc，并补加cd3单抗、okt432、cd28单抗、il-2、il-7、il-15、il-21、r-inf、以及灭活自体血清进行第一次诱导，按20ml/瓶接种至包被的t-75瓶内，37℃、5％二氧化碳培养箱静置培养，计为第0天；
所述第一激活剂组合终浓度分别为cd32ng/ml、okt4320.02ke/ml、cd2810ng/ml、il-22000u/ml、il-750ng/ml、il-1550ng/ml、il-2130ng/ml、r-inf2000u/ml、自体血清为10％；
c.第4天，补加无血清培养基至50ml，进行第二次诱导，补加第二激活剂组合，37℃、5％二氧化碳培养箱静置培养；
所述第二激活剂组合终浓度分别为her2100ng/ml、cd16100ng/ml、okt-4320.02ke/ml、il-23000u/ml、il-750ng/ml、il-1550ng/ml、pha100μg/ml、10％自体灭活血清；
d.第六天，离心换液，并将细胞转移至1.5l细胞培养袋内，加入400ml第一扩增完全培养基，37℃、5％二氧化碳培养箱静置培养；
所述第一扩增完全培养基为：无血清培养基、il-22000u/ml、il-750ng/ml、il-1550ng/ml、10％自体灭活血清；
e.以后每2～3天根据细胞生长情况向培养袋内添加第二扩增完全培养基，37℃二氧化碳培养箱静置培养；
所述第二扩增完全培养基包含：无血清培养基、il-22000u/ml以及10％自体灭活血清；
(4)细胞收集、检测；
经过15～18天培养后，即可收集细胞；
i.将培养袋中的细胞分装到若干个50ml离心管中；
j.1200rpm，离心10min，弃上清。收集沉淀细胞至无菌50ml离心管内；
k.加生理盐水重悬细胞至45ml。1200rpm，离心10min，弃上清；
l.用生理盐水重悬细胞，补加2％注射用人血白蛋白混匀后，将细胞悬液转入一次性转移袋内，并补加生理盐水至180～200ml，检查无异物及明显细胞团后，用热合机封口，贴标签，备用。