本发明实施例涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种外泌体的制备方法及含有外泌体的干细胞增殖试剂。
背景技术：
间充质干细胞（mesenchymalstemcell，mscs）是一类具有自我更新和多项分化潜能的多能干细胞，经诱导后可以分化为多种组织和细胞，由于其取材方便和不具有免疫排斥反应，是再生医学中一种较为理想的种子细胞。
脐带间充质干细胞（humanumbilicalmesenchymalstemcells，huc-mscs）作为一种组织来源的间充质干细胞，具有更强的分化潜能和增殖能力。值得注意的是，大量传代培养以后，有些细胞仍能保持其多潜能性，而有些细胞则向特定的方向分化或者开始衰老，即生长速度逐渐变慢，细胞形态也由长梭形变的扁平粗大，进而失去临床上的使用价值，使用于细胞治疗的脐带间充质干细胞数量非常有限。因此，申请人设想，采用一种细胞分泌的成分作为添加物，维持人脐带间充质干细胞的增值和存活，便于维持其功能的正常发挥。
同时，实验室中通常在培养基中添加胎牛血清(fbs)来促进脐带间充质干细胞的生长，但是该方法增加了收获细胞携带病原体、异种抗原的可能性，并常常导致各批细胞间不稳定因素产生。美国fda命令禁止将fbs培养的细胞用于细胞治疗。因此，寻找新的可应用于临床细胞治疗的uc-mscs培养基添加物具有重要的应用价值。
外泌体是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，包括肿瘤细胞在内的几乎所有细胞类型都可以产生并释放外泌体。外泌体可以保护多种生物活性物质在细胞外环境中不被降解和稀释，并且可以促进这些物质通过组织液或血液的远距离输送，同时外泌体膜上特异性的表面配体允许它与受体细胞高效率结合，将生物分子传递给靶细胞。外泌体作为干细胞分泌物中的重要成分之前也有相关报道，但目前还没有将其用于维持大规模细胞扩增。
技术实现要素：
本发明提供一种外泌体的制备方法及含有外泌体的干细胞增殖试剂，通过体外实验证明早代的骨髓间充质干细胞分泌的外泌体与人脐带间充质干细胞共培养可显著促进间充质干细胞的增殖活性及相关功能，是潜在改善大规模细胞培养过程中细胞功能的有效策略。
第一方面，本发明实施例提供了一种外泌体的制备方法，包括：
步骤一、骨髓间充质干细胞上清的制备：将不含外泌体血清的培养基加入到骨髓间充质干细胞中，将其稀释成细胞悬液接种于细胞培养瓶中培养，收取培养后的上清液，进行外泌体的提取；
步骤二、骨髓间充质干细胞外泌体的分离存化：去除所述上清液中的细胞碎片、死细胞和杂质；去除上清液后加入磷酸缓冲盐溶液pbs溶解收集外泌体沉淀，使用无菌滤膜过滤，并将所得的所述外泌体沉淀分装于无菌离心管中，保存备用。
进一步地，所述步骤一，具体包括：
采用2-4代骨髓间充质干细胞，将10ml不含外泌体血清的培养基加入到所述骨髓间充质干细胞中，将其稀释成1×106浓度的细胞悬液接种于25cm3的细胞培养瓶中，置于37℃、5%co2、湿度饱和的培养箱中培养36-72h时收取细胞培养后的上清液，收集达到200ml以上，进行外泌体的提取。
进一步地，所述步骤二，具体包括：
将上清液于4℃、400×g，离心10min，转移上清、除去细胞碎片；4℃、2000×g，离心10min，转移上清、除去死细胞；使用0.22μm的无菌滤膜过滤上清液，去除杂质；4℃120000×g、超速离心150min沉淀外泌体，去除上清液后加入400μlpbs溶解收集外泌体沉淀，最后再使用0.22μm的无菌滤膜过滤，并将所得的所述外泌体沉淀分装于无菌离心管中，-80℃保存备用。
进一步地，在步骤二后，所述方法还包括：
步骤三、通过westernblot方法检测所述骨髓间充质干细胞来源的外泌体标志蛋白cd9和cd81的表达情况，对所述外泌体进行鉴定。
进一步地，所述步骤三，具体包括：
用bca蛋白定量试剂盒测定外泌体蛋白质浓度，并按照30μg的上样量，用pbs补足到32μl，加入8μl的5×sds上样缓冲液混合均匀，煮沸5min；制备浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳sds-page分离胶及5%的浓缩胶；按稳压200v进行浓缩胶和分离胶的电泳；半干转膜法恒压15v转膜1h；取出膜后，用1×pbs’t洗膜5min后加入封闭液，室温缓慢摇动2h（或4℃过夜）；弃去封闭液，用pbs’t洗膜3次，5min/次；加入合适比例稀释的兔抗人cd9、兔抗人cd81的一抗溶液，于4℃过夜孵育；弃去一抗溶液，用pbs’t洗膜3次，5min/次，之后加入合适比例稀释的hrp标记的羊抗兔的二抗溶液，室温缓慢摇动2h；弃去二抗溶液，用pbs’t洗膜3次，5min/次；ecl显色，并在发光凝胶成像系统上曝光检测。
第二方面，本发明实施例还提供了一种含有外泌体的干细胞增殖试剂，包括利用如第一方面中任意一项方法制备的外泌体，以及用于培养人脐带间充质干细胞的基础培养基。
进一步地，所述外泌体在所述基础培养基中的终浓度为20μg/ml。
进一步地，所述含有外泌体的干细胞增殖试剂用于培养人脐带间充质干细胞。
进一步地，所述外泌体是由第2-4代的骨髓间充质干细胞分泌的。
进一步地，所述人脐带间充质干细胞为9-12代的人脐带间充质干细胞。
本发明通过体外实验发现，外泌体具有显著的促进细胞增殖和提高存活率的功能。这为通过外泌体维持大规模培养细胞扩增提供有力支持。
本发明首先通过cck-8试剂盒检测了不同浓度的外泌体作用对人脐带间充质干细胞增殖活性的影响，明确了外泌体对细胞增殖活性的影响。其次，我们进一步确定了外泌体作用后对人脐带间充质干细胞细胞相关功能的影响。
本发明的有益效果如下：
本发明具有明显的优势：第一，骨髓间充质干细胞来源的外泌体可用于维持人脐带间充质干细胞培养过程中的细胞功能，即骨髓间充质干细胞分泌的外泌体具有促进人脐带间充质干细胞增殖存活的作用以及脐带间充质干细胞分泌的外泌体具有维持人脐带间充质干细胞传代培养过程中细胞存活率的作用；第二，外泌体是一种非传统的化学合成的添加物，成分无害、确定且易于吸收，其质量标准更容易控制，将本发明的骨髓间充质干细胞分泌的外泌体用于人脐带间充质干细胞共培养，即将获取的外泌体以固定浓度加入人脐带间充质干细胞生长的常规培养基中，即可正常使用，使用方便；第三，外泌体的性质比较稳定，可放置-80℃环境中长期保存。
附图说明
图1是本发明实施例提供的透射电镜下观察的骨髓间充质干细胞外泌体的基本形态示意图；
图2是本发明实施例提供的westernblot方法检测骨髓间充质干细胞外泌体的标志物cd9和cd81的表达情况示意图；
图3是本发明实施例提供的骨髓间充质干细胞外泌体具有促进人脐带间充质干细胞增殖的作用示意图；
图4是本发明实施例提供的骨髓间充质干细胞外泌体具有加快人脐带间充质干细胞生长周期的作用示意图；
图5是本发明实施例提供的骨髓间充质干细胞外泌体具有促进人脐带间充质干细胞成脂分化的作用的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部结构。
以下实施例中所用的主要材料和来源分别如下：
试剂：b-actin单克隆抗体购自sigma公司；dmem购自gibco公司；胰蛋白酶和胎牛血清购自bi公司；cck-8试剂盒和bca蛋白定量试剂盒，购自碧云天公司；cd9和cd81兔抗人抗体，购自bdpharmingen；hrp标记的羊抗兔二抗；ecl化学发光检测试剂盒，购自北京康维世纪。
实施例一骨髓间充质干细胞外泌体的制备
一、骨髓间充质干细胞上清的制备：
将3代处于生长对数期的骨髓间充质干细胞进行消化，加入适量不含外泌体血清的培养基制成细胞悬液，接种于t25的细胞培养瓶中，待60h时收取细胞培养上清液，收集达到200ml以上，进行外泌体的提取。
二、骨髓间充质干细胞外泌体的分离存化：
将上述收集的上清液于4℃、400×g，离心10min，转移上清、除去细胞碎片；4℃、2000×g，离心10min，转移上清、除去死细胞；使用0.22μm的无菌滤膜过滤上清液进一步去除杂质；4℃120000×g、超速离心150min沉淀外泌体，去除上清液后加入500μlpbs收集底部外泌体沉淀，最后再使用0.22μm的无菌滤膜过滤，以便获得高纯度且安全的外泌体。分装于无菌离心管中，-80℃保存备用，并用bca蛋白定量试剂盒进行外泌体蛋白质浓度进行测定。
三、电镜下观察外泌体的基本形态：
将骨髓间充质干细胞分泌的外泌体取出20μl，加入等量的2%的磷钨酸钠水溶液混合成均匀的细胞悬液。然后，将适量悬液加于铜网上，室温静置5min后，烘干铜网，置于投射镜下拍照，如附图1所示的囊泡状结构。
四、westernblot检测外泌体表面标记蛋白：
将bca测定浓度后的外泌体，按照30μg的上样量，用pbs补足到32μl，加入8μl的5×sds上样缓冲液混合均匀，煮沸5min。制备浓度为12%的sds-page分离胶及5%的浓缩胶；按稳压200v进行浓缩胶和分离胶的电泳；半干转膜法恒压15v转膜1h；取出膜后，用1×pbs’t洗膜5min后加入封闭液，室温缓慢摇动2h（或4℃过夜）；弃去封闭液，用pbs’t洗膜3次，5min/次；加入合适比例稀释的兔抗人cd9、兔抗人cd81的一抗溶液，于4℃过夜孵育；弃去一抗溶液，用pbs’t洗膜3次，5min/次，之后加入合适比例稀释的hrp标记的羊抗兔的二抗溶液，室温缓慢摇动2h；弃去二抗溶液，用pbs’t洗膜3次，5min/次；ecl显色，并在发光凝胶成像系统上曝光检测，如附图2所示，骨髓间充质干细胞外泌体cd9和cd81呈阳性表达。
实施例二人脐带间充质干细胞的分离纯化培养
首先将医院获取的新鲜脐带中的多余的保存液弃掉，倒入75%酒精消毒三分钟后取出脐带，放入加有双抗的生理盐水中反复清洗，去掉表面残留酒精。剪掉结扎部分并废弃，将剩余脐带均匀分成小段进行清洗，反复洗净残留血液，去除脐静脉和脐动脉，剥离wharton胶，将其剪碎至1mm3大小的组织块。根据组织块的量加入适量常规培养基混合均匀后平铺在15cm培养皿中，置于37℃，5%co2且湿度饱和培养箱内培养24h，每皿补加8ml培养液。第5天时补液，第8天时半换液，待细胞融合度达到40%-60%以上后，去掉上清，加生理盐水洗涤两遍后，用0.25%胰酶消化1.5min左右，加终止液吹打收集细胞，离心弃上清后加入新鲜培养基在15cm培养皿中进行传代培养，待细胞融合达80%进行传代扩增。
实施例三细胞功能试验
一、外泌体培养基的制备：
将上述获取的外泌体从-80℃取出解冻后，以终浓度20μg/ml添加入人脐带间充质干细胞的培养基中，搅拌均匀。
二、细胞增殖试验步骤如下
将10代处于生长对数期的人脐带间充质干细胞进行消化，用添加了骨髓间充质干细胞外泌体的人脐带间充质干细胞培养基重悬，按以2×104/孔接种于24孔板，500l/孔，置于37°c，5%co2，95%o2孵箱中培养，设置空白对照组。培养24h后分别取三孔细胞胰酶室温消化2min，分别收集每孔细胞，1200r离心5min，少量培养基重悬，取适量细胞悬液与0.4%台酚蓝溶液以9:1混合均匀，取10l上样于细胞计数板，3分钟内，在倒置显微镜下观察并计数细胞，取三孔细胞数量的平均值为第一组实验数据，之后每隔24h取三孔细胞同上述消化计数、记录试验数据。最后以细胞生长时间（d）为横轴，细胞数量为纵轴绘制细胞生长曲线。如附图3所示，加入人脐带间充质干细胞外泌体后，细胞的生长周期延长，倍增时间缩短。
三、细胞周期试验检测步骤如下：
取p10对数生长期的uc-msc细胞，胰酶室温消化2min，1200rpm离心5min后收集细胞并用加入骨髓间充质干细胞外泌体的培养基重悬制备单细胞悬液、计数，以2×104/孔接种于6孔板，2ml/孔，并设置细胞对照组。置于37°c，5%co2，95%o2孵箱中培养48h后，收集细胞，用细胞周期检测试剂盒作用30min，即可使用流式细胞仪检测细胞周期g1期、g2期和s期。如附图4所示，含有骨髓间充质干细胞外泌体的处理组，细胞周期中s期的比例增加，证明添加骨髓间充质干细胞外泌体与人脐带间充质干细胞共培养，可以加速细胞内dna复制，进一步促进细胞增殖。
四、细胞成脂分化试验步骤如下：
取p10对数生长期的uc-msc细胞，胰酶室温消化2min，1200r离心5min后收集细胞并用完全培养基重悬制备单细胞悬液、计数，调整细胞密度为5×104/ml。取1块6孔板，第一排abc孔分别加入骨髓间充质干细胞外泌体培养基重悬的uc-msc3ml/孔，第二排abc孔分别加入常规培养重悬的uc-msc3ml/孔，置于37℃，5%co2，95%o2孵箱中培养。待各孔细胞融合度达80%时，弃掉原培养液，轻轻加入pbs2ml/孔清洗。弃pbs，第一二排ab孔加入适量浓度的成脂诱导液，3ml/孔；第一二排c孔为对照组，分别加入外泌体培养基和常规培养基3ml，37℃，5%co2，95%o2孵箱中培养。2-3d大半量换液，诱导至21天，镜下可见脂滴。弃培养液，加入适量pbs清洗2遍，4%-10%多聚（中性）甲醛（2ml/孔）室温固定30min，2ml/孔pbs，漂洗2遍，油红（2ml/孔）染色10-20min，75%酒精（2ml/孔）清洗后镜下拍照，结果如附图5所示。从图5可以看出，含有骨髓间充质干细胞外泌体的处理组的镜下可见脂滴明显多于空白对照组，因此可知，骨髓间充质干细胞外泌体具有促进人脐带间充质干细胞成脂分化的作用。
注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。