本发明涉及生物技术领域，具体涉及生产奎尼酸相关的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，包括生产3-脱氢奎尼酸的重组大肠杆菌和生产奎尼酸的重组大肠杆菌。
背景技术：
奎尼酸(quinicacid，qa)，即1,3,4,5-四羟基环己烷1-羧酸，最早从金鸡纳树皮中提取加工获得，又名金鸡纳酸。奎尼酸单体的医药作用不大，但是作为医药中间体合成其他具有特殊活性的药物正在越来越受人们关注。咖啡酰奎尼酸是奎尼酸衍生物的重要大类，广泛存在中草药中，对四氯化碳及巨噬细胞引起的肝损伤具有保护作用；以奎尼酸为手性源能够合成多种药物，如fk-506、esperamicin-a1、镇痛类生物碱(+)-epibatidine50、β-咔啉生物碱manzaminea、利血平等。
目前我国奎尼酸绝大部分全部依赖进口，主要来自于德国的buchlergmbh公司，价格昂贵，达1500rmb/公斤。国外奎尼酸的生产方法主要由化学合成法和酶法化学合成法会产生大量有害物质、收率低、成本高、工艺复杂。酶法是以莽草酸为底物通过酶转化合成奎尼酸，但其工艺不完善，合成成本高，尚不宜大规模生产。
frost等(johnw.frostkmd,timothyl.ward.synthesisofquinicacidfromglucose:america,us5798236a[p].1998)通过删除arod基因，在质粒上引入来自于klebsiellapneumoniaa170-40atcc25597的编码奎尼酸脱氢酶的qad基因，构建产奎尼酸菌株e.coliab2848arod/pkd136/ptw8090a，该菌株能够利用葡萄糖发酵24h产生10.7g/l的奎尼酸。frost等研究构建的大肠杆菌工程菌株虽然可以生产高浓度的奎尼酸，但是如同其他相关的工程菌株一样，其是通过构建多质粒表达系统进行表达生产奎尼酸，多质粒表达系统构建复杂、重组质粒容易丢失而造成遗传不稳定，从而影响产品的产业化应用。
3-脱氢奎尼酸(英语：3-dehydroquinicacid，dhq)是莽草酸途径中第一个形成碳环的中间产物，3-脱氢奎尼酸加氢还原即可生成奎尼酸。但目前鲜有关于生产3-脱氢奎尼酸的方法的报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了生产奎尼酸相关的大肠杆菌(escherichiacoli)重组菌株或由其传代而产生的菌株，其包括直接生产奎尼酸的大肠杆菌(escherichiacoli)重组菌株和生产3-脱氢奎尼酸的大肠杆菌(escherichiacoli)重组菌株，其可降低奎尼酸的生产成本，且具有稳定的遗传特性。
本发明一方面提供生产3-脱氢的大肠杆菌(escherichiacoli)重组菌株qa07，其通过调控3-脱氢奎宁酸脱水酶(arod)和/或接触生长抑制基因(acrb)的表达而获得。
示例性地，重组菌株qa07通过下调大肠杆菌中3-脱氢奎宁酸脱水酶(arod)和/或接触生长抑制基因(acrb)的表达而获得。
示例性地，所述大肠杆菌为大肠杆菌重组菌株wj060，其保藏编号为cgmccno.14602，分类命名为大肠埃希氏菌escherichiacoli，于2017年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
示例性地，重组菌株qa07通过敲除和/或替3-脱氢奎宁酸脱水酶基因(arod)而下调大肠杆菌中3-脱氢奎宁酸脱水酶(arod)的表达，和/或通过敲除和/或替换接触生长抑制基因(acrb)而获得。
优选地，重组菌株qa07通过敲除3-脱氢奎宁酸脱水酶基因(arod)和/或接触生长抑制基因(acrb)而获得。
在本发明的一个具体实施方式中，所述重组菌株qa07通过敲除3-脱氢奎宁酸脱水酶基因(arod)和接触生长抑制基因(acrb)而获得。
优选地，以大肠杆菌重组菌株wj060为出发菌株，先敲除3-脱氢奎宁酸脱水酶基因(arod)，再敲除接触生长抑制基因(acrb)而获得。
在本发明的一个具体实施方式中，所述重组菌株qa07的保藏号为cgmccno.15065，分类命名为大肠埃希氏菌escherichiacoli，于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)。
本发明还提供了一种培养基或发酵液，该培养基或发酵液包含上述重组菌株qa07或由其传代而产生的菌株。
示例性地，所述发酵液为上述重组菌株qa07或由其传代而产生的菌株发酵后的发酵液。
本发明还提供重组菌株qa07的构建方法，其包括如下步骤：
通过同源重组方法，敲除和/或替换3-脱氢奎宁酸脱水酶基因(arod)；以及任选地，敲除和/或替换接触生长抑制基因(acrb)。
示例性地，通过同源重组方法，敲除3-脱氢奎宁酸脱水酶基因(arod)；以及任选地，敲除接触生长抑制基因(acrb)。
优选地，通过同源重组方法，敲除3-脱氢奎宁酸脱水酶基因(arod)和接触生长抑制基因(acrb)。
在本发明的一个具体实施方式中，重组菌株qa07是以大肠杆菌重组菌株wj060为出发菌株，通过依次敲除3-脱氢奎宁酸脱水酶基因(arod)和接触生长抑制基因(acrb)而获得。
在本发明的一个具体实施方式中，重组菌株qa07的构建方法，具体包括如下步骤：
s701：设计引物701，以含有氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒)的质粒为模板进行pcr扩增，得到扩增产物arod；扩增产物arod包含cat-sacb盒以及两端分别是arod起始密码子上游40个碱基序列和arod终止密码子后的40个碱基序列；
s702：将扩增产物arod导入含有pkd46的大肠杆菌wj060后进行同源重组形成大肠杆菌arod-sacb(含有pkd46)，实现在arod插入cat-sacb盒；
s703：设计引物703，以大肠杆菌dsm1576菌液为模板进行pcr扩增，得到扩增产物a；
s704：设计引物704，以大肠杆菌dsm1576菌液为模板进行pcr扩增，得到扩增产物b；
s705：设计引物705，以扩增产物a和扩增产物b为模板进行pcr扩增，得到扩增产物c；
s706：将扩增产物c导入大肠杆菌arod-sacb进行同源重组，得到大肠杆菌qa05；
s707：设计引707，以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒)的质粒为模板进行pcr扩增，得到扩增产物acrb1。扩增产物acrb1包含cat-sacb盒以及两端分别是acrb起始密码子上游40个碱基和acrb终止密码子后的40个碱基；
s708：将扩增产物acrb1导入含有pkd46的大肠杆菌qa05进行同源重组得到大肠杆菌acrb-sacb，实现在acrb插入cat-sacb盒；
s709：设计引物709，以大肠杆菌dsm1576菌液为模板进行扩增，得到扩增产物d；
s710：设计引物710，以大肠杆菌dsm1576菌液为模板进行扩增，得到扩增产物e；
s711：设计引物711，以扩增产物d和扩增产物e为模板进行扩增，得到扩增产物f；
s712：将扩增产物f导入大肠杆菌acrb-sacb进行同源重组得到大肠杆菌acrb；
s713：去掉大肠杆菌acrb中的pkd46质粒得到大肠杆菌qa07。
优选地，在上述步骤s702与步骤s703之间增加步骤s7023：设计引物7023，dna测序验证大肠杆菌arod-sacb；
和/或在上述步骤s706与步骤s707之间增加步骤s7067：设计引物7067，dna测序验证大肠杆菌qa05；
和/或在上述步骤s708与步骤s709之间增加步骤s7089：设计引物7089，dna测序验证大肠杆菌acrb-sacb；
和/或在上述步骤s712与步骤s713之间增加步骤s7123:设计引物7123，dna测序验证大肠杆菌acrb。
示例性地，引物701的序列为：
arod-cat-sacb-s:ggtcatggggttcggtgcctgacaggctgaccgcgtgcaggtgacggaagatcacttc
arod-cat-sacb-a:cccgcaccaatgacgagatcttttacagttacggttttcaatcaaagggaaaactgtcc
示例性地，引物703的序列为：
arod-f：tacctgcgcggctataacac；arod-rm：tcccgccgaaatattattgctttttaccctttctgcacgcgg
示例性地，引物704的序列为：
arod-fm:ccgcgtgcagaaagggtaaaaagcaataatatttcggcggga；arod-r:ggtttgtgtaagtacaccttgtg
示例性地，引物705的序列为：
arod-f：tacctgcgcggctataacac；arod-r:ggtttgtgtaagtacaccttgtg
示例性地，引物707的序列为：
acrb-cat-sacb-s:ctgtcagaattgggtatattggggcaggttgtcgtgaaggaattccctagtgacggaagatcacttc
acrb-cat-sacb-a:agttttccctggtgttggcgcagtattcgcgcaccccggtctagccggggatcaaagggaaaactgtc
示例性地，引物709的序列为：
acrb-f：cggcaaagccaaagtgtcactgatc；acrb-rm：gcggccttagtgattacacgttgtagtcttaacggctcctgtttaagtta
示例性地，引物710的序列为：
acrb-fm：taacttaaacaggagccgttaagactacaacgtgtaatcactaaggccgc；acrb-r：atggaaaaaacttactgacctggac
示例性地，引物711的序列为：
acrb-f：cggcaaagccaaagtgtcactgatc；acrb-r：atggaaaaaacttactgacctggac
示例性地，引物7023的序列为：
arod-1-up：cggtgcctgacaggctgaccgcgt；arod-t-down：gataattagcgcacagagactcacg
示例性地，引物7067的序列为：
arod-f：tacctgcgcggctataacac；arod-r:ggtttgtgtaagtacaccttgtg
示例性地，引物7089的序列为：
acrb-f：cggcaaagccaaagtgtcactgatc；acrb-r：atggaaaaaacttactgacctggac
示例性地，引物7123的序列为：
acrb-f：cggcaaagccaaagtgtcactgatc；acrb-r：atggaaaaaacttactgacctggac
示例性地，在本发明的具体实施例，步骤s21中并不限定质粒的种类，其只要含有氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒)即可。
示例性地，cat-sacb盒的序列如seqidno:2所示。
在本发明的一个具体实施例中，选择含有cat-sacb盒的peasy-cat-sacb质粒为模板。
示例性地，本发明的实施例中，质粒或扩增产物转化或导入细菌中时可选择目前常规的转化法，例如电转化法，化学转化法等。
示例性地，步骤s702中，扩增产物arod通过电转化法导入含有pkd46的重组菌株wj060。
示例性地，通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至重组菌株wj060构建含有pkd46质粒的重组菌株wj060。
示例性地，步骤s706中，扩增产物c通过电转化法导入含有pkd46的大肠杆菌arod-sacb中。
示例性地，步骤s708中，扩增产物acrb1通过电转化法导入含有大肠杆菌qa05中。
示例性地，步骤s712中，扩增产物f通过电转化法导入大肠杆菌acrb-sacb中。本发明还提供上述重组菌株qa07或由其传代而产生的重组菌在生产3-脱氢奎尼酸中的应用。
本发明还提供上述重组菌株qa07或由其传代而产生的重组菌株发酵生产3-脱氢奎尼酸的方法。
示例性地，将重组菌株qa07与重组菌株wj060以任意比例组合后进行发酵生产3-脱氢奎尼酸。
在本发明的一个具体实施例中，重组菌株qa07发酵生产3-脱氢奎尼酸的方法具体包括：
(1)种子培养：配制种子培养基，灭菌冷却。将重组菌株qa07接种到种子培养基中培养形成种子培养液，用于发酵培养基接种；
(2)发酵培养：配制发酵培养基，灭菌冷却。将种子培养液接种于发酵培养基中，有氧发酵培养，得到发酵液。
优选地，在发酵培养时，起始葡萄糖的浓度较高，约为20g/l-100g/l，发酵开始后，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1g/l以下时，开始用浓度为500g/l-600g/l的葡萄糖溶液补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度始终小于1g/l。
本发明还提供了另外一种生产奎尼酸的大肠杆菌重组菌株qa10，其以重组菌株wj060或上述重组菌株qa07为出发菌株进行构建。
示例性地，重组菌株qa10以上述重组菌株qa07为出发菌株进行构建。
重组菌株qa10包含奎尼酸脱氢酶的编码序列。
示例性地，所述奎尼酸脱氢酶的编码序列来源于娄地青霉。
示例性地，重组菌株qa10在乙酸操纵子acka-pta位点整合娄地青霉的奎尼酸脱氢酶的编码序列。所述整合为奎尼酸脱氢酶的编码序列替换了acka-pta基因。
优选地，所述所述重组菌株qa10在乙酸操纵子acka-pta位点整合娄地青霉的奎尼酸脱氢酶基因。
优选地，在所述奎尼酸脱氢酶的编码序列前插入调控元件p4；
优选地，所述奎尼酸脱氢酶的编码序列如seqidno:1所示或其简并序列；所述调控元件p4的序列如seqidno:3所示。
示例性地，重组菌株qa10的保藏号为cgmccno.15066，分类命名为大肠埃希氏菌escherichiacoli，于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)。
本发明还提供上述重组菌株qa10的构建方法，包括如下步骤：
通过同源重组方法，在乙酸操纵子acka-pta位点插入奎尼酸脱氢酶的编码序列。
优选地，所述奎尼酸脱氢酶的编码序列来源于娄地青霉。
优选地，所述奎尼酸脱氢酶的编码序列如seqidno:1所示或其简并序列。
示例性地，所述简并序列与原序列的同源性约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。
在本发明的一个具体实施方式中，在所述奎尼酸脱氢酶的编码序列前插入调控元件p4。优选地，所述调控元件p4的序列如seqidno:3所示。
在本发明的一个具体实施方式中，以重组菌株qa07为出发菌株，重组菌株qa10的构建方法具体包括如下步骤：
s1001：设计引1001，以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒)的质粒为模板进行pcr扩增，得到扩增产物acka-pta1。扩增产物acka-pta1包含cat-sacb盒以及两端分别是acka起始密码子上游40个碱基和pta终止密码子后的40个碱基；
s1002：将扩增产物acka-pta1导入含有pkd46的大肠杆菌qa07进行同源重组得到大肠杆菌acka-pta-sacb，实现在acka-pta前插入cat-sacb盒；
s1003：设计引物1003，以大肠杆菌dsm1576菌液为模板进行扩增，得到扩增产物g；
s1004：设计引物1004，以peasy-qutb2为模板进行扩增，得到扩增产物h(扩增产物h中含有调控元件p4)；
s1005：设计引物1005，以大肠杆菌dsm1576菌液为模板进行扩增，得到扩增产物i；
s1006：设计引物1006，以扩增产物g、h和i为模板进行扩增，得到扩增产物j；
s1007：将扩增产物j导入大肠杆菌acka-pta-sacb进行同源重组得到大肠杆菌acka-pta-sacb2；
s1008：去掉大肠杆菌acka-pta-sacb2中的pkd46质粒得到重组大肠杆菌qa10。
上述重组大肠杆菌qa10的构建过程中，可任选地，对重组大肠杆菌acka-pta-sacb、acka-pta-sacb2进行dna测序验证。
示例性地，引物1001的序列为：
2-acka-pta-cat-sacb-s:ctgacgtttttttagccacgtatcaattataggtacttcctcctggtgtccctgttgatacc
2-acka-pta-cat-sacb-a:ttcagatatccgcagcgcaaagctgcggatgatgacgagaatagatacatcagagcttttacgag
示例性地，引物1003的序列为：
acka-pta-f：cctgcatgggtaaacttaaggcg；acka-pta-rm1：tctcttgtcaacaccgccagagataaggaagtacctataattgatacgtggc
示例性地，引物1004的序列为：
acka-pta-fm1：gccacgtatcaattataggtacttccttatctctggcggtgttgacaagaga
acka-pta-rm2：cgcaaagctgcggatgatgacgagatagcataaccccttggggcctctaaac
示例性地，引物1005的序列为：
acka-pta-fm2：gtttagaggccccaaggggttatgctatctcgtcacatccgcagctttgcg；acka-pta-r：gatgatgccaacggctgtcc
示例性地，引物1006的序列为：
acka-pta-f：cctgcatgggtaaacttaaggcg；acka-pta-r：gatgatgccaacggctgtcc
示例性地，验证acka-pta-sacb菌株的引物1021的序列为：
acka-1-up：atgtcggtgtcatcatgc；pta-t-down：cggttcagatatccgcag
示例性地，验证acka-pta-sacb2菌株的引物1022的序列为：
w-promoter-s：ttatctctggcggtgttg；pta-t-down：cggttcagatatccgcag
示例性地，在本发明的具体实施例中，并不限定质粒的种类，其只要含有氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒)即可。
示例性地，cat-sacb盒的序列如seqidno:2所示，调控元件p4的序列如seqidno:3所示。
在本发明的一个具体实施例中，选择含有cat-sacb盒的peasy-cat-sacb质粒为模板。
示例性地，本发明的实施例中，质粒或扩增产物转化或导入细菌中时可选择目前常规的转化法，例如电转化法，化学转化法等。
本发明还提供上述重组菌株qa10或由其传代而产生的重组菌在生产奎尼酸中的应用。
本发明还提供上述重组菌株qa10或由其传代而产生的重组菌发酵生产奎尼酸的方法。
示例性地，将重组菌株wj060、上述重组菌株qa07、上述重组菌株qa10组成的组，以任意的单菌株，或任意的两种菌株以任意比例组合，或三种菌株以任意比例组合进行发酵。
本发明还提供重组菌株qa10或由其传代而产生菌株的培养物或其加工物，例如发酵液，培养基，冻干粉以及重组菌株qa10与其他菌株混合培养的发酵液、培养基、冻干粉等。
在本发明的一个具体实施例中，重组菌株qa10发酵生产奎尼酸的方法具体包括：
(1)种子培养：配制种子培养基，灭菌冷却。将重组菌株qa10接种到种子培养基中培养形成种子培养液，用于发酵培养基接种；
(2)发酵培养：配制发酵培养基，灭菌冷却。将种子培养液接种于发酵培养基中，有氧发酵培养，得到发酵液。
优选地，在发酵培养时，起始葡萄糖的浓度较高，约为20g/l-100g/l，发酵开始后，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1g/l以下时，开始用浓度为500g/l-600g/l的葡萄糖溶液补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度始终小于1g/l。
本发明还提供包含重组菌株wj060、上述重组菌株qa07、重组菌株qa10组成的组，或由其传代而产生的菌株的培养物或其加工物。
本发明提供了生产3-脱氢奎尼酸的大肠杆菌重组菌株重组菌株qa07和发酵生产奎尼酸的重组菌株qa10，其在有氧条件下，均可以利用葡萄糖无机盐培养基进行发酵，降低了培养基成本，从而降低了3-脱氢奎尼酸和奎尼酸的生产成本。且发酵生产的3-脱氢奎尼酸可通过简单的加氢反应即可生产奎尼酸，因此为奎尼酸的工业化生产提供了理论基础，且上述重组菌株均不含质粒，遗传性稳定。
附图说明
图1为本发明实施例提供的大肠杆菌中3-脱氢奎尼酸的生物合成途径(glucose：葡萄糖；e4p：赤藓糖-4-磷酸；pep：磷酸烯醇式丙酮酸；pyr：丙酮酸；dahp：3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸；dhq：3-脱氢奎宁酸；dhs：3-脱氢莽草酸；shikimate：莽草酸；qa：奎宁酸；pykaf:丙酮酸激酶；tkta:转酮醇酶；galp：半乳糖mfs转运蛋白；glk：葡萄糖激酶；ptsi：磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶i；pgi：葡萄糖-6-磷酸异构酶；arof：3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶；arob：3-脱氢奎宁酸合成酶；arod：3-脱氢奎宁酸脱水酶；aroe：3-脱氢莽草酸脱氢酶；qutb：奎尼酸脱氢酶)。
图2为本发明实施例中含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb的质粒peasy-cat-sacb结构示意图。
图3为本发明实施例中含娄地青霉的奎尼酸脱氢酶基因qutb2的质粒peasy-qutb2。
图4为本发明实施例中大肠杆菌重组菌株qa07大规模发酵生产3-脱氢奎尼酸的结果图。
图5为本发明实施例中大肠杆菌重组菌株qa10大规模发酵生产奎尼酸的结果图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请中的关于各种酶的简称，例如：arod即可以代表3-脱氢奎宁酸脱水酶的基因，也可代表3-脱氢奎宁酸脱水酶，具体所代表的含义依据上下文理解。
另外，本发明提供的重组菌株qa10，并不必须以wj060为出发菌株，也可以其他的可以生产3-脱氢酶莽草酸的大肠杆菌为出发菌株，通过基因重组，对3-脱氢奎宁酸脱水酶(arod)、接触生长抑制基因(acrb)、奎尼酸脱氢酶基因qutb2等的表达进行改造，以及插入调控元件，改变酶起始密码子等方式进行构建。
下面结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1大肠杆菌重组菌株qa05的构建
以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，如seqidno:2所示)的质粒peasy-cat-sacb(如图2所示)为模板，使用引物701arod-cat-sacb-s/arod-cat-sacb-a扩增第一步同源重组的片段arod1。引物701的序列为：
arod-cat-sacb-s:ggtcatggggttcggtgcctgacaggctgaccgcgtgcaggtgacggaagatcacttc
arod-cat-sacb-a:cccgcaccaatgacgagatcttttacagttacggttttcaatcaaagggaaaactgtcc
扩增体系：5×transstarttmfastpfubuffer10μl、dntps(2.5mmol/l每个dntp)4μl、dna模板1μl(20-50ng)、正向引物(10μmol/l)2μl、反向引物(10μmol/l)2μl、100％dmso1μl、transstarttmfastpfudnapolymerase(2.5u/μl)1μl、去离子水29μl，总体积50μl。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的arod1产物包含cat-sacb盒(图2)以及两端分别是arod起始密码子上游40个碱基和arod终止密码子后的40个碱基。
将获得的arod1这个扩增产物通过电转化法导入含有pkd46的大肠杆菌重组菌株wj060(保藏编号为cgmccno.14602，于2017年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)后进行同源重组，实现在arod插入cat-sacb盒。具体过程如下：
通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌wj060；将arod1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌wj060。电转条件为：首先准备含有pkd46的大肠杆菌dsm1576的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50-100ngarod1片段，冰上放置2分钟，转移至0.2em的bio-rad电转杯。使用micropulser(bio-rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mllb液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15ml试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μl孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的lb固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落pcr扩增及dna测序验证。pcr扩增及dna测序引物7023为：
arod-1-up：cggtgcctgacaggctgaccgcgt；arod-t-down：gataattagcgcacagagactcacg
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌arod-sacb(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
以大肠杆菌dsm1576菌液为模板，使用引物703arod-f/arod-rm进行扩增，得到片段a。使用引物arod-fm/arod-r，以大肠杆菌dsm1576菌液为模板扩增片段b。使用引物705arod-f/arod-r，以片段a和片段b为模板，扩增片段得到c。
引物703序列为：
arod-f：tacctgcgcggctataacac；arod-rm：tcccgccgaaatattattgctttttaccctttctgcacgcgg
引物704序列为：
arod-fm:ccgcgtgcagaaagggtaaaaagcaataatatttcggcggga；arod-r:ggtttgtgtaagtacaccttgtg
引物705序列为：
arod-f：tacctgcgcggctataacac；arod-r:ggtttgtgtaagtacaccttgtg
扩增体系：5×transstarttmfastpfubuffer10μl、dntps(2.5mmol/l每个dntp)4μl、dna模板1μl(20-50ng)、正向引物(10μmol/l)2μl、反向引物(10μmol/l)2μl、100％dmso1μl、transstarttmfastpfudnapolymerase(2.5u/μl)1μl、去离子水29μl，总体积50μl。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
获得的扩增产物c电转至大肠杆菌arod-sacb。
电转条件为：首先准备大肠杆菌arod-sacb的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50-100ngc片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的bio-rad电转杯。使用micropulser(bio-rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mllb液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15ml试管中，放置在37℃、200rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株arod-sacb2。
去掉重组菌株arod-sacb2中的pkd46质粒。pkd46质粒是温敏型的，其通过提高生长温度到37℃，传代培养即可去除。也可采用常规的质粒去除方法，例如十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、紫外线处理等。本实施例采用提高生长温度去除pkd46质粒。
取300μl重组菌株arod-sacb2菌液(不含pkd46质粒)转接到30ml含10％蔗糖、没有氯化钠的lb液体培养基中37℃，250rpm过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的lb平板，37℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落pcr扩增及dna测序验证。pcr扩增及dna测序引物7067为：
arod-f：tacctgcgcggctataacac；arod-r:ggtttgtgtaagtacaccttgtg
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌qa05，用于下一轮菌种构建的出发菌。
实施例2大肠杆菌重组菌株qa07的构建
以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，如seqidno:2所示)的质粒peasy-cat-sacb(如图2所示)为模板，使用引物707acrb-cat-sacb-s/acrb-cat-sacb-a扩增第一步同源重组的片段acrb1。引物707序列为：
acrb-cat-sacb-s:ctgtcagaattgggtatattggggcaggttgtcgtgaaggaattccctagtgacggaagatcacttc
acrb-cat-sacb-a:agttttccctggtgttggcgcagtattcgcgcaccccggtctagccggggatcaaagggaaaactgtc
扩增体系：5×transstarttmfastpfubuffer10μl、dntps(2.5mmol/l每个dntp)4μl、dna模板1μl(20-50ng)、正向引物(10μmol/l)2μl、反向引物(10μmol/l)2μl、100％dmso1μl、transstarttmfastpfudnapolymerase(2.5u/μl)1μl、去离子水29μl，总体积50μl。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
扩增后的acrb1产物包含cat-sacb盒(如图2所示)以及两端分别是acrb起始密码子上游40个碱基和acrb终止密码子后的40个碱基。
将获得的acrb1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌qa05后进行同源重组，实现在acrb插入cat-sacb盒。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌qa05，然后将acrb片段电转至含有pkd46的大肠杆菌qa05。电转条件为：首先准备含有pkd46的大肠杆菌qa05的电转化感受态细胞；将50l感受态细胞置于冰上，加入50-100ngacrb1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的bio-rad电转杯。使用micropulser(bio-rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mllb液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15ml试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μl孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的lb固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落pcr扩增及dna测序验证。pcr扩增及dna测序引物7089为：
acrb-f：cggcaaagccaaagtgtcactgatc；acrb-r：atggaaaaaacttactgacctggac
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌acrb-sacb(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
以大肠杆菌dsm1576菌液为模板，使用引物709acrb-f/acrb-rm进行扩增，获得扩增片段d。以大肠杆菌dsm1576菌液为模板，使用引物710acrb-fm/acrb-r进行扩增，获得扩增片段e。以片段d和片段e为模板，使用引物711acrb-f/acrb-r进行扩增，获得扩增片段f。
引物709序列为：
acrb-f：cggcaaagccaaagtgtcactgatc；acrb-rm：gcggccttagtgattacacgttgtagtcttaacggctcctgtttaagtta
引物710序列为：
acrb-fm：taacttaaacaggagccgttaagactacaacgtgtaatcactaaggccgc；acrb-r：atggaaaaaacttactgacctggac
引物711序列为：
acrb-f：cggcaaagccaaagtgtcactgatc；acrb-r：atggaaaaaacttactgacctggac
扩增体系：5×transstarttmfastpfubuffer10μl、dntps(2.5mmol/l每个dntp)4μl、dna模板1μl(20-50ng)、正向引物(10μmol/l)2μl、反向引物(10μmol/l)2μl、100％dmso1μl、transstarttmfastpfudnapolymerase(2.5u/μl)1μl、去离子水29μl，总体积50μl。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
将获得的片段f电转至大肠杆菌acrb-sacb。
电转条件为：首先准备大肠杆菌acrb-sacb的电转化感受态细胞；将50l感受态细胞置于冰上，加入50-100ngf片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的bio-rad电转杯。使用micropulser(bio-rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mllb液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15ml试管中，放置在37℃、200rpm转速的摇床中孵育2小时得到大肠杆菌acrb-sacb1。
将大肠杆菌acrb-sacb1去掉pkd46质粒。
取300μl大肠杆菌acrb-sacb1(不含pkd46质粒)菌液转接到30ml含10％蔗糖、没有氯化钠的lb液体培养基中37℃，250rpm过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的lb平板，37℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落pcr扩增及dna测序验证。pcr扩增及dna测序引物7123为：
acrb-f：cggcaaagccaaagtgtcactgatc；acrb-r：atggaaaaaacttactgacctggac
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌qa07，用于3-脱氢奎尼酸的生产测试。
该大肠杆菌重组菌株qa07已于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为cgmccno.15065。
实施例3大肠杆菌重组菌株qa10的构建
以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacb(cat-sacb盒，如seqidno:2所示)的质粒peasy-cat-sacb(如图2所示)为模板，使用引物10012-acka-pta-cat-sacb-s/2-acka-pta-cat-sacb-a扩增第一步同源重组的片段acka-pta1。引物1001序列为：
2-acka-pta-cat-sacb-s:ctgacgtttttttagccacgtatcaattataggtacttcctcctggtgtccctgttgatacc
2-acka-pta-cat-sacb-a:ttcagatatccgcagcgcaaagctgcggatgatgacgagaatagatacatcagagcttttacgag
扩增体系：5×transstarttmfastpfubuffer10μl、dntps(2.5mmol/l每个dntp)4μl、dna模板1μl(20-50ng)、正向引物(10μmol/l)2μl、反向引物(10μmol/l)2μl、100％dmso1μl、transstarttmfastpfudnapolymerase(2.5u/μl)1μl、去离子水29μl，总体积50μl。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
扩增后的acka-pta1产物包含cat-sacb盒(如图2所示)以及两端分别是acka起始密码子上游40个碱基和pta终止密码子后的40个碱基。
将获得的acka-pta1这个扩增产物导入含有pkd46的大肠杆菌qa07后进行同源重组，实现在acka-pta插入cat-sacb盒。首选通过氯化钙转化法将pkd46质粒转化至大肠杆菌qa07，然后将acka-pta1片段电转至含有pkd46的大肠杆菌qa07。电转条件为：首先准备含有pkd46的大肠杆菌qa07的电转化感受态细胞；将50l感受态细胞置于冰上，加入50-100ngacka-pta1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的bio-rad电转杯。使用micropulser(bio-rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mllb液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15ml试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μl孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的lb固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落pcr扩增及dna测序验证。pcr扩增及dna测序引物1021为：
acka-1-up：atgtcggtgtcatcatgc；pta-t-down：cggttcagatatccgcag
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌acka-pta-sacb(含有pkd46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
人工合成调控元件p4和qutb2，调控元件p4的序列如seqidno:3所示，qutb2的序列如seqidno:1所示，并将调控元件p4和qutb2直接连接形成片段p4-qutb2。以片段p4-qutb2为模板，使用引物m93-s、qutb2-a，进行扩增，得到片段s，并回收纯化。利用ecorι和hindιιι双酶切片段s，与ecorι和hindιιι双酶切后的peasy载体用t4连接酶22°作用20分钟，转化感受态细胞。涂平板后生长18h，挑取单菌落得到含有peasy-qutb2载体的大肠杆菌，peasy-qutb2载体如图3所示。
以大肠杆菌dsm1576菌液为模板，使用引物1003acka-pta-f/acka-pta-rm1进行扩增，得到片段g。以含有peasy-qutb2载体的大肠杆菌菌液为模板，使用引物1004acka-pta-fm1/acka-pta-rm2进行扩增，得到片段h。以大肠杆菌dsm1576菌液为模板，使用引物1005acka-pta-fm2/acka-pta-r,进行扩增，得到片段i。以片段g、h和i为模板，使用引物1006acka-pta-f/acka-pta-r进行扩增，得到片段j。
m93-s:atcggattcttatctctggcggtgttg；qutb2-a:atcgaagcttttacagggtactttttgc
引物1003序列为：
acka-pta-f：cctgcatgggtaaacttaaggcg；acka-pta-rm1：tctcttgtcaacaccgccagagataaggaagtacctataattgatacgtggc
引物1004序列为：
acka-pta-fm1：gccacgtatcaattataggtacttccttatctctggcggtgttgacaagaga
acka-pta-rm2：cgcaaagctgcggatgatgacgagatagcataaccccttggggcctctaaac
引物1005序列为：
acka-pta-fm2：gtttagaggccccaaggggttatgctatctcgtcacatccgcagctttgcg；acka-pta-r：gatgatgccaacggctgtcc
引物1006序列为：
acka-pta-f：cctgcatgggtaaacttaaggcg；acka-pta-r：gatgatgccaacggctgtcc
扩增体系：5×transstarttmfastpfubuffer10μl、dntps(2.5mmol/l每个dntp)4μl、dna模板1μl(20-50ng)、正向引物(10μmol/l)2μl、反向引物(10μmol/l)2μl、100％dmso1μl、transstarttmfastpfudnapolymerase(2.5u/μl)1μl、去离子水29μl，总体积50μl。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
将获得的扩增产物j电转至大肠杆菌acka-pta-sacb。电转条件为：首先准备大肠杆菌acka-pta-sacb的电转化感受态细胞；将50l感受态细胞置于冰上，加入50-100ngj片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的bio-rad电转杯。使用micropulser(bio-rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mllb液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15ml试管中，放置在37℃、200rpm转速的摇床中孵育2小时得到大肠杆菌acka-pta-sacb2。
将大肠杆菌acka-pta-sacb2去掉pkd46质粒。
取300μl大肠杆菌acka-pta-sacb2(不含pkd46质粒)菌液转接到30ml含10％蔗糖、没有氯化钠的lb液体培养基中37℃，250rpm过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的lb平板，37℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落pcr扩增及dna测序验证。pcr扩增及dna测序引物1022为：
w-promoter-s：ttatctctggcggtgttg；pta-t-down：cggttcagatatccgcag
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌qa10，用于奎尼酸的生产测试。
该大肠杆菌重组菌株qa10已于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为cgmccno.15066。
本发明中所提及种子培养基或发酵培养基中的各成分及各成分的含量、发酵温度、发酵体系的ph值、发酵时间、接种量均可依据需要进行相应的调整。例如：
起始葡萄糖含量为20g/l-100g/l，具体地可为20g/l或30g/l或40g/l或50g/l或60g/l或70g/l或80g/l或90g/l或100g/l等(发酵开始后，待发酵罐中葡萄糖浓度降低到1g/l以下时，开始用浓度为500g/l-600g/l的葡萄糖溶液开始补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度小于1g/l)；
酵母提取物的含量为0-2g/l，具体可为0g/l或0.5g/l或1g/l或2g/l等；
胰蛋白胨的含量为0-10g/l，具体可为0g/l或1g/l或2g/l或3g/l或4g/l或5g/l或6g/l或7g/l或8g/l或9g/l或10g/l等；
nacl的含量为0g/l-10g/l，具体可为0g/l或1g/l或2g/l或3g/l或4g/l或5g/l或6g/l或7g/l或8g/l或9g/l或10g/l等；
柠檬酸的含量为1g/l-5g/l，具体可为1g/l或2g/l或3g/l或5g/l等；
kh2po4的含量为2.5g/l-10g/l，具体可为2.5g/l或5g/l或7.5g/l或10g/l等；
(nh4)2so4的含量为0.8g/l-2.4g/l，具体可为0.8g/l或1.2g/l或1.6g/l或2.0g/l或2.4g/l；
mgso4·7h2o的含量为1g/l-4g/l，具体可为1g/l或2g/l或3g/l或4g/l等；
feso4·7h2o的含量为50mg/l100mg/l，具体可为50mg/l或75mg/l或100mg/l等；
mnso4·h2o的含量为2.5mg/l-7.5mg/l，具体可为2.5mg/l或3mg/l或4mg/l或5mg/l或6mg/l或7.5mg/l等；
na2so4的含量为10mg/l-50mg/l，具体可为10mg/l或20mg/l或30mg/l或40mg/l或50mg/l等；
znso4的含量为2mg/l-10mg/l，具体可为2mg/l或4mg/l或6mg/l或8mg/l或10mg/l等等；
cocl2·6h2o的含量为1mg/l-6mg/l，具体可为1mg/l或2mg/l或4mg/l或6mg/l等；
cuso4·5h2o的含量为0.2mg/l-1mg/l，具体可为0.2mg/l或0.4mg/l或0.6mg/l或0.8mg/l或1mg/l等；
色氨酸的含量为0.5g/l-2.5g/l，具体可为0.5g/l或1g/l或1.5g/l或2g/l或2.5g/l等；
酪氨酸的含量为0.5g/l-2.5g/l，具体可为0.5g/l或1g/l或1.5g/l或2g/l或2.5g/l等；
苯丙氨酸的含量为0.5g/l-2.5g/l，具体可为0.5g/l或1g/l或1.5g/l或2g/l或2.5g/l等；
对氨基苯甲酸的含量为0.01g/l-0.04g/l，具体可为0.01g/l或0.02g/l或0.03g/l或0.04g/l；
对羟基苯甲酸的含量为0.01g/l-0.04g/l，具体可为0.01g/l或0.02g/l或0.03g/l或0.04g/l；
2,3-二羟基苯甲酸的含量为0.01g/l-0.04g/l，具体可为0.01g/l或0.02g/l或0.03g/l或0.04g/l；
发酵的温度为25℃-42℃，具体可为25℃或30℃或37℃或40℃或42℃等；
发酵的体系的ph值为6.0-8.0，具体可为6.0或7.0或8.0等；
发酵的时间为24小时-96小时，具体可为24小时或36小时或48小时或60小时或72小时或84小时或96小时等；
接种量的体积百分比为0.05％-15％，具体可为或0.05％或2％或5％或10％或15％等。
下面示例性地介绍发酵过程。
实施例4大肠杆菌重组菌株qa07发酵生产3-脱氢奎尼酸
种子培养基为含0.5％葡萄糖的lb培养基，由以下成分组成：
葡萄糖5g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠(nacl)10g/l。
摇瓶发酵培养基为含2％葡萄糖的lb培养基，由以下成分组成：
葡萄糖20g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠(nacl)10g/l
初始发酵罐培养基由以下成分组成：
大量元素：起始葡萄糖45g/l、柠檬酸2g/l、kh2po47.5g/l、(nh4)2so41.6g/l、mgso4·7h2o2g/l或；
微量元素：feso4·7h2o75mg/l、mnso4·h2o4.5mg/l、na2so420mg/l、znso46mg/l、cocl2·6h2o4mg/l、cuso4·5h2o0.6mg/l；
芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的含量均为2g/l；
芳香族维生素：对氨基苯甲酸、对羟基苯甲酸和2,3-二羟基苯甲酸的含量均为0.03g/l。
大肠杆菌重组菌株qa07在5l发酵罐中补料发酵生产3-脱氢奎尼酸，包括如下步骤：
(1)一级种子培养：15ml试管中一级种子培养基为3ml，121℃灭菌15分钟。冷却后将基因工程大肠杆菌qa07单菌落接种到3ml种子培养基，在30℃，250rpm摇床过夜培养16小时，用于二级种子培养基接种。
(2)二级种子培养：1l摇瓶中二级种子培养基为200ml，121℃灭菌15分钟。冷却后将2ml一级种子培养液接种到200ml二级种子培养基，在37℃，250rpm摇床培养12小时，用于发酵罐培养基接种。
(3)发酵罐补料发酵生产：取200ml上述二级种子菌液，接种于装有1.6l初始发酵罐培养基的5lbiotech-5bg发酵罐中(上海保兴生物设备工程有限公司)，在37℃，ph6.8(通过浓氨水调控ph)，溶氧20％的条件下发酵。发酵开始后，待发酵罐中葡萄糖浓度降低到1g/l以下时，开始用浓度为500g/l的葡萄糖溶液开始补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度小于1g/l。定时取样分析发酵生产情况，依据发酵情况调整补料速度。
分析方法：使用安捷伦(agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行分析测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(bio-rad)公司的aminexhpx-87h有机酸分析柱(300mm×7.8mm，9μm)；流动相为5mm硫酸，流速0.6ml/min，柱温63℃，检测波长210nm。3-脱氢奎尼酸标准品购自sigma-aldrich公司，产品目录号为96401。
结果：大肠杆菌重组菌株qa07在5l发酵罐补料发酵结果如图4所示。根据图4结果表明，在补料发酵条件下，葡萄糖的补加量约为2l，经过改造以后的重组菌株qa07发酵48h后，发酵液中积累的3-脱氢奎尼酸达到最高浓度，可达112g/l，发酵液没有乙酸等副产物的积累，发酵液中残留的葡萄糖浓度为0.55g/l，葡萄糖的摩尔转化率为38.6％。
实施例5重组菌株qa10发酵生产奎尼酸
一级种子培养基为含0.5％葡萄糖的lb培养基，由以下成分组成：
葡萄糖5g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠(nacl)10g/l。
二级种子培养基为含2％葡萄糖的lb培养基，由以下成分组成：
葡萄糖20g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠(nacl)10g/l。
初始发酵罐培养基由以下成分组成：
大量元素：起始葡萄糖45g/l、柠檬酸2g/l、kh2po47.5g/l、(nh4)2so41.6g/l、mgso4·7h2o2g/l；和
微量元素：feso4·7h2o75mg/l、mnso4·h2o4.5mg/l、na2so420mg/l、znso46mg/l、cocl2·6h2o4mg/l、cuso4·5h2o0.6mg/l。
芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的含量均为2g/l；
芳香族维生素：对氨基苯甲酸、对羟基苯甲酸和2,3-二羟基苯甲酸的含量均为0.03g/l。
大肠杆菌重组菌株qa10在5l发酵罐中发酵生产3-脱氢奎尼酸，包括如下步骤：
(1)一级种子培养：15ml试管中一级种子培养基为3ml，121℃灭菌15分钟。冷却后将基因工程大肠杆菌qa10单菌落接种到3ml种子培养基，在30℃，250rpm摇床过夜培养16小时，用于二级种子培养基接种。
(2)二级种子培养：1l摇瓶中二级种子培养基为200ml，121℃灭菌15分钟。冷却后将2ml一级种子培养液接种到200ml二级种子培养基，在37℃，250rpm摇床培养24小时，用于发酵罐培养基接种。
(3)发酵罐补料发酵生产：取200ml上述二级种子菌液，接种于装有1.6l初始发酵罐培养基的5lbiotech-5bg发酵罐中(上海保兴生物设备工程有限公司)，在37℃，ph6.5(通过浓氨水调控ph)，溶氧20％的条件下发酵。发酵开始后，待发酵罐中葡萄糖浓度降低到1g/l以下时，开始用浓度为500g/l的葡萄糖溶液开始补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度小于1g/l。定时取样分析发酵生产情况，依据发酵情况调整补料速度。
分析方法：与实施例4中的分析方法相同。
结果：大肠杆菌重组菌株qa10在5l发酵罐中发酵结果如图5所示。根据图5结果表明，葡萄糖的补加量约为2l，补料发酵条件下发酵53h后，发酵液中积累的3-脱氢奎尼酸达到达到98.5g/l，奎尼酸达到59.6g/l，葡萄糖到3-脱氢奎尼酸和奎尼酸的总摩尔转化率为40.1％，此时，发酵液中没有乙酸等其他发酵副产物的积累，发酵液中残留的葡萄糖浓度为0.51g/l。
本发明实施例提供的保藏号为cgmccno.15065的大肠杆菌重组菌株qa07是一种新型的可用于生产3-脱氢奎尼酸的微生物菌株。该菌株不含有质粒，遗传稳定性高；其发酵过程简单，发酵时间短，生产的3-脱氢奎尼酸的产率高，可达112g/l，该菌株生产的3-脱氢奎尼酸直接加氢即可生成奎尼酸，为奎尼酸的工业化生产提供了基础。且本实施例提供的重组菌株qa07在发酵过程中，葡萄糖的含量只需控制在1g/l以下，大大降低了3-脱氢奎尼酸的生产成本，发酵液中基本没有乙酸等副产物的积累，其在大规模工业生产中具有很大的发展潜力。
本发明实施例提供的保藏号为cgmccno.15066的大肠杆菌重组菌株qa10是一种新型的可用于生产奎尼酸的微生物菌株。该菌株不含有质粒，遗传稳定性高；其发酵过程简单，发酵时间短。发酵53h后，发酵液中积累的3-脱氢奎尼酸达到达到98.5g/l，奎尼酸达到59.6g/l。且本实施例提供的重组菌株qa10在发酵过程中，葡萄糖的含量只需控制在1g/l以下，大大降低了3-脱氢奎尼酸的生产成本，且发酵53h时间短，发酵液中基本没有乙酸等副产物的积累，为奎尼酸的大规模工业化生产提供了基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>生产奎尼酸相关的大肠杆菌重组菌株及其构建方法与应用
<160>43
<170>siposequencelisting1.0
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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ttgatcctaacgatgtaacctttacttactcacacttcgctgtacctcaagcgaaaggaa2460
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