本发明涉及菌种培育技术领域，尤其涉及一种利用树皮浸出汁提高液体菌种产量的配方及方法。
背景技术：
随着木屑等价格的上涨，培养固体菌种的价格也随之上涨，且固体菌种培养时间长，发菌速度慢，随着市场对香菇需求量的增大，袋栽香菇栽培方法的普及以及栽培技术的逐步成熟，越来越多的农户投入到袋栽香菇的生产中来，棉籽壳、木屑价格不断提高，因此，寻找一种能够替代棉籽壳、木屑等原材料的农林废弃物，不但可以降低香菇生产成本，而且将农林废气物进行循环利用，起到节能减排以及实现循环经济的重要意义。同时，菌种培养过程中存在培养基各成分比例不合理、容易滋生杂菌等问题，因此，研发一种能够高产优质的液体菌种具有大的市场价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用树皮浸出汁提高液体菌种产量的配方及方法，用以克服现有技术的技术缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种利用树皮浸出汁提高液体菌种产量的配方，由下列组分构成：树皮提取化合物a10-15g/l、海藻糖20-25g/l，酵母粉2-6g/l，蛋白胨1-2g/l，磷酸二氢钾1-2g/l，硫酸镁1.5-2g/l，琼脂15-20g/l、月桂醇磺酸钠0.2-0.8g/l，余量为纯净水，培养基ph值调节至6-7。
进一步地，所述树皮提取化合物a的结构式为：
本发明还提供一种利用树皮浸出汁提高液体菌种产量的方法，包括：
步骤a，树皮的干燥全草粉碎，用80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
步骤b，步骤a中乙酸乙酯萃取物用ab-8型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；
步骤c，步骤b中75％乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为85∶1、40∶1、20∶1、12∶1和1∶1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；
步骤d，步骤c中组分4用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20∶1、12∶1和5∶1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
步骤e，步骤d中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶ods-c18分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物a；
步骤f，将化合物a、海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、月桂醇磺酸钠混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤并加水适当得液体培养基，ph值调节至6-7；
步骤g，接种过程：将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在温度20℃下摇床培养10-15天。
进一步地，树皮的提取为树龄十年以上的杨树、柳树、槐树的树皮，树皮经过切断碾碎后获取，在本实施例中，在获取湿润树皮后，截段，每段称取重量为1-2kg，在每段树皮中注射磷酸二氢钾、硫酸镁、海藻糖的液体混合物0.1-0.2kg，使树皮具有足够养分，将树皮晒干备用。
进一步地，磷酸二氢钾、硫酸镁、海藻糖与水的重量份为1:1:1：50。
与现有技术相比本发明的有益效果在于，本发明通过提取树皮中的化合物，并与海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、月桂醇磺酸钠结合形成培养基，其能够提高液体菌种的产量。尤其本发明树皮的提取为树龄十年以上的杨树、柳树、槐树的树皮，树皮经过切断碾碎后获取，在获取湿润树皮后，截段，每段称取重量为1-2kg，在每段树皮中注射磷酸二氢钾、硫酸镁、海藻糖的液体混合物0.1-0.2kg，使树皮具有足够养分，将树皮晒干备用。其中，磷酸二氢钾、硫酸镁、海藻糖与水的重量份为1:1:1：50。本发明通过预先在湿润树皮中注入养分，使树皮在晾晒过程中吸收养分，使最终树皮提取液能够适量吸收。
附图说明
图1为本发明实施例的化合物a的分子结构图。
具体实施方式
以下，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
本发明实施例首先对树皮进行提取，获取化合物a，其结构式为：
树皮提取化合物分离制备及结构确证：
本发明实施例树皮的提取为树龄十年以上的杨树、柳树、槐树的树皮，树皮经过切断碾碎后获取，在本实施例中，在获取湿润树皮后，截段，每段称取重量为1-2kg，在每段树皮中注射磷酸二氢钾、硫酸镁、海藻糖的液体混合物0.1-0.2kg，使树皮具有足够养分，将树皮晒干备用。其中，磷酸二氢钾、硫酸镁、海藻糖与水的重量份为1:1:1：50。本发明通过预先在湿润树皮中注入养分，使树皮在晾晒过程中吸收养分，使最终树皮提取液能够适量吸收。
制备方法：步骤a，树皮的干燥全草(10kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(25l×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3l)，依次用石油醚(3l×3次)、乙酸乙酯(3l×3次)和水饱和的正丁醇(3l×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(398g)和正丁醇萃取物；
步骤b，步骤a中乙酸乙酯萃取物用ab-8型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(163g)；
步骤c，步骤b中75％乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为85∶1(8个柱体积)、40∶1(8个柱体积)、20∶1(8个柱体积)、12∶1(10个柱体积)和1∶1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；
步骤d，步骤c中组分4(49g)用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20∶1(8个柱体积)、12∶1(10个柱体积)和5∶1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
步骤e，步骤d中组分2(25g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶ods-c18分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物a(44mg)。
结构确证：黄色无定形粉；hr-esims显示[m+na]+为m/z549.2314，结合核磁特征可得分子式为c33h34o6，不饱和度为17。核磁共振氢谱数据δh(ppm，dmso-d6，500mhz)：h-4(6.33，d，j＝1.8)，h-6(6.55，d，j＝1.8)，h-α(6.85，d，j＝16.0)，h-β(6.61，d，j＝16.0)，h-2’，6’(7.04，d，j＝8.2)，h-3’，5’(6.64，d，j＝8.2)h-3”(6.24，d，j＝2.3)，h-5”(6.14，dd，j＝8.2，2.3)，h-6”(6.62，d，j＝8.2)，h-α’(2.38，2h，m)，h-β’(2.20，2h，m)，h-γ’(4.45，br，s)，h-2”’，6”’(7.04，d，j＝8.2)，h-3”’，5”’(6.64，d，j＝8.2)，3-och3(3.58，s)，2”-och3(3.52，s)，4”-och3(3.62，s)，4”’-och3(3.59，s)；核磁共振碳谱数据δc(ppm，dmso-d6，125mhz)：139.9(c，1-c)，124.7(c，2-c)，160.0(c，3-c)，98.5(ch，4-c)，159.6(c，5-c)，103.7(ch，6-c)，125.8(ch，α-c)，130.6(ch，β-c)，130.1(c，1’-c)，128.2(ch，2’，6’-c)，116.0(ch，3’，5’-c)，157.5(c，4’-c)，122.3(c，1”-c)，159.3(c，2”-c)，99.2(ch，3”-c)，156.9(c，4”-c)，106.8(ch，5”-c)，130.6(ch，6”-c)，28.5(ch2，α’-c)，33.4(ch2，β’-c)，39.6(ch，γ’-c)，138.0(c，1”’-c)，129.1(ch，2”’，6”’-c)，113.6(ch，3”’，5”’-c)，158.1(c，4”’-c)，55.2(ch3，3-och3)，55.2(ch3，2”-och3)，55.4(ch3，4”-och3)，55.2(ch3，4”’-och3)；碳原子标记参见结构式。1hnmr和1h-1hcosy谱显示出两对双质子双峰[δh7.04(2h，d，j＝8.2hz)，6.64(2h，d，j＝8.2hz)，7.04(2h，d，j＝8.2hz)，6.64(2h，d，j＝8.2hz)]，表明该化合物含有两个1，4-二取代芳环。此外，观察到一组abx的耦合信号δh6.62(1h，d，j＝8.2hz)，6.24(1h，d，j＝2.3hz)和6.14(1h，dd，j＝8.2，2.3hz)，表明该化合物含有一个1，2，4-三取代的芳环。另两个间耦合信号δh6.55(1h，d，j＝1.8hz)和6.33(1h，d，j＝1.8hz)，说明还含有一个1，2，3，5-四取代芳香环。除了芳族质子，还有两个反式烯烃质子信号δh6.85(1h，d，j＝16.0hz)和6.61(1h，d，j＝16.0hz)，两个亚甲基脂肪族质子信号[δh2.20(2h，m)，2.38(2h，m)]，一个次甲基信号[d4.45(1h，br，s)]以及四个甲氧基信号[δh3.62，3.59，3.58，3.52，(3h，s)]。13cnmr和hsqc谱显示了与氢谱一致的11个芳香季碳，包括六个含氧季碳，十三个芳香族次甲基碳，三个脂族次甲基碳，两个脂族亚甲基碳，四个甲氧基碳。hmbc谱中，反式烯烃sp2自旋质子与对-羟基苯和四取代苯环的相关性表明该化合物为共轭茋类化合物。1h-1hcosy相关谱表明了脂族链碳信号c-α’，c-β’，c-γ’的存在，hmbc谱中h-α’与芳香族碳的相关性表明c-α’与2，4-二甲氧基苯基相连。noesy谱中h-γ’信号与反式烯烃单元和3-甲氧基-5-羟基苯环的相关性表明，上述二苯乙烯单元与c-γ’相连。
综合氢谱、碳谱、hmbc谱和noesy谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物。
在获取化合物a后，制备培养基；
步骤f，将化合物a、海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、月桂醇磺酸钠混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤并加水适当得液体培养基，ph值调节至6-7。
步骤g，接种过程：将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在温度20℃下摇床培养10-15天。
本实施例采用海藻糖，利用其独特的功能特性使其除了可以作为天然食用甜味糖外，在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征，因此，海藻糖与氧化石墨烯的协同作用，大大延长了食用菌的贮藏时间。本实施例采用磷酸二氢钾、硫酸镁提供微量元素。
实施例1
本实施例采用金针菇进行培育并设置对照组。
本实施例配方包括：树皮提取化合物a10g/l、海藻糖20g/l，酵母粉2g/l，蛋白胨1g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁1.5g/l，琼脂15g/l、月桂醇磺酸钠0.2g/l，余量为纯净水，培养基ph值调节至6-7。
步骤f，将化合物a、海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、月桂醇磺酸钠混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤并加水适当得液体培养基，ph值调节至6-7。
步骤g，接种过程：将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在温度20℃下摇床培养15天。
将化合物a、海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、月桂醇磺酸钠混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤并加水适当得液体培养基，ph值调节至6-7。将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在温度20℃下摇床培养15天。在培育过程中，瓶载直径10cm，栽种一平方米，培育15天后，任取3瓶称重干料重量。
对照组采用海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、月桂醇磺酸钠混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤并加水适当得液体培养基，ph值调节至6-7，按照上述方法种植及称重。
表1实施例1与对照组菌种产量情况
从表1可以看出，对照组中未采用树皮提取物，产量不稳定，并且，产量较低；而采用本发明实施例所制作的树皮提取物的培养基，产量稳定，并且，相对于未采用树皮提取物的产量提高10％左右。
实施例2
本实施例采用茶树菇进行培育并设置对照组。
本实施例配方包括：树皮提取化合物a15g/l、海藻糖25g/l，酵母粉6g/l，蛋白胨2g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁2g/l，琼脂20g/l、月桂醇磺酸钠0.8g/l，余量为纯净水，培养基ph值调节至6-7。
步骤f，将化合物a、海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、月桂醇磺酸钠混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤并加水适当得液体培养基，ph值调节至6-7。
步骤g，接种过程：将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在温度20℃下摇床培养15天。
将化合物a、海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、月桂醇磺酸钠混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤并加水适当得液体培养基，ph值调节至6-7。将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在温度20℃下摇床培养15天。在培育过程中，瓶载直径10cm，栽种一平方米，培育15天后，任取3瓶称重干料重量。
对照组采用海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、月桂醇磺酸钠混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤并加水适当得液体培养基，ph值调节至6-7，按照上述方法种植及称重。
表2实施例2与对照组菌种产量情况
从表2可以看出，对照组中未采用树皮提取物，产量不稳定，并且，产量较低；而采用本发明实施例所制作的树皮提取物的培养基，产量稳定，并且，相对于未采用树皮提取物的产量提高10-15％左右。
实施例3
本实施例采用白玉菇进行培育并设置对照组。
本实施例配方包括：树皮提取化合物a12g/l、海藻糖22g/l，酵母粉4g/l，蛋白胨1.5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁1.8g/l，琼脂18g/l、月桂醇磺酸钠0.4g/l，余量为纯净水，培养基ph值调节至6-7。
步骤f，将化合物a、海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、月桂醇磺酸钠混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤并加水适当得液体培养基，ph值调节至6-7。
步骤g，接种过程：将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在温度20℃下摇床培养15天。
将化合物a、海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、月桂醇磺酸钠混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤并加水适当得液体培养基，ph值调节至6-7。将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在温度20℃下摇床培养15天。在培育过程中，瓶载直径10cm，栽种一平方米，培育15天后，任取3瓶称重干料重量。
对照组采用海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、月桂醇磺酸钠混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤并加水适当得液体培养基，ph值调节至6-7，按照上述方法种植及称重。
表3实施例3与对照组菌种产量情况
从表3可以看出，对照组中未采用树皮提取物，产量不稳定，并且，产量较低；而采用本发明实施例所制作的树皮提取物的培养基，产量稳定，并且，相对于未采用树皮提取物的产量提高10％左右。
至此，已经结合所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征作出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。