本发明属于化学医药领域，特别涉及吲唑类衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
肿瘤是机体细胞在内外致瘤因素长期协同作用下导致其基因水平的突变和功能调控异常，从而促使细胞持续过度增殖并导致发生转化而形成的新生物。目前我国每年新生肿瘤患者总数约212.7万人左右，其中，每年有100万左右的恶性肿瘤新生患者；同时，全国约有268.5万左右的肿瘤现有患者，其中，恶性肿瘤现有患者约148.5万左右，良性肿瘤现有患者约120万左右。全国肿瘤死亡人数每年约有154万人左右，也就是说肿瘤患者人群正以每年约60万人的速度膨胀。目前用于肿瘤治疗的主要手段有手术、放疗、化疗和生物治疗，其他有效手段还包括内分泌治疗、中医中药治疗、热疗和射频消融治疗等。由于现有各种治疗手段各有其最佳适应症，也各有其不足，所以，为了提高治愈率，仍需开发安全有效的靶向治疗方法蛋白激酶(kinase)是细胞生命活动重要的信号使者，可催化将atp末端的γ-磷酸基团转移至底物上，从而将各种信号进行传递。蛋白激酶参与了众多的生理过程，包括细胞增殖、存活、凋亡、代谢、转录以及分化等。药理学及病理学研究表明，对于很多疾病，如肿瘤、炎症性疾病、中枢神经系统疾病、心血管疾病及糖尿病等，蛋白激酶都是一个理想的药物靶点。
迄今为止，在人体中发现了518种蛋白激酶，而编码具有激酶活性蛋白的基因则高达900多种。与之相对应，有关激酶抑制剂的研究也逐步发展，并在激酶作用机制的阐明过程中扮演了重要角色，并成为重要的药物研究热点。该领域研究的文献数量也是逐年上升，从侧面反映了其在基础研究和药物发现中的重要性。
技术实现要素：
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一类吲唑类衍生物，其结构如式i所示：
其中，r1为-h、苯甲基、取代或未取代的c5～c8芳基、取代或未取代的5～8元杂芳基甲酰基、c1～c8羰基或c1～c8烷基；所述5～8元杂芳基甲酰基的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c8芳基或5～8元杂芳基甲酰基的取代基为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、卤素、-nh2、-cf3、c1～c4烷胺基、-ocf3、-no2或-cn；
r2a、r2b、r2c独立的为-h、c1～c8烷基、c1～c8烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c8烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2或-cn；
r3为取代或未取代的c5～c12芳基、取代或未取代的5～12元芳杂基、
r4、r5独立的为取代或未取代的c5～c12芳基或取代或未取代的5～12元饱和或不饱和杂环；所述5～12元饱和或不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c12芳基或5～12元饱和或不饱和杂环的取代基为-h、卤素、-cf3、-no2、c1～c8烷基、c1～c8烷氧基、
r7、r8独立的为-h、c1～c8烷基、c1～c8羰基或c1～c8氧羰基；
r9、r10独立的为取代或未取代的c5～c12芳基或取代或未取代的5～12元饱和或不饱和杂环；所述5～12元饱和或不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～5个；所述取代c5～c12芳基或5～12元饱和或不饱和杂环的取代基为-h、-so2ch3、c1～c8烷基、
x为n或cr11x，r11x为-h、c1～c8烷基、c1～c8烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c8烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2、-cn或c1～c8烷酰胺基；
y为n或cr11y，r11y为-h、c1～c8烷基、c1～c8烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c4烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2、-cn或c1～c8烷酰胺基。
作为本发明的优选技术方案，上述吲唑类衍生物，当x为cr11x，y为cr11y，r3为
其中，r1为-h、苯甲基、取代或未取代的c5～c6芳基、取代或未取代的5～6元杂芳基甲酰基、c1～c4羰基或c1～c4烷基；所述5～6元杂芳基甲酰基的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c6芳基或5～6元杂芳基甲酰基的取代基为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、卤素、-nh2、-cf3、c1～c4烷胺基、-ocf3、-no2或-cn；
r2a、r2b、r2c独立的为-h、c1～c6烷基、c1～c6烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c6烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2或-cn；
r4为取代或未取代的c5～c10芳基或取代或未取代的5～10元饱和或不饱和杂环；所述5～10元饱和或不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c10芳基或5～10元饱和或不饱和杂环的取代基为-h、卤素、-cf3、-no2、c1～c6烷基、c1～c6烷氧基、
r7、r8独立的为-h、c1～c6烷基、c1～c6羰基或c1～c6氧羰基；
r9、r10独立的为取代或未取代的5～10元饱和或不饱和杂环；所述5～10元饱和或不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～5个；所述5～10元饱和或不饱和杂环的取代基为-h、-so2ch3、c1～c6烷基、
r11x、r11y独立的为-h、c1～c6烷基、c1～c6烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c6烷氨基、卤素、-nh2、-cf3，-ocf3、-no2、-cn或c1～c6烷酰胺基。
优选的，r1为-h、苯甲基、取代或未取代的c5～c6芳基、取代或未取代的5～6元杂芳基甲酰基、c1～c4羰基或c1～c4烷基；所述5～6元杂芳基甲酰基的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c6芳基或5～6元杂芳基甲酰基的取代基为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、卤素、-nh2、-cf3、c1～c4烷胺基、-ocf3、-no2或-cn；
r2a、r2b、r2c独立的为-h、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c4烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2或-cn；
r4为取代或未取代的c5～c8芳基或取代或未取代的5～10元不饱和杂环；所述5～10元不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c8芳基或5～10元不饱和杂环的取代基为-h、卤素、-cf3、-no2、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、
r7、r8独立的为-h、c1～c4烷基、c1～c4羰基或c1～c4氧羰基；
r9、r10独立的为取代或未取代的5～8元饱和或不饱和杂环；所述5～8元饱和或不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～5个；所述5～8元饱和或不饱和杂环的取代基为-h、-so2ch3、c1～c4烷基、
r11x、r11y独立的为-h或c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c4烷氨基、卤素、-nh2、-cf3，-ocf3、-no2或-cn或c1～c4烷酰胺基。
进一步的，r1为-h、苯甲基、取代或未取代的c5～c6芳基、取代或未取代的5～6元杂芳基甲酰基、c1～c4羰基或c1～c4烷基；所述5～6元杂芳基甲酰基的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c6芳基或5～6元杂芳基甲酰基的取代基为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、卤素、-nh2、-cf3、c1～c4烷胺基、-ocf3、-no2或-cn；
r2a、r2b、r2c独立的为-h、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c4烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2或-cn；
r4为取代或未取代的c5～c6芳基或取代或未取代的5～10元不饱和杂环；所述5～10元不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c6芳基或5～10元不饱和杂环的取代基为-h、卤素、-cf3、-no2、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、
r7、r8独立的为-h、c1～c4烷基、c1～c4羰基或c1～c4氧羰基；
r9、r10独立的为取代或未取代的5～6元饱和或不饱和杂环；所述5～6元饱和或不饱和杂环的杂原子为n、o，杂原子个数为1～4个；所述5～6元饱和或不饱和杂环的取代基为-h、-so2ch3、c1～c4烷基、
r11x、r11y为-h、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c4烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2或-cn或c1～c4烷酰胺基。
更进一步的，r1为-h、苯甲基、取代或未取代的c5～c6芳基、取代或未取代的5～6元杂芳基甲酰基、c1～c4羰基或c1～c4烷基；所述5～6元杂芳基甲酰基的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c6芳基或5～6元杂芳基甲酰基的取代基为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、卤素、-nh2、-cf3、c1～c4烷胺基、-ocf3、-no2或-cn；
r2a为-h或c1～c4烷基；r2b、r2c独立的为-h；
r4为取代或未取代的苯基、取代或未取代的5～8元芳杂基、
r7、r8独立的为-h、c1～c4烷基、c1～c4羰基或c1～c4氧羰基；
r9、r10独立的为
r11x、r11y独立的为-h。
最优选的，r1为-h、苯甲基、取代或未取代的c5～c6芳基、取代或未取代的5～6元杂芳基甲酰基、c1～c4羰基或c1～c4烷基；所述5～6元杂芳基甲酰基的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～2个；所述取代c5～c6芳基或5～6元杂芳基甲酰基的取代基为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、卤素、-nh2、-cf3、c1～c4烷胺基、-ocf3、-no2或-cn；
r2a为-h或c1～c4烷基；r2b、r2c独立的为-h；
r4为取代或未取代的苯基、取代或未取代的5～6元芳杂基、
r11x、r11y为-h。
优选的，上述吲唑类衍生物，当x为cr11x，y为cr11y，r3为
其中，r1为-h、苯甲基、取代或未取代的c5～c6芳基、取代或未取代的5～6元杂芳基甲酰基、c1～c4羰基或c1～c4烷基；所述5～6元杂芳基甲酰基的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c6芳基或5～6元杂芳基甲酰基的取代基为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、卤素、-nh2、-cf3、c1～c4烷胺基、-ocf3、-no2或-cn；
r2a、r2b、r2c独立的为-h、c1～c6烷基、c1～c6烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c6烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2或-cn；
r5为取代或未取代的c5～c10芳基或取代或未取代的5～10元饱和或不饱和杂环；所述5～10元饱和或不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c10芳基或5～10元饱和或不饱和杂环的取代基为-h、卤素、-cf3、-no2、c1～c6烷基、c1～c6烷氧基、
r7、r8独立的为-h、c1～c6烷基、c1～c6羰基或c1～c6氧羰基；
r9、r10独立的为取代或未取代的5～10元饱和或不饱和杂环；所述5～10元饱和或不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～5个；所述5～10元饱和或不饱和杂环的取代基为-h、-so2ch3、c1～c6烷基、
r11x、r11y独立的为-h、c1～c6烷基、c1～c6烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c6烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2或-cn或c1～c6烷酰胺基。
优选的，r1为-h、苯甲基、取代或未取代的c5～c6芳基、取代或未取代的5～6元杂芳基甲酰基、c1～c4羰基或c1～c4烷基；所述5～6元杂芳基甲酰基的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c6芳基或5～6元杂芳基甲酰基的取代基为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、卤素、-nh2、-cf3、c1～c4烷胺基、-ocf3、-no2或-cn；
r2a、r2b、r2c独立的为-h、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c4烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2或-cn；
r5为取代或未取代的c5～c8芳基或取代或未取代的5～10元不饱和杂环；所述5～10元不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c8芳基或5～10元不饱和杂环的取代基为-h、卤素、-cf3、-no2、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、
r7、r8独立的为-h、c1～c4烷基、c1～c4羰基或c1～c4氧羰基；
r9、r10独立的为取代或未取代的5～8元饱和或不饱和杂环；所述5～8元饱和或不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～5个；所述5～8元饱和或不饱和杂环的取代基为-h、-so2ch3、c1～c4烷基、
r11x、r11y独立的为-h、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c4烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2或-cn或c1～c4烷酰胺基。
进一步的，r1为-h、苯甲基、取代或未取代的c5～c6芳基、取代或未取代的5～6元杂芳基甲酰基、c1～c4羰基或c1～c4烷基；所述5～6元杂芳基甲酰基的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c6芳基或5～6元杂芳基甲酰基的取代基为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、卤素、-nh2、-cf3、c1～c4烷胺基、-ocf3、-no2或-cn；
r2a、r2b、r2c独立的为-h、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c4烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2或-cn；
r5为取代或未取代的c5～c6芳基或取代或未取代的5～10元不饱和杂环；所述5～10元不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c6芳基或5～10元不饱和杂环的取代基为-h、卤素、-cf3、-no2、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、
r7、r8独立的为-h、c1～c4烷基、c1～c4羰基或c1～c4氧羰基；
r9、r10独立的为取代或未取代的5～6元饱和或不饱和杂环；所述5～6元饱和或不饱和杂环的杂原子为n、o，杂原子个数为1～4个；所述5～6元饱和或不饱和杂环的取代基为-h、-so2ch3、c1～c4烷基、
r11x、r11y为-h、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c4烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2或-cn或c1～c4烷酰胺基。
更进一步的，r1为-h、苯甲基、取代或未取代的c5～c6芳基、取代或未取代的5～6元杂芳基甲酰基、c1～c4羰基或c1～c4烷基；所述5～6元杂芳基甲酰基的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c6芳基或5～6元杂芳基甲酰基的取代基为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、卤素、-nh2、-cf3、c1～c4烷胺基、-ocf3、-no2或-cn；
r2a为-h或c1～c4烷基；r2b、r2c独立的为-h；
r5为取代或未取代的苯基、取代或未取代的5～8元芳杂基、
r7、r8独立的为-h、c1～c4烷基、c1～c4羰基或c1～c4氧羰基；
r9、r10独立的为
r11x、r11y为-h。
最优选的，r1为-h、苯甲基、取代或未取代的c5～c6芳基、取代或未取代的5～6元杂芳基甲酰基、c1～c4羰基或c1～c4烷基；所述5～6元杂芳基甲酰基的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～2个；所述取代c5～c6芳基或5～6元杂芳基甲酰基的取代基为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、卤素、-nh2、-cf3、c1～c4烷胺基、-ocf3、-no2或-cn；
r2a为-h或c1～c4烷基；r2b、r2c独立的为-h；
r5为取代或未取代的苯基、取代或未取代的5～6元芳杂基、
r11x、r11y为-h。
上述吲唑类衍生物的结构式如下，
本发明还提供了上述吲唑类衍生物的制备方法，其合成路线为：
反应条件：(a)fe，nh4cl，ch3oh︰h2o＝3︰1，回流；(b)亚硝酸异戊酯，乙酸酐，乙酸钾，甲苯，100℃；(c)hcl(6n)，ch3oh,回流；(d)dppf，乙酸钾，联硼酸频哪醇酯，二氧六环，95℃；(e)dppf，碳酸钾，二氧六环：水＝4：1,100℃；(f)i2，碳酸钾，dmf，65℃；(g)dppf，碳酸钾，二氧六环：水＝4：1,100℃
合成步骤：
步骤a：
化合物1和氯化铵(3.0-4.0eq.)溶于甲醇/水(2/1-4/1)混合溶剂中，加热至接近回流温度时分批加入还原铁粉(3.0-4.0eq.)，回流0.5-2h得化合物2。
步骤b：
化合物2溶于甲苯中，加入乙酸钾(1.05-1.5eq.)，乙酸酐(2.0-3.0eq.)，室温下反应1-4h，加入18-冠-6(0.5-0.8eq.)，亚硝酸异戊酯(2.0-4.0eq.)，回流3-6h得化合物3。
步骤c：
化合物3溶于甲醇中，加入hcl，60℃下回流，反应0.5-2h后得化合物4。
步骤d：
化合物4和联硼酸频哪醇酯(1.05-1.3eq.)溶于1,4-二氧六环中，加入碱(2.0-3.0eq.)，催化剂(3-8mmol％)，n2保护下升温至80-100℃反应6-10h得化合物5。碱的例子包括但不限于碳酸钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸铯。催化剂的例子包括但不限于醋酸钯、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、三(二亚苄基茚丙酮)二钯。
步骤e：
化合物5和卤代物溶于1,4-二氧六环中，加入碱(2.0-3.0eq.)，催化剂(3-8mmol％)，n2保护下升温至90-110℃反应3-8h得化合物6。碱的例子包括但不限于碳酸钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸铯。催化剂的例子包括但不限于醋酸钯、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、三(二亚苄基茚丙酮)二钯。
步骤f：
化合物6溶于dmf中，加入碱(2.0eq.)，将i2(1.5-2.0eq.)溶于dmf(5ml)中滴加至反应液，60-80℃下反应8-12h得化合物7。碱的例子包括但不限于碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾。
步骤g：
化合物7和r3-硼酸频哪醇酯(例如：(杂)芳乙烯基硼酸频哪醇酯)(1.05-1.3eq.)，碱(1.5-2.0eq.)，加入1,4-二氧六环:水(4:1-6:1)的混合溶剂中，加入催化剂(3-8mmol％)，n2保护下升温至90-110℃反应6-10h得化合物8。碱的例子包括但不限于碳酸钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸铯。催化剂的例子包括但不限于醋酸钯、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、三(二亚苄基茚丙酮)二钯。
其中，r1为-h、苯甲基、取代或未取代的c5～c8芳基、取代或未取代的5～8元杂芳基甲酰基、c1～c8羰基或c1～c8烷基；所述5～8元杂芳基甲酰基的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c8芳基或5～8元杂芳基甲酰基的取代基为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、卤素、-nh2、-cf3、c1～c4烷胺基、-ocf3、-no2或-cn；
r2a、r2b、r2c独立的为-h、c1～c8烷基、c1～c8烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c8烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2或-cn；
r3为取代或未取代的c5～c12芳基、取代或未取代的5～12元芳杂基、
r4、r5独立的为取代或未取代的c5～c12芳基或取代或未取代的5～12元饱和或不饱和杂环；所述5～12元饱和或不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～3个；所述取代c5～c12芳基或5～12元饱和或不饱和杂环的取代基为-h、卤素、-cf3、-no2、c1～c8烷基、c1～c8烷氧基、
r7、r8独立的为-h、c1～c8烷基、c1～c8羰基或c1～c8氧羰基；
r9、r10独立的为取代或未取代的c5～c12芳基或取代或未取代的5～12元饱和或不饱和杂环；所述5～12元饱和或不饱和杂环的杂原子为n、o、s，杂原子个数为1～5个；所述取代c5～c12芳基或5～12元饱和或不饱和杂环的取代基为-h、-so2ch3、c1～c8烷基、
x为n或cr11x，r11x为-h、c1～c8烷基、c1～c8烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c8烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2、-cn或c1～c8烷酰胺基；
y为n或cr11y，r11y为-h、c1～c8烷基、c1～c8烷氧基、c3～c8环烷基、c1～c4烷氨基、卤素、-nh2、-cf3、-ocf3、-no2、-cn或c1～c8烷酰胺基。
步骤g的中间体(杂)芳乙烯基硼酸频哪醇酯的合成路线如下：
合成方法：
化合物9(相应的芳乙基溴或杂芳乙基溴)和乙烯基硼酸频哪醇酯(1.05-1.3eq.)溶于甲苯中，加入催化剂(3-8mmol％)、配体(5-10mmol％)、碱(1.5-3eq.)，n2保护下升温至90-105℃反应3-10h得(杂)芳乙烯基硼酸频哪醇酯。催化剂为三(二亚苄基茚丙酮)二钯。配体为三叔丁基膦四氟硼酸盐。当r3为
本发明上述吲唑类衍生物包括其互变异构体、立体异构体及其所有比例的混合物，还包括其同位素取代的化合物。
本发明还提供了上述吲唑类衍生物药学上可接受的盐。
本发明所用的术语“药学上可接受的”是指在在合理的医学判断范围，能适于用来与人类和其他哺乳动物的组织接触，而没有不当毒性、刺激、过敏反应等，其在对受者给药时能直接或间接地提供本发明的化合物或化合物的前药。
本发明还提供了上述吲唑类衍生物药学上可接受的水合物或溶剂化物。术语“水合物”表示进一步通过非共价分子间作用力结合化学计量或非化学计量的水的化合物。
本发明还提供了上述吲唑类衍生物药学上可接受的前药。
本发明还提供了上述吲唑类衍生物药学上可接受的多晶型物。术语“多晶型物”表示化合物或其复合物的固体结晶形式，其可以通过物理方法，例如x.射线粉末衍射图或红外光谱进行表征。
本发明还提供了上述吲唑类衍生物药学上可接受的药物组合物，这种药物组合物是由式i所示的化合物及其盐或水合物、前药添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。
上述药物组合物可以为液体形式或固体形式。其中，所述的液体形式可以为水溶液形式。所述的固体形式可以为粉末、颗粒、片剂或冻干粉形式。该药物组合物还含有注射用水、盐水溶液、葡萄糖水溶液、注射/输注用盐水、注射/输注用葡萄糖、格林氏溶液或含有乳酸盐的格林氏溶液。
式i所示的化合物及其盐、水合物或药物组合物、前药在制备激酶抑制剂中的用途。
式i所示的化合物及其盐、水合物或药物组合物、前药在制备治疗肿瘤药物中的用途。所述的肿瘤包括乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌等实体瘤。
本发明还提供了上述式i所示的及其盐、水合物或药物组合物在制备口服或静脉注射制剂中的用途。所述的口服或静脉注射制剂至少包含一种式i所示的化合物及其盐、水合物或药物组合物以及任意的赋形剂和/或佐剂。
本发明涉及吲唑类衍生物作为激酶抑制剂，其具有能够治疗乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、急性髓系白血病等多种实体瘤以及血液瘤等多种肿瘤疾病的用途。这些化合物作为激酶抑制剂用于治疗人的多种肿瘤。本发明提供的一系列化合物具有较好的抗肿瘤活性和较低的毒性。
具体实施方式
实施例1化合物d6：反式-4-(3-(2-(吡啶-3-基)乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
中间体4-1f的合成
化合物d1～d23的中间体4-1f的合成路线及方法如下：
第一步，5-溴-2-甲基苯胺(4-1a)的制备
将4-溴-2-硝基甲苯(4.3g,20mmol,1.0eq.)和氯化铵(4.28g,80mmol,4.0eq.)溶于甲醇/水(2.5:1)混合溶剂(175ml)中，加热至接近回流温度时分批加入还原铁粉(4.48g,80mmol,4.0eq.)，回流0.5h后tlc监测。反应完毕后趁热将反应液用硅藻土过滤，滤饼用甲醇洗涤，滤液减压蒸除。剩余物加水搅拌，ea萃取。有机相用无水硫酸镁干燥后浓缩。柱层析(pet:ea＝5:1)得浅黄色固体3.12g(收率84.8％)。msm/z(esi)：186.3[m+h]+。
第二步，1-(6-溴-1h-吲唑-1-基)乙-1-酮(4-1b)的制备
将5-溴-2-甲基苯胺(1.86g,10mmol,1.0eq.)溶于30ml甲苯中，加入乙酸钾(1.1g,11mmol,1.1eq.)，乙酸酐(1.9ml,20mmol,2.0eq.)，室温下反应2h，加入18-冠-6(1.2g,5mmol,0.5eq.)，亚硝酸异戊酯(5.4ml,40mmol,4.0eq.)，100℃下回流。4h后tlc监测反应完毕。将溶剂减压蒸除，剩余物加水搅拌后用ea萃取。有机相用无水硫酸镁干燥，浓缩。柱层析(pet:ea＝4:1)得浅黄色固体1.3g(收率55％)。msm/z(esi)：239.1[m+h]+。
第三步，6-溴-1h-吲唑(4-1c)的制备
将1-(6-溴-1h-吲唑-1-基)乙-1-酮(2.38g,10mmol)溶于甲醇(80ml)中，加入6nhcl(40ml)，60℃下回流。1h后tlc监测反应完毕。减压蒸除溶剂，剩余物加饱和碳酸氢钠溶液调节ph至8，有固体析出，过滤。滤饼干燥后得到黄色固体1.42g(收率72.1％)。msm/z(esi)：197.5[m+h]+。
第四步，1h-吲唑-6-硼酸频哪醇酯(4-1d)的制备
将6-溴-1h-吲唑(4.0g,20mmol,1.0eq.)，联硼酸频哪醇酯(5.6g,22mmol,1.1eq.)溶于1,4-二氧六环(100ml)中，加入乙酸钾(6g,60mmol,3.0eq.)，pd(dppf)cl2(0.8g,1mmol,5mmol％)。n2保护下升温至90℃反应8h。tlc监测反应完毕后将反应液减压蒸除，剩余物用ea溶解后经硅藻土过滤，滤液依次用水和饱和食盐水萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后浓缩，柱层析(pet:ea＝2.5:1)后得到灰白色油状固体3.52g(收率72％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm)13.17(brs,1h),8.09(s,1h),7.75(s,1h),7.73(d,j＝8.8hz,1h),7.23(dd,1h)；1.36(s,12h)；msm/z(esi)：245.1[m+h]+。
第五步，4-(1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺(4-1e)的制备
将2-氨基-4-溴吡啶(3.2g,19mmol,1.0eq.),1h-吲唑-6-硼酸频哪醇酯(6.1g,25mmol,1.3eq.)溶于1,4-二氧六环(100ml)中，加入乙酸钾(4.45g,45.6mmol,2.4eq.)，pd(dppf)cl2(0.5g,0.57mmol,3mmol％)。n2保护下升温至100℃反应3h。tlc监测反应完毕后将反应液减压蒸除，剩余物用ea溶解后经硅藻土过滤，滤液依次用水和饱和食盐水萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后浓缩，柱层析(dcm:ch3oh＝12:1)后得到浅棕色固体2.33g(收率58％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.23(s,1h),8.13(s,1h),8.00(d,j＝5.4hz,1h),7.86(d,j＝8.4hz,1h),7.75(s,1h),7.39(d,j＝8.4hz,1h),6.94–6.74(m,2h),6.05(s,2h)；msm/z(esi)：211.3[m+h]+。
第六步，4-(3-碘-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺(4-1f)的制备
将4-(1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺(2.1g,10mmol,1.0eq.)溶于dmf(20ml)中，加入碳酸钾(2.7g,20mmol,2.0eq.)。将i2(5.0g,20mmol,2.0eq.)溶于于dmf(5ml)中滴加至反应液，65℃下反应10小时。tlc监测反应完毕后将反应液倒入保险粉(5.0g)和碳酸钾(2g)的水溶液(80ml)中，有白色固体析出。搅拌30min后过滤，得浅黄色固体2.7g(收率80.1％)。msm/z(esi)：337.0[m+h]+。
第七步：反式-4-(3-(2-(吡啶-3-基)乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
将4-(3-碘-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺(168mg,0.5mmol,1.0eq.)，反式-3-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)吡啶(151mg,0.65mmol,1.3eq.)，碳酸铯(326mg,1mmol,2.0eq.)，加入1,4-二氧六环:水＝4:1(15ml)的混合溶剂中，加入pd(dppf)cl2(25mg,0.025mmol,5mmol％)，n2保护下升温至100℃反应8h。tlc监测反应完毕后将反应液减压蒸除，剩余物用ea溶解后经硅藻土过滤，滤液依次用水和饱和食盐水萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后浓缩，柱层析(dcm:ch3oh＝10:1)后得到浅黄色固体(收率33.6％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.41(s,1h),8.91(d,j＝2.2hz,1h),8.49(dd,j＝4.7,1.5hz,1h),8.32(d,j＝8.5hz,1h),8.20(d,j＝8.1hz,1h),8.01(d,j＝5.4hz,1h),7.80–7.68(m,2h),7.58(d,j＝16.8hz,1h),7.53–7.39(m,2h),6.96–6.78(m,2h),6.10(s,2h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.70,149.04,148.88,148.53,142.51,142.23,137.15,133.35,133.10,126.54,124.25,122.90,121.91,120.48,110.95,108.57,106.12.hrms(esi-tof)m/zcalcdforc19h16n5[m+h]+:314.1406,found:314.1403.
反式-3-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)吡啶采用实施例24通用步骤的反应条件制备得到。
浅黄色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.77(d,j＝2.1hz,1h),8.53(dd,j＝4.8,1.6hz,1h),8.05(dd,j＝8.0,2.2hz,1h),7.46–7.28(m,2h),6.32(d,j＝18.5hz,1h),1.26(s,12h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ150.32,149.36,146.24,133.83,132.84,124.23,83.64,25.08；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc13h19bno2[m+h]+:232.1510,found:232.1667.
实施例2化合物d1：4-(3-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d1的反应条件与化合物d6类似。浅黄色固体(收率37.4％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.46(s,1h),8.16(d,j＝8.3hz,2h),8.09–7.89(m,3h),7.80(s,1h),7.46(t,j＝9.0hz,2h),6.85(d,j＝22.9hz,2h),6.02(s,2h),3.66(s,2h),2.47–2.22(m,8h),2.15(s,3h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.37,148.44,148.36,143.06,137.90,136.44,132.13,129.36,126.49,121.31,120.05,120.02,114.82,110.41,108.15,105.45,61.81,54.67,52.53,45.69.hrms(esi-tof)m/zcalcdforc24h27n6[m+h]+:399.2298,found:399.2291.
实施例3化合物d2：4-(3-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d2的反应条件与化合物d6类似。白色固体(收率38.6％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.41(s,1h),8.81(d,j＝2.4hz,1h),8.24–8.12(m,2h),8.06(d,j＝5.3hz,1h),7.83(s,1h),7.50(dd,j＝8.6,1.5hz,1h),7.05(d,j＝8.9hz,1h),6.93(dd,j＝5.4,1.7hz,1h),6.87(s,1h),6.06(s,2h),3.63(t,j＝5.0hz,4h),2.48(t,j＝5.0hz,4h),2.29(s,3h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.37,158.32,148.44,145.53,141.27,136.46,135.82,121.31,119.88,118.85,110.39,108.02,107.11,105.44,54.33,45.77,44.52.hrms(esi-tof)m/zcalcdforc22h24n7[m+h]+:386.2094,found:386.2095.
实施例4化合物d3：4-(3-(2-(4-乙基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d3的反应条件与化合物d6类似。黄色固体(收率36.0％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.36(s,1h),8.97(s,2h),8.13(d,j＝8.5hz,1h),8.00(d,j＝5.4hz,1h),7.77(s,1h),7.44(d,j＝8.5hz,1h),6.88(d,j＝3.4hz,2h),6.01(s,2h),3.82(t,j＝4.9hz,4h),2.45(t,j＝5.0hz,4h),2.39(t,j＝7.2hz,2h),1.05(t,j＝7.1hz,3h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.94,156.19,149.00,148.77,145.62,142.30,139.59,137.20,133.70,128.34,121.76,120.45,110.85,108.44,105.93,99.99,52.67,52.14,44.03,12.47.hrms(esi-tof)m/zcalcdforc22h25n8[m+h]+:401.2203,found:401.2201.
实施例5化合物d4：反式-4-(3-苯乙烯基-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d4的反应条件与化合物d6类似，采用4-(3-碘-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺和反式-苯乙烯基硼酸频哪醇酯为原料。浅黄色固体(收率42.7％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.32(s,1h),8.29(d,j＝8.4hz,1h),8.04(s,1h),7.75(s,2h),7.73(s,1h),7.57(d,j＝2.4hz,2h),7.48(d,j＝8.5hz,1h),7.42(t,j＝7.6hz,2h),7.31(d,j＝7.3hz,1h),6.89(d,j＝5.3hz,1h),6.83(s,1h),6.02(s,2h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.94,148.91,142.77,142.25,137.57,137.18,130.09,129.19,128.19,126.93,121.91,121.19,120.89,120.34,110.99,108.46,106.07；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc20h17n4[m+h]+:313.1454,found:313.1462.
反式-苯乙烯基硼酸频哪醇酯采用实施例24通用步骤的反应条件制备得到。
浅黄色油状液体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.60–7.54(m,2h),7.41–7.30(m,4h),6.16(d,j＝18.4hz,1h),1.24(s,12h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ149.68,137.34,129.61,129.16,127.49,83.49,25.10；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc14h20bo2[m+h]+:231.1557,found:231.1537.
实施例6化合物d5：反式-4-(3-(4-甲氧基苯乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d5的反应条件与化合物d6类似，采用4-(3-碘-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺和反式-4-甲氧基苯乙烯基硼酸频哪醇酯为原料。浅棕色固体(收率41.5％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.22(s,1h),8.26(d,j＝8.5hz,1h),8.00(d,j＝5.4hz,1h),7.73(s,1h),7.67(d,j＝8.3hz,2h),7.51(d,j＝16.7hz,1h),7.47–7.38(m,2h),6.98(d,j＝8.4hz,2h),6.88(dd,j＝5.3,1.6hz,1h),6.81(s,1h),6.02(s,2h),3.80(s,3h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.89,159.52,148.94,148.91,143.06,142.23,130.22,129.83,128.27,121.94,121.09,120.14,118.64,114.66,110.92,108.38,105.95,55.64；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc21h18n4ona[m+na]+:365.1379,found:365.1386.
反式-4-甲氧基苯乙烯基硼酸频哪醇酯采用实施例24通用步骤的反应条件制备得到。
浅黄色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.58–7.47(m,2h),7.26(d,j＝18.4hz,1h),6.99–6.84(m,2h),5.97(d,j＝18.4hz,1h),3.77(s,3h),1.24(s,12h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.57,149.36,130.15,129.00,114.55,83.30,55.63,25.09；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc15h22bo3[m+h]+:261.1663,found:261.1537.
实施例7化合物d7：反式-4-(3-(4-甲氧基苯乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d7的反应条件与化合物d6类似，采用4-(3-碘-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺和(e)-4-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)吡啶为原料。浅黄色固体(收率39.1％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.50(s,1h),8.58(d,j＝5.5hz,2h),8.33(d,j＝8.5hz,1h),8.01(d,j＝5.3hz,1h),7.87(d,j＝16.7hz,1h),7.77(s,1h),7.71(d,j＝5.4hz,2h),7.59–7.45(m,2h),6.89(dd,j＝5.3,1.6hz,1h),6.81(s,1h),6.02(s,2h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.92,150.48,149.00,148.77,144.83,142.12,137.38,127.38,125.42,121.88,121.30,120.73,110.92,108.60,105.96；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc19h16n5[m+h]+:314.1406,found:314.1395.
(e)-4-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)吡啶采用实施例24通用步骤的反应条件制备得到。
棕褐色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.77(d,j＝2.1hz,1h),8.53(dd,j＝4.8,1.6hz,1h),8.05(dd,j＝8.0,2.2hz,1h),7.46–7.28(m,2h),6.32(d,j＝18.5hz,1h),1.26(s,12h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ150.32,149.36,146.24,133.83,132.84,124.23,83.64,25.08；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc13h19bno2[m+h]+:232.1510,found:232.1667.
实施例8化合物d8：叔丁基反式-(4-(2-(6-(2-氨基吡啶-4-基)-1h-吲唑-3-基)乙烯基)苯基)氨基甲酸酯
制备化合物d8的反应条件与化合物d6类似，采用4-(3-碘-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺和(e)-(4-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)苯基)羰基叔丁酯为原料。黄色固体(收率40.6％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.22(s,1h),9.45(s,1h),8.25(d,j＝8.5hz,1h),8.00(d,j＝5.3hz,1h),7.72(s,1h),7.62(d,j＝8.4hz,2h),7.50(d,j＝8.5hz,2h),7.47–7.37(m,3h),6.87(dd,j＝5.3,1.6hz,1h),6.80(s,1h),6.01(s,2h),1.50(s,9h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.91,153.15,148.96,142.24,139.65,131.84,129.89,127.39,121.09,120.17,120.17,118.98,118.62,113.22,110.91,108.37,105.93,101.47,79.63,28.61；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc25h26n5o2[m+h]+:428.2087,found:428.2079.
(e)-(4-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)苯基)羰基叔丁酯采用实施例24通用步骤的反应条件制备得到。
浅黄色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.48(s,1h),7.47(s,4h),7.22(d,j＝18.4hz,1h),5.98(d,j＝18.4hz,1h),1.48(s,9h),1.23(s,12h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ153.06,149.43,140.96,131.26,128.12,118.37,83.32,79.70,28.55,24.94；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc19h28bno4na[m+na]+:368.2009,found:368.2011.
实施例9化合物d9：反式-4-(3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d9的反应条件与化合物d6类似。浅棕色固体(收率38.2％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.22(s,1h),8.26(d,j＝8.5hz,1h),8.06(d,j＝5.4hz,1h),7.78(s,1h),7.67(d,j＝8.4hz,2h),7.51(d,j＝16.7hz,1h),7.47–7.38(m,2h),7.01(d,j＝8.4hz,2h),6.78(dd,j＝5.3,1.6hz,1h),6.81(s,1h),6.02(s,2h),3.80(s,3h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.71,153.73,152.26,149.55,149.42,148.21,140.47,129.11,126.57,126.56,125.42,123.84,118.13,113.51,113.43,111.53,111.52,54.94,54.88,54.45；46.34；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc25h27n6[m+h]+:411.2298,found:411.2212.
实施例10化合物d10：反式-4-(3-(4-吗啉基苯乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d10的反应条件与化合物d6类似。棕色固体(收率35.5％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.18(s,1h),8.25(d,j＝8.5hz,1h),8.00(d,j＝5.3hz,1h),7.72(s,1h),7.59(d,j＝8.3hz,2h),7.51–7.32(m,3h),7.03–6.94(m,2h),6.87(dd,j＝5.3,1.6hz,1h),6.81(s,1h),6.01(s,2h),3.75(p,j＝2.5hz,4h),3.17(p,j＝3.2hz,4h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6))δ160.94,150.99,148.97,148.91,144.03,142.25,141.59,137.37,137.14,130.22,130.09,128.51,127.87,121.08,110.99,110.95,105.91,66.48,66.46；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc24h23n5ona[m+na]+:420.1801,found:420.1803.
实施例11化合物d11：反式-5-(2-(6-(2-氨基吡啶-4-基)-1h-吲唑-3-基)乙烯基)-n,n-二甲基吡啶-2-胺
制备化合物d11的反应条件与化合物d6类似，采用4-(3-碘-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺和(e)-n,n-二甲基-5-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)吡啶-2-胺为原料。浅黄色固体(收率40.7％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.16(s,1h),8.36(d,j＝2.4hz,1h),8.24(d,j＝8.4hz,1h),8.00(d,j＝5.4hz,1h),7.96(dd,j＝9.0,2.3hz,1h),7.71(s,1h),7.45(d,j＝1.9hz,1h),7.44–7.40(m,1h),7.34(d,j＝16.7hz,1h),6.87(dd,j＝5.3,1.7hz,1h),6.80(d,j＝1.6hz,1h),6.71(d,j＝8.9hz,1h),6.00(s,2h),3.08(s,6h).hrms(esi-tof)m/zcalcdforc21h21n6[m+h]+:357.1828,found:357.1837.
(e)-n,n-二甲基-5-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)吡啶-2-胺采用实施例24通用步骤的反应条件制备得到。
黄色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.21(d,j＝2.4hz,1h),7.78(dd,j＝9.0,2.5hz,1h),7.19(d,j＝18.4hz,1h),6.64(d,j＝9.0hz,1h),5.86(d,j＝18.4hz,1h),3.05(s,6h),1.23(s,12h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ159.48,148.96,147.22,134.75,121.27,111.82,106.25,83.19,38.05,25.10；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc15h24bn2o2[m+h]+:275.1932,found:275.1926.
实施例12化合物d12：反式-4-(3-(2-(6-吗啉基吡啶-3-基)乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d12的反应条件与化合物d6类似，采用4-(3-碘-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺和(e)-4-(5-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)吡啶-2-基)吗啉为原料。浅黄色固体(收率43.6％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.20(s,1h),8.41(d,j＝2.6hz,1h),8.25(d,j＝8.4hz,1h),8.01(dd,j＝9.5,6.1hz,2h),7.72(s,1h),7.50–7.36(m,3h),6.89(dd,j＝14.3,7.1hz,2h),6.80(s,1h),6.00(s,2h),3.71(t,j＝4.7hz,4h),3.51(t,j＝4.7hz,4h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.91,158.88,148.97,148.91,147.58,143.12,137.11,134.69,127.08,123.37,121.91,120.09,118.04,110.92,108.36,107.52,105.92,66.41,45.54；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc23h23n6o[m+h]+:399.1934,found:399.1932.
(e)-4-(5-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)吡啶-2-基)吗啉采用实施例24通用步骤的反应条件制备得到。
白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.26(d,j＝2.3hz,1h),7.83(dd,j＝9.0,2.5hz,1h),7.21(d,j＝18.4hz,1h),6.83(d,j＝9.0hz,1h),5.93(d,j＝18.4hz,1h),3.69(t,j＝4.9hz,4h),3.57–3.45(m,4h),1.23(s,12h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ159.50,148.65,146.80,135.19,123.03,107.25,83.28,66.37,45.29,25.10；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc17h26bn2o3[m+h]+:317.2037,found:317.2035.
实施例13化合物d13：反式-4-(5-(2-(6-(2-氨基吡啶-4-基)-1h-吲唑-3-基)乙烯基)吡啶-2-基)-1-甲基哌嗪-2-酮
制备化合物d13的反应条件与化合物d6类似。棕色固体(收率37.9％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.36(s,1h),8.97(d,j＝1.5hz,2h),8.14(d,j＝8.5hz,1h),8.01(dd,j＝5.4,1.5hz,1h),7.77(s,1h),7.44(dd,j＝8.5,1.6hz,1h),6.88(dt,j＝5.5,1.6hz,1h),6.81(s,1h),6.01(s,2h),3.83(t,j＝5.0hz,4h),2.46(t,j＝4.6hz,3h),2.39(dd,j＝7.2,1.6hz,2h)；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc24h23n7ona[m+na]+:448.1862,found:448.1881.
实施例14化合物d14：反式-4-(3-(2-(6-(2-甲基-2h-四唑-5-基)吡啶-3-基)乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d14的反应条件与化合物d6类似。棕色固体(收率24.3％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.46(s,1h),9.09(s,1h),8.39(dd,j＝17.4,8.5hz,2h),8.16(d,j＝8.3hz,1h),8.02(d,j＝5.1hz,1h),7.85(d,j＝16.8hz,1h),7.78(s,1h),7.67(d,j＝16.8hz,1h),7.51(d,j＝8.4hz,1h),6.96–6.80(m,2h),6.02(s,2h),4.48(s,3h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.26,151.20,149.76,149.01,147.58,145.53,144.44,143.27,137.73,136.11,134.83,133.21,127.68,124.03,121.59,121.15,120.73,110.74,109.91,39.21；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc21h17n9na[m+na]+:418.1505,found:418.1512.
实施例15化合物d15：反式-4-(3-(2-(6-(1-甲基-1h-四唑-5-基)吡啶-3-基)乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d15的反应条件与化合物d6类似，采用4-(3-碘-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺和(e)-2-(1-甲基-1h-四氮唑-5-基)-5-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)吡啶为原料。棕色固体(收率27.6％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.49(s,1h),9.22–9.11(m,1h),8.53–8.45(m,1h),8.36(d,j＝8.5hz,1h),8.27(d,j＝8.2hz,1h),8.02(d,j＝5.4hz,1h),7.91(d,j＝16.8hz,1h),7.78(s,1h),7.69(d,j＝16.7hz,1h),7.52(d,j＝8.5hz,1h),6.90(d,j＝5.4hz,1h),6.82(s,1h),6.04(s,2h),4.46(s,3h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.91,148.94,148.84,143.09,142.31,137.38,135.24,134.64,125.39,124.98,124.51,121.86,121.37,110.95,108.62,106.00,37.14；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc21h17n9na[m+na]+:418.1505,found:418.1509.
(e)-2-(1-甲基-1h-四氮唑-5-基)-5-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)吡啶采用实施例24通用步骤的反应条件制备得到。
白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.04(d,j＝2.1hz,1h),8.36(dd,j＝8.3,2.2hz,1h),8.30–8.25(m,1h),7.48(d,j＝18.5hz,1h),6.51(d,j＝18.5hz,1h),4.47(s,3h),1.31(s,12h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ152.18,149.41,145.03,144.56,135.52,134.41,124.46,83.84,37.17,25.10；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc15h21bn5o2[m+h]+:314.1789,found:314.1902.
实施例16化合物d16：反式-4-(3-(4-((二甲氨基)甲基)苯乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d16的反应条件与化合物d6类似。浅棕色固体(收率38.1％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.35(s,1h),8.33(d,j＝8.5hz,1h),8.06(d,j＝5.3hz,1h),7.80(s,1h),7.73(d,j＝7.9hz,2h),7.59(s,2h),7.52(dd,j＝8.5,1.5hz,1h),7.37(d,j＝7.8hz,2h),6.86(s,1h),6.69(s,1h),6.06(s,2h),3.45(s,2h),2.24(s,6h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.93,151.93,148.98,148.88,139.65,137.17,136.28,134.44,129.93,129.57,128.49,126.75,125.37,121.90,120.30,110.91,105.94,63.64,45.46；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc23h24n5[m+h]+:370.2032,found:370.2018.
实施例17化合物d17：反式-4-(3-(4-(吗啉甲基)苯乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d17的反应条件与化合物d6类似，采用4-(3-碘-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺和反式-4-(4-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)苄基)吗啉为原料。浅棕色固体(收率41.7％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.29(s,1h),8.28(d,j＝8.5hz,1h),8.01(d,j＝5.3hz,1h),7.74(s,1h),7.68(d,j＝7.9hz,2h),7.54(s,2h),7.47(dd,j＝8.4,1.5hz,1h),7.34(d,j＝7.9hz,2h),6.88(dd,j＝5.3,1.6hz,1h),6.81(d,j＝1.6hz,1h),6.01(s,2h),3.59(t,j＝4.6hz,4h),3.48(s,2h),2.37(t,j＝4.6hz,4h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.92,148.98,148.87,142.82,142.24,137.18,136.40,129.90,129.77,126.79,121.90,121.16,120.55,120.31,110.91,108.43,105.93,66.69,62.66,53.66.hrms(esi-tof)m/zcalcdforc25h26n5o[m+h]+:412.2138,found:412.2143.
反式-4-(4-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)苄基)吗啉采用实施例24通用步骤的反应条件制备得到。
浅黄色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.52(d,j＝7.3hz,2h),7.39–7.20(m,3h),6.21–6.00(m,1h),3.66–3.50(m,4h),3.45(s,2h),2.34(s,4h),1.39–1.13(m,12h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ149.48,139.51,136.20,129.65,127.38,83.46,66.65,62.55,53.63,25.09；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc19h29bno3[m+h]+:330.2241,found:330.2074.
实施例18化合物d18：反式-4-(3-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d18的反应条件与化合物d6类似，采用4-(3-碘-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺和反式-1-甲基-4-(4-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)苄基)哌嗪为原料。浅黄色固体(收率37.5％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.46(s,1h),8.16(d,j＝8.3hz,2h),8.09–7.89(m,3h),7.80(s,1h),7.46(t,j＝9.0hz,2h),6.85(d,j＝22.9hz,2h),6.02(s,2h),3.66(s,2h),2.47–2.22(m,8h),2.15(s,3h)；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.27(s,1h),8.79(d,j＝2.3hz,1h),8.25–8.07(m,2h),8.00(d,j＝5.4hz,1h),7.76(s,1h),7.44(d,j＝8.5hz,1h),7.00(d,j＝8.9hz,1h),6.87(s,3h),6.81(s,1h),6.64(s,1h),6.04(s,2h),3.74(t,j＝4.8hz,4h),3.54(t,j＝4.8hz,4h),2.18(s,3h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.37,148.44,148.36,143.06,137.90,136.44,132.13,129.36,126.49,121.31,120.05,120.02,114.82,110.41,108.15,105.45,61.81,54.67,52.53,45.69；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc26h29n6[m+h]+:425.2454,found:425.2457.
反式-1-甲基-4-(4-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)苄基)哌嗪采用实施例24通用步骤的反应条件制备得到。
棕黄色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.52(d,j＝7.3hz,2h),7.39–7.20(m,3h),6.21–6.00(m,1h),3.66–3.50(m,4h),3.45(s,2h),2.34(s,4h),1.39–1.13(m,12h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ149.34,138.85,136.49,129.75,127.50,126.56,83.50,60.99,53.10,49.63,42.62,25.11；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc20h32bn2o2[m+h]+:343.2558,found:343.2562.
实施例19化合物d19：反式-4-(3-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)苯乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d19的反应条件与化合物d6类似，采用4-(3-碘-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺和(e)-1-(甲磺酰基)-4-(4-(2-(4,4,5,5-甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)苯基)哌嗪为原料。黄色固体(收率32.0％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.29(s,1h),8.28(d,j＝8.5hz,1h),8.00(d,j＝5.3hz,1h),7.78–7.66(m,3h),7.54(s,2h),7.47(dd,j＝8.5,1.5hz,1h),7.35(d,j＝7.8hz,2h),6.88(dd,j＝5.3,1.6hz,1h),6.80(d,j＝1.6hz,1h),6.01(s,2h),3.55(s,2h),3.13(t,j＝4.8hz,4h),2.88(s,3h),2.49(d,j＝3.8hz,4h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.68,148.50,142.81,137.87,129.87,129.71,126.85,121.93,121.19,120.31,110.95,108.50,106.12,61.71,52.25,45.93,34.08；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc25h26n6o2sna[m+na]+:497.1736,found:497.1742.
(e)-1-(甲磺酰基)-4-(4-(2-(4,4,5,5-甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)苯基)哌嗪采用实施例24通用步骤的反应条件制备得到。
浅白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.58(d,j＝7.8hz,2h),7.39–7.29(m,3h),6.16(d,j＝18.4hz,1h),3.57(s,2h),3.15(t,j＝4.8hz,4h),2.91(s,3h),2.50(t,j＝4.8hz,4h),1.29(s,12h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ149.44,139.54,136.30,129.58,127.44,83.48,61.61,52.23,45.92,34.04,25.10；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc20h32bn2o4s[m+h]+:407.2177,found:407.2177.
实施例20化合物d20：反式-4-(3-(3-氯-4-((二甲氨基)甲基)苯乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d20的反应条件与化合物d6类似。棕色固体(收率36.3％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.38(s,1h),8.32(d,j＝8.4hz,1h),8.01(d,j＝5.3hz,1h),7.87(s,1h),7.75(d,j＝8.8hz,2h),7.68(d,j＝16.8hz,1h),7.58–7.47(m,3h),6.90(d,j＝5.5hz,1h),6.82(s,1h),6.05(s,2h),3.40(d,j＝3.1hz,2h),2.33(s,6h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.91,159.61,152.95,148.47,146.10,142.10,138.48,135.68,134.31,131.49,130.71,128.54,127.62,125.32,121.45,120.06,109.27,106.82,61.53,45.91；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc23h23cln5[m+h]+:404.1643,found:404.1629.
实施例21化合物d21：反式-4-(3-(3-氟-4-(吗啉甲基)苯乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d21的反应条件与化合物d6类似，采用4-(3-碘-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺和(e)-4-(2-氟-4-(2-(4,4,5,5-甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)苯基)吗啉为原料。浅棕色固体(收率38.5％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.47(s,1h),9.13(d,1h)8.29(d,j＝8.5hz,1h),8.01(d,j＝5.4hz,1h),7.74(s,1h),7.67–7.56(m,2h),7.56–7.50(m,2h),7.47(dd,j＝8.5,1.5hz,1h),7.41(t,j＝7.9hz,1h),6.81(s,1h),6.01(s,2h),3.58(t,j＝4.6hz,4h),3.53(s,2h),2.40(t,j＝4.6hz,4h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.93,151.92,148.95,148.84,142.52,142.23,139.65,137.24,132.34,128.49,128.49,125.37,122.85,122.10,121.89,121.26,120.42,110.94,108.47,105.97,66.64,55.35,53.45；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc25h25fn5[m+h]+:430.2044,found:430.2058.
(e)-4-(2-氟-4-(2-(4,4,5,5-甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)乙烯基)苯基)吗啉采用实施例24通用步骤的反应条件制备得到。
白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.48–7.33(m,3h),7.28(d,j＝18.4hz,1h),6.19(d,j＝18.4hz,1h),3.56(t,j＝4.6hz,4h),3.50(s,2h),2.37(t,j＝4.5hz,4h),1.25(s,12h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ162.70,160.26,148.14,138.78,132.19,125.50,123.39,113.71,83.59,66.62,54.35,25.09；19fnmr(376mhz,dmso-d6)δ-114.71；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc19h28bfno3[m+h]+:348.2147,found:348.2148.
实施例22化合物d22：反式-4-(3-(3-氯-4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯乙烯基)-1h-吲唑-6-基)吡啶-2-胺
制备化合物d22的反应条件与化合物d6类似。浅黄色固体(收率33.0％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.39(s,1h),8.31(d,j＝8.5hz,1h),8.01(d,j＝5.3hz,1h),7.83(s,1h),7.75(s,1h),7.70(d,j＝8.1hz,1h),7.64(d,j＝16.7hz,1h),7.59–7.45(m,3h),6.88(d,j＝5.5hz,1h),6.81(s,1h),6.02(s,2h),3.57(s,2h),2.46(s,4h),2.42–2.28(m,4h),2.18(s,3h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.92,148.98,148.84,138.29,137.22,135.18,134.23,131.48,128.33,127.59,125.17,122.08,121.95,121.24,120.41,110.91,105.95,58.90,55.12,53.01,46.07；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc26h27cln6[m+h]+:459.2065,found:459.2047.
实施例23化合物d23：反式-(4-(2-(6-(2-氨基吡啶-4-基)-1h-吲唑-3-基)乙烯基)-3-甲基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮
制备化合物d23的反应条件与化合物d6类似。棕色固体(收率27.3％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.41(s,1h),8.37(d,1h),8.29(s,1h),8.22(d,j＝8.2hz,1h),8.01(d,1h),7.89(dd,j＝8.2hz1h),7.70(d,j＝16.5hz,1h),7.54(d,j＝16.5hz2h),7.32(m,2h),6.91(d,1h),6.02(s,2h),3.60(m,4h),2.46-2.41(m,7h),2.26(s,3h)；13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ169.29,160.90,148.96,137.46,136.11,135.28,129.49,126.64,125.38,125.31,123.76,122.91,121.66,121.29,120.58,120.02,110.91,108.54,105.95,46.03,19.99；hrms(esi-tof)m/zcalcdforc27h29n6o[m+h]+:453.2404,found:453.2405.
实施例24、合成(杂)芳乙烯基硼酸频哪醇酯的通用步骤
取相应的芳乙基溴或杂芳乙基溴(2.0mmol，1.0eq)，乙烯基硼酸频哪醇酯(2.2mmol，1.1eq)，dipea(4.0mmol，2.0eq)，pd2(dba)3(0.1mmol，5mol％)以及p(t-bu)3·hbf4(0.2mmol，10mol％)溶于干燥的甲苯(8ml)中，氮气保护后于95℃下反应3小时后，tlc监测反应。浓缩溶剂，加入乙酸乙酯15ml溶解残余物，硅藻土助滤，得到澄清滤液，加入15ml水，萃取，得有机相，干燥，加入适量60-100目硅胶粉，拌样，并硅胶柱层析分离得到相应的产品。
实施例25生物学实验
实验仪器及材料
本发明中生物实验所用到的仪器如下，超净工作台bhc-1000iia/b3：苏净安泰生物技术公司；恒温水浴箱polyscience9505：polyscience公司；灭菌锅mls-3780：sanyo公司；烘箱：binder公司；超纯水仪milli-qintegral10：millipore公司；酶标仪multiscanmk3、细胞培养箱、低速离心机sorvallst1：thermofisher公司；流式细胞仪：bd公司；ph计orionstara211：thermoscientific公司；超声破碎仪sonicmaterialsinc：danbury公司；37℃恒温摇床thermolyne、小型垂直电泳槽mini-protean3、转膜槽minitrans-blot：bio-rad公司；x射线摄影暗匣ax-ⅱ：广东粤华医疗医械厂有限公司；全自动x光洗片机hq-320xt：虎丘影像有限公司；切片烘片机leicarm2125：leica公司；普通光学显微镜及倒置显微镜：olympus公司；荧光倒置相差显微镜：carlzeiss公司；荧光正置相差显微镜：leicadm2500(莱卡)公司和carlzeiss(卡尔蔡司)公司；游标卡尺(0-150mm)：上海申韩量具有限公司。
本发明所采用的细胞株购自美国atcc(americantypeculturecollection)公司，并由四川大学生物治疗国家重点实验室技术人员保存和培养。细胞培养用6、24、96孔板，15ml、50ml离心管、25cm2培养方瓶和75cm2培养瓶均购自成都阿比丁公司。10ml培养皿购自whb公司。基质胶(matrigel)购自bd公司。二甲基亚枫(dmso)、mtt、sds、聚山梨酸酯tween-20、十二烷基磺酸钠sds，甘氨酸，三羟甲基氨基甲烷tris、peg-400购自sigma公司。过硫酸铵aps，氢氧化钠、过硫酸铵、浓盐酸、异丙醇、甲醇等常见分析纯化学试剂为科龙化学公司。生理盐水购自科伦制药有限公司。annexinv-fitc/pi试剂盒、pi试剂、结晶紫染料、ripa细胞裂解缓冲液(强)和丙烯酰胺缓冲液、苏木素染液购自碧云天生物技术公司。n,n,n',n'-四甲基乙二胺temed，g250蛋白定量液购自bio-rad公司。pvdf膜和显影发光底物购自millipore公司。脱脂奶粉购自伊利乳业公司；自显影胶片购自kodak公司。10％aps、1mol/ltris-hcl(ph:6.8)、1.5mol/ltris-hcl(ph:8.8)及电泳缓冲液转膜缓冲液、tbs缓冲液、tbst缓冲液等常见试剂由本实验配制。所有抗体均购自cellsignalingtechnology公司(beverly,ma)。封闭用羊血清、兔血清和dab显色试剂盒购自北京中杉金桥公司。tunel检测试剂盒购自promega公司(rocheappliedscience)。
1、激酶测试
实验方法简述如下：将待测小分子(0.001-10μm)或空白溶剂与待测的蛋白激酶以及相应的多肽底物共同加入到反应缓冲液中孵育，其中，反应缓冲液由8mm丙磺酸盐(mops，ph＝7.0)，0.2mm乙二胺四乙酸(edta)，10mm醋酸镁和km浓度的γ33p-atp溶液组成。整个反应在室温下进行40min后，向反应缓冲液中加入3％的磷酸盐溶液以终止反应。随后定量吸取10μl反应混合液滴在p30滤纸上，并用75mm的磷酸盐溶液清洗3次，再用甲醇清洗一次，将p30滤纸晾干后加入闪烁液进行闪烁计数。化合物的抑制活性用半数抑制浓度ic50来表示，ic50值由各浓度梯度对应的抑制率拟合得到。
2、细胞培养
从液氮中取出冻存保种的肿瘤细胞，迅速置于37℃恒温水浴复温融化，在无菌条件下用培养基洗涤1次。然后用完全培养基接种于培养瓶内，在37℃，5％co2培养箱中培养，第二天置换新鲜细胞培养液。悬浮生长细胞的传代：细胞培养2～3天后，从培养箱中取出培养瓶，收集细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，离心3min，倒去上清液，细胞沉淀用完全培养基重悬并吹打均匀，然后分至3～5瓶培养。一般3～4天传代1次；贴壁生长细胞的传代：细胞贴壁长满至瓶底的80％左右，从培养箱中取出培养瓶，吸去培养基，用0.25％胰酶洗涤1次，然后加入0.25％的胰酶消化液消化，观察细胞收缩变圆后，加入完全培养基终止消化，并吹打使细胞分散脱落，收集细胞悬液，1500rpm/min，离心3min，倒去上清液，细胞沉淀用完全培养基重悬并吹打均匀，然后分至3～5瓶瓶培养。一般3～4天传代1次。
3、激酶测试细胞增殖抑制实验(mtt法)
收集对数生长期的细胞，以每孔2.5×103～1×104个的数量接种于96孔板中，在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养过夜24小时，采用dmem培养基稀释待测药物并加入到96孔板中，每种药物8个梯度，每个梯度含3个复孔。加药组中，按梯度(终浓度分别为1000、333、127、42.3、14.1、4.7、1.56、0.53nm)每孔加入100μl化合物的培养基溶液，每个浓度设3个复孔；阴性对照组每孔中加入含1‰dmso的空白培养基100μl，共6个复孔；空白对照组每孔中只加入100μl培养基。将板置于37℃、5％co2细胞培养孵箱内培养72小时。药物处理组、隐形对照组和空白组每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，继续培养2-4小时，待甲瓒形成后，终止培养，倾去上清液后每孔加150μldmso(对于悬浮细胞则直接加入50μl20％sds溶液)，在摇床上摇15～20分钟。用酶标仪在570nm波长下检测每孔细胞吸光度(od570)，取其平均值记录结果。细胞增殖抑制率＝(对照组od570-实验组od570)/(对照组od570-空白od570)×100％。最后，使用graphpadprism软件拟合半数抑制浓度。二、实验结果
1、化合物对乳腺癌细胞株的抑制结果
表1
a每个化合物测试2次，表格中数值表示平均值。
从上表1可以看出，该类结构对多种乳腺癌细胞株均有较好的抗增殖抑制活性。d10展现了最优的抗乳腺癌增殖活性，其对mcf-7细胞的ic50值达到了390nm。
2、化合物对血液瘤细胞株的抑制结果
表2
a每个化合物测试2次，表格中数值表示平均值。
表2中，a代表化合物对相应靶蛋白的ic50小于1nm，b代表化合物对相应靶蛋白的ic50位于1-10nm之间，c代表化合物对相应靶蛋白的ic50位于10-100nm之间，d代表化合物对相应靶蛋白的ic50大于100nm。
从上表2可以看出，该类结构对多种血液瘤细胞株均展现了良好的抗增殖抑制活性。其中对急性髓系白血病细胞株mv-4-11的效果最好，并且对于其他的血液瘤细胞株展现了良好的选择性。
3、化合物对flt3-d835y点突变激酶的的抑制结果
表3
表3中，a代表化合物对相应靶蛋白的ic50小于1nm，b代表化合物对相应靶蛋白的ic50位于1-10nm之间，c代表化合物对相应靶蛋白的ic50位于10-100nm之间，d代表化合物对相应靶蛋白的ic50大于100nm。
表4d16-d20对flt3以及csf1r活性的抑制的ic50值a
a每个化合物的ic50测试1次，每个ic50设10个浓度，从10μm开始，三倍稀释。
表4中，a代表化合物对相应靶蛋白的ic50小于10nm，b代表化合物对相应靶蛋白的ic50位于10-100nm之间，c代表化合物对相应靶蛋白的ic50位于100-1000nm之间，d代表化合物对相应靶蛋白的ic50大于1000nm。
以上测试结果表明这些化合物对于急性髓系白血病肿瘤细胞具有良好的抗增殖抑制活性，并且对flt3、csf1r等蛋白激酶靶点具有良好的效果，而对于flt3突变激酶的效果也非常显著。