本发明属于分子遗传育种领域，具体地说，涉及与花生含油量相关的分子标记ppgpseq2a5的应用。
背景技术：
：花生是我国十分重要的油料作物、经济作物和出口创汇作物，在我国农业生产中具有十分重要的作用。每年，我国花生总产量的约60％用于榨油，占我国国产植物油总量的26％左右。据测算，榨油花生原料每提高1个百分点，相当于产量提高2个百分点，加工效益可提高7％。目前，我国主要花生品种的含油量为45％～55％，平均含油量为50.6％，栽培种花生狭窄的遗传差异性限制了其含油量的进一步提高。姜慧芳等对87份野生花生资源的含油量分析表明：平均值为55.82％，变异范围为51.44％～62.9％；野生花生资源材料含油量无论最高值、平均值，还是变异范围都比栽培种花生要大。因此，将野生花生资源中控制高含油量的基因导入到栽培花生品种中是提高现有品种含油量的有效途径。但是由于花生含油量是较为复杂的数量性状，受环境影响大，因此通过常规方法测定含油量，筛选高含油量材料的效果不好、准确性差、效率较低。基于分子标记辅助选择技术的分子标记辅助育种是作物分子育种的重要方面，其能快速高效获得含有目的基因的个体，现已在育种中得到广泛的应用并在某些性状上取得成功。ssr(simplesequencerepeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物pcr为基础的分子标记技术，也称为微卫星dna(microsatellitedna),是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。与其它分子标记相比，ssr标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性。目前，与野生花生含油量紧密连锁的分子标记的开发不多、应用较少。技术实现要素：本发明的目的是提供与花生含油量相关的分子标记ppgpseq2a5的应用。为了实现本发明目的，本发明提供与花生含油量相关的分子标记ppgpseq2a5的以下任一种应用：i)鉴定及选育高含油量花生品种中的应用；ii)高含油量花生品种早期筛选中的应用；iii)花生分子标记辅助育种中的应用。对于上述i)和ii)，利用seqidno:1-2所示引物对待测花生材料的基因组dna进行pcr扩增，扩增产物进行电泳检测，若仅出现290bp大小的特征条带，则判定待测花生材料的种子具有较高的含油量，若仅出现260bp大小的特征条带，则判定待测花生材料的种子具有较低的含油量。本发明所述花生包括花生野生种arachisduranensis。本发明分子标记ppgpseq2a5是通过以下方法获得的：(1)考察并统计花生野生种——a.duranensis的6份资源的含油量，其编号及含油量分别为：wh4416(51.2％)、wh4417(52.3％)、wh4340(59.4％)、wh4396(60.3％)、wh4399(60.1％)及wh4414(59.5％)；(2)用ctab法提取步骤(1)中6份材料的叶片dna；(3)选用与含油量相关基因的连锁群上的40对ssr引物对步骤(2)中的dna进行扩增；(4)对步骤(3)中的扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，统计不同ssr引物扩增下6份材料的扩增片段大小；(5)将步骤(1)中统计的含油量结果与步骤(4)中统计的ssr带型综合分析，筛选出带型较为单一，在高、低含油量材料间带型不同，但在所有高含油量中带型相同，同时在低含油量材料中带型也相同的ssr标记——ppgpseq2a5。在该标记中，高含油量材料wh4340、wh4396、wh4399、wh4414所扩增片段大小为290bp，而低含油量材料wh4416、wh4417中扩增出的片段大小为260bp。所述ssr分子标记ppgpseq2a5位于花生a8染色体39.9mb的位置，其ssr序列为(taa)19。本发明还提供所述ssr分子标记ppgpseq2a5引物(seqidno:1-2)的以下任一种应用：i’)鉴定及选育高含油量花生品种中的应用；ii’)高含油量花生品种早期筛选中的应用；iii’)制备用于鉴定及选育高含油量花生品种的检测试剂或试剂盒中的应用。对于上述i’)和ii’)，利用seqidno:1-2所示引物对待测花生材料的基因组dna进行pcr扩增，扩增产物进行电泳检测，若仅出现290bp大小的特征条带，则判定待测花生材料的种子具有较高的含油量，若仅出现260bp大小的特征条带，则判定待测花生材料的种子具有较低的含油量。前述的应用，pcr扩增的反应体系为10μl，包括trans2×ecotaqpcrsupermix(含染料)5μl、待鉴定花生材料的dna模板10～20ng，0.4μm上游引物，0.4μm下游引物。pcr扩增反应的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃复性45s、每个循环降低1℃，72℃延伸45s，共10个循环；94℃变性30s，55℃复性45s、72℃延伸45s，共30个循环；最后72℃延伸10min。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：本发明通过对花生野生种——a.duranensis的6份资源进行ssr遗传分析和含油量测定，筛选出了与含油量紧密连锁的ssr分子标记ppgpseq2a5，用于高含油量的花生品种的标记辅助选择。本发明方法方便快速，不受环境影响，目的性更强，工作量小，效率更高，成本低，通过对标记ppgpseq2a5的检测，可在苗期鉴定和筛选出高含油量花生材料，大大节约生产成本和提高选择效率。附图说明图1为本发明实施例1中分子标记ppgpseq2a56在野生花生材料wh4416、wh4417、wh4340、wh4396、wh4399及wh4414中的扩增片段。图2为本发明实施例1中筛选标记时不同标记引物在6份野生花生材料中的扩增片段。其中，1-6分别为花生材料wh4340、wh4396、wh4416、wh4399、wh4414、wh4417。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1ssr分子标记ppgpseq2a5的获得(1)供试材料：花生野生种——a.duranensis材料，编号及含油量分别为wh4416(51.2％)、wh4417(52.3％)、wh4340(59.4％)、wh4396(60.3％)、wh4399(60.1％)及wh4414(59.5％)。(2)用ctab法提取上述6份材料的叶片dna。(3)选用与含油量相关基因的连锁群上的40对ssr引物对步骤(2)中的dna进行扩增。(4)对步骤(3)中的扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，统计不同ssr引物扩增下6份材料的扩增片段大小。(5)将步骤(1)中统计的含油量结果与步骤(4)中统计的ssr带型综合分析，筛选出带型较为单一，在高、低含油量材料间带型不同，但在所有高含油量中带型相同，同时在低含油量材料中带型也相同的ssr标记——ppgpseq2a5。在该标记中，高含油量材料wh4379、wh4399、wh4340、wh10071所扩增片段大小为290bp，而低含油量材料wh4364、wh4341中扩增出的片段大小为260bp(图1)。40对ssr引物的信息见表1：表140对ssr引物的信息(5′-3′)引物名称上游引物下游引物tc9f10atcacaatcacagctccaacaaggcaagtctaatctcctttccaahgs1285catagacaacaatcataaaggttcaatttggctaacaatttgcttcaatc6h03tcacaatcagagctccaacaacaggttcaccaggaacgagtahgs3201ctgtgaagcaatggtgctgtcagggaaatcattgtcagggahgs1470gacaccgctggacaagaaagatcaaagcaacaacgggaacrn18h05aatcaagctccaagatttcgctcaatgcagagatccatgataahs1969gctaaacgacgaaccaaagcgcggctgagtagtggagttttc22c01agaccctcaacttccagaactccaatgaagggcaaacattatcarm17h09cccatcacagttggcatatcttgtagtggattagacagccccrm5g08atagtccatgatagccccatgtttacaaccgaatctgcaaagactc23h09ggaaccagcttcactttcatcttattctaattccggtttccctgahgs2608atctgctgtccaggaagctccgcatcagtatgccaaaagaahgs3212cgagattgcgatacacctcatccctcaacctctcaaatcgahs0661gcgattgggagctttattgaatgaacttggagcagaacggahgs2151agcgctagcagagtgtgtgagtcagcaaaccaaatccaccahgs1385tccctttgcttgttaccacaaattttgaaagcgggcataaahgs1891cagcaaccagcaactcagaagcgaactctgcacacatcatahgs0208tgtaatccttgctgtggtgggaagccttctcacggttctgppgpseq2a5gggaatagcgagatacatgtcagcaggagagaaggattgtgccahgs1578acggttgtgaagggatcaagcccgtatttctttcacccaaahs0116acaagaccaccaccatagcccggttatgagggggaagattahgs1884cggacacattctttcatccctctcctttgttgtgacgacgahs2990tcttcttttgggtgtgcctcgggtaaaccctgttggtgtgahs1582tcaacatcaccatcaccaccaattccaacaaatcaccccaahgs2185tgctttcccgttacttttggctgaagggtatggtacaaccgahs0608cagtttggcttgggacagttcctctgattcacgcctcttcahgs3171tgatatattaaagcatgcaactaacaaccaaagatggagccatatgaaahgs2561cctctccctctctccctctcccgtaattcgtttcccttcaahgs1312aagccccaatgttttcacagtgatatcaatccacacgatggahs3040aggcattgctaacacggtttaaatcctagctagaaataggggaaagm1628aaacgtgctctagaaacatacaaaacaacacatgcaatgcaacaaahgs1644tcctgctagctctctatccagaagtgcgaactgtggaaatcctahs0796cccatcagagggaaagttcaagaagtgcactggttgtccctc9f04cctaaacaacgacaaacactcaaagcacaacacagaaccctaaaahgs1421tgaatgaccaccgacaaagaaaacggagtgagagaagccaahgs3227ccagagttgtctgcctgtcaggtcaaaaacagcacattggahgs1727accatcatcatggctggttgttcagctcaacagtcgcattahs0039aacacatcactttccttttccaggaatgaaggtgtgtgagcaahgs3163caaatcttaccctaccaattccatagcggccaccctatatgacahs2019ggaattctctcaaggcctccataagatggagtgttcgccg不同ssr标记引物在6份野生花生材料中的扩增结果见图2。从图2可以看出，引物对ppgpseq2a5扩增的条带中，低含油量材料wh4416、wh4417带型一致，而四份高含油量材料wh4340、wh4396、wh4399和wh4414带型一致，并且两种带型有较明显差别；而除该引物对以外的其他39对引物所扩增条带不具有该显著特征。实施例2标记ppgpseq2a5的应用供试材料：花生野生种——a.duranensis材料，编号wh4396、wh4398，提取以上材料的全基因组dna。基因型鉴定：利用分子标记ppgpseq2a5对wh4396和wh4398的全基因组dna进行pcr扩增，扩增产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测片段大小。表型鉴定确认：利用核磁共振或索氏提取方法测定待检测材料的含油量。对比基因型鉴定结果发现，在wh4396(含油量57.6％)中扩增出290bp的片段，而在wh4398(含油量52.6％)中扩增出260bp的片段。因此，分子标记ppgpseq2a5能够准确区分花生野生种——a.duranensis中高含油量及低含油量材料，高含油量材料扩增出290bp片段，低含油量材料扩增出260bp片段。其中，pcr反应体系为10μl，包括trans2×ecotaqpcrsupermix(+dye)5μl、基因组dna模板10～20ng，0.4μm上游引物,0.4μm下游引物。pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、65℃复性45s(每个循环降低1℃)、72℃延伸45s，共10个循环；94℃变性30s、55℃复性45s、72℃延伸45s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>中国农业科学院油料作物研究所<120>与花生含油量相关的分子标记ppgpseq2a5的应用<130>khp181111966.4<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gggaatagcgagatacatgtcag23<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2caggagagaaggattgtgcc20当前第1页12