本发明涉及生物检测技术领域，涉及一种物种分子标记鉴定，具体是一种食用百合种质资源的分子鉴别方法。
背景技术：
食用百合是野生百合经过多年驯化、品种筛选以及人工栽培后，获得可食用的百合品种，其药食两用的特点，使其成为一种营养价值较高的经济作物。目前，国内可食用的百合品种约有10种，其中栽培面积大，商品化程度高，市面上热销的食用百合品种分为：兰州百合、龙牙百合、宜兴百合（卷丹）和岷江百合。食用百合生长成为商品，需在田间生长需要3-7年，具有较高的经济价值，因此，在市场经济利益的驱动下，已经出现商家混淆品种的现象。此外，百合食品加工趋向的多元化，百合干，百合粉等诸多形态的商品出现，以往通过外形、味道鉴别的方法已经不能胜任，例如宜兴百合（卷丹）的干状物为国家指定中药材，而兰州百合和龙牙百合的干状物在外形上与宜兴百合（卷丹）的干状物基本相同，难以辨别，虽然国家药典规定了宜兴百合（卷丹）的鉴别方法，但该方法存在一定缺陷，不能鉴别混样。鉴于目前食用百合市场存在的现状，对我国主要食用百合品种进行分子标识，解决食用百合商品中违规互掺难以鉴别的技术问题，符合现代食品安全策略，对维护食用百合市场秩序和安全，具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种食用百合种质资源的分子鉴别方法，该方法可对主要食用百合品种进行分子标识和鉴别，可鉴定微量痕迹，尤其适用于鉴定混合样本。此外，该方法使用分子实验的基础仪器，检测结果准确，是一种简单、可靠的分子鉴别方法。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方法为：
一种百合种质资源的分子鉴别方法，包括如下步骤：
a、提取百合待测样品dna；
b、以百合待测样品dna为模板，利用特定引物进行pcr扩增，特定引物f为taagtatgtccagcccggag，r为gtgggtcccttcagggttt；
c、利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，对pcr产物进行显现，形成电泳图谱；
d、电泳结果用凝胶成像仪观察、拍照、记录与分析，识别电泳图谱中的特异性条带，鉴别百合种质。
所述步骤a中百合采用试剂盒提取，取百合样本置于研钵中，加入液氮研磨成粉状组织，粉状组织装于离心管中，按照dna提取试剂盒提供的试剂及步骤进行基因组提取，最终获得的基因组用双蒸水ddh2o溶解，置于-25℃环境中进行保存。
所述步骤b中pcr扩增为：2×taqpcrmastermix10μl、引物1.6μl、百合待测样品dna模板1.0μl，去离子水6.0μl。
所述步骤b中pcr扩增步骤：94℃预变性5min，进行循环反应94℃变性45s、57℃退火45s、72℃延伸反应1min，反复35个循环，在72℃延伸10min。
所述步骤a中待测样品dna模板为百合鲜样、百合干或百合粉。
所述步骤c中用tbe缓冲液配置质量浓度8%的聚丙烯酰胺凝胶，pcr扩增产物点样8μl，以dnamarkerdl500做分子量标记，电压180-220v，电泳处理时间60-90min。
所述步骤d不同食用百合的特异性条带特征为：兰州百合为310bp、175bp和48bp，宜兴百合为315bp，龙牙百合为495bp和260bp，岷江百合为225bp和140bp，麝香百合为140bp。
本发明的有益效果为：
本发明鉴别能力强，鉴定过程简单，鉴定结果可靠的特点，首先通过琼脂糖凝胶电泳确定引物pcr产物的稳定性及其最佳退火温度，其次，利用丙烯酰胺凝胶电泳获得该引物pcr产物的清晰电泳图谱，最后，详尽分析电泳图谱，汇总引物的多态信息并标记特征位点。根据引物信息进行评估和选择，可对参试物种进行遗传图谱构建、多样性评价和种质鉴定等多项遗传分析。本次试验研究以鉴定品种为终极目的，本试验研究采用了引物筛选策略，即以差异较大的品种做相互对照，忽视引物的多态性，强调引物的差异性，通过梯度pcr体系与琼脂糖电泳直接进行鉴定引物的筛选。针对百合的遗传特征，本次试验采用的鉴定引物筛选策略，极其高效，可为其它类似百合遗传特征的农产品，在分子层面开发种间鉴定提供参考依据。
附图说明
图1为不同百合产品基因组提取的age电泳结果；
图2为引物对不同百合产品pcr扩增产物的page电泳结果图；
图3为引物梯度pcr扩增的对比结果图；
图4为不同百合品种的特异性位点标识图；
图5为食用百合的丙烯酰胺凝胶电泳图谱。
具体实施方式
一种百合种质资源的分子鉴别方法，包括如下步骤：
a、提取百合待测样品dna；
b、以百合待测样品dna为模板，利用特定引物进行pcr扩增，特定引物f为taagtatgtccagcccggag，r为gtgggtcccttcagggttt；
c、利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，对pcr产物进行显现，形成电泳图谱；
d、电泳结果用凝胶成像仪观察、拍照、记录与分析，识别电泳图谱中的特异性条带，鉴别百合种质。
所述步骤a中百合采用试剂盒提取，取百合样本置于研钵中，加入液氮研磨成粉状组织，粉状组织装于离心管中，按照dna提取试剂盒提供的试剂及步骤进行基因组提取，最终获得的基因组用双蒸水ddh2o溶解，置于-25℃环境中进行保存。
所述步骤b中pcr扩增为：2×taqpcrmastermix10μl、引物1.6μl、百合待测样品dna模板1.0μl，去离子水6.0μl。
所述步骤b中pcr扩增步骤：94℃预变性5min，进行循环反应94℃变性45s、57℃退火45s、72℃延伸反应1min，反复35个循环，在72℃延伸10min。
所述步骤a中待测样品dna模板为百合鲜样、百合干或百合粉。
所述步骤c中用tbe缓冲液配置质量浓度8%的聚丙烯酰胺凝胶，pcr扩增产物点样8μl，以dnamarkerdl500做分子量标记，电压180-220v，电泳处理时间60-90min。
所述步骤d不同食用百合的特异性条带特征为：兰州百合为310bp、175bp和48bp，宜兴百合为315bp，龙牙百合为495bp和260bp，岷江百合为225bp和140bp，麝香百合为140bp。
具体对比结果结合实验具体说明
1材料与方法
1.1材料
参试百合材料共计240份，详见表1，所有材料经过甘肃省农业科学院质量标准研究所和甘肃省中医院鉴定。
上表中甘肃省兰州市百合产区实地采集，以行政村为单位，分别为：青岗村、上岭村、袁家湾村、草原村、康家山村、王家坪、红岩沟村、祁家岭村、康泉村、王家窑村、红楼村、湾腰子村，每处采集点随机采集两处。山东沂水中国百合育种基地种质为标准品，该处提供的资源由中国农业科学院蔬菜研究所保障。
1.2试剂与仪器
tiangen植物基因组提取试剂盒（离心柱型）、goodview核酸染料、dnamarker（dl500bp，dl2000bp）天根生化科技有限公司；琼脂糖、50×taeelectrophoresisbuffer、50×tbeelectrophoresisbuffer生工生物工程（上海）股份有限公司；三氯甲烷广州瑞真生物科技有限公司；taqdna聚合酶混合液、dntps（2.5mmol/l）、page-pre-solution(40%，19:1)北京索莱宝科技有限公司，所有化学试剂均为分析纯。
v600型琼脂糖凝胶电泳仪北京君意东方电泳设备有限公司；dyy-12型核酸电泳仪北京六一生物科技有限公司；bio-radt100pcr仪、geldocxr+凝胶成像系统伯乐生化仪器公司；hitachirx
1.3方法
1.3.1样本dna的提取
采用试剂盒提取法。不同状态的样本均取1g左右的置于研钵中，加入适量液氮进行研磨，将研磨成粉状组织装于1.5ml的离心管中，按照dna提取试剂盒提供的试剂及步骤进行基因组提取，最终获得的基因组用ddh2o溶解，置于-25℃环境中进行保存。
1.3.2ssr引物的设计及获取
通过ncbi官方网站，获得百合属（liliuml）est序列共3902条，将est序列信息保存为fasta格式文件，利用perl计算机语言中的est_timmer.pl程序，去除est序列中过短的序列（<100bp）和过长的序列（>700bp）和mrna的“帽子”和“尾巴”，利用cd_hit程序去除冗余序列，利用misa.pl程序识别定位ssr位点，通过primer3程序模块，批量生成est-ssr引物信息，发送引物信息至引物合成公司，生成试验所需引物。
1.3.3pcr扩增体系与凝胶电泳体系。
pcr反应体系：2×taqpcrmastermix10μl、引物1.6μl、百合待测样品dna模板1.0μl，去离子水6.0μl。94℃预变性5min，进行循环反应94℃变性45s、57℃退火45s、72℃延伸反应1min，反复35个循环，在72℃延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳体系：用1×tae电泳缓冲液制备1.5%（w/v）的琼脂糖凝胶。将10μl的pcr扩增产物，在凝胶板上的孔中点样，用dnamarkerdl2000bp做分子量标记，电压（90-110v），电泳时间30min。
丙烯酰胺凝胶电泳体系：用0.5×tbe配置8%的page凝胶，pcr扩增产物点样8μl，以dnamarkerdl500做分子量标记，电压（180-220v），电泳时间为60-90min。电泳结果用凝胶成像仪观察、拍照、记录与分析。
1.3.4pcr产物序列的分析与鉴定引物的筛选
以麝香百合和兰州百合品种做相互对照，通过琼脂糖凝胶电泳，以对照基因组梯度pcr扩增产物相互间具有显著差异为特征，依次筛选ssr引物，将初筛获得的ssr引物，对所有参试样本进行pcr扩增，通过丙烯酰胺凝胶电泳体系，获得高分辨率泳带图谱，通过对图谱的辨识和分析，以同一品种共有特异性条带和不同品种间差异条带为特征，对初筛引物再次筛选，以期获得可用于品种鉴定的引物及相关鉴定信息。
结果与分析
2.1不同百合产品提取基因组的结果
本次参试百合样本有百合鲜样、百合干和百合粉，琼脂糖电泳结果显示，植物基因组提取试剂盒对百合鲜样和干状物的基因组提取质量较好，而百合粉提取的基因组条带模糊，降解严重（图1）。图1中1-2为鲜百合；3-4为百合干；5-6为百合粉。丙烯酰胺凝胶电泳结果进一步显示，同一品种的百合鲜样与百合干的基因组pcr扩增产物泳带清晰，且相互间存在同一特征泳带，而百合粉的基因组pcr产物带型突增，泳带模糊，其主要特征泳带发生变化（图2），图2中1-8为麝香百合;9-16为兰州百合。以上结果表明，利用植物基因组提取试剂盒提取百合鲜样和百合干的基因组，可以参与相关分子标记的研究，而通过百合粉提取的基因组质量较差，其分子标记结果不可靠，不能进行后续相关分子标记研究。
2.2ssr引物的pcr扩增产物分析与鉴定引物筛选结果
通过对百合公布的est序列进行ssr引物设计，共计获得199对ssr引物，琼脂糖电泳结果显示，199对ssr引物对两个对照品种进行pcr扩增，随着梯度温度的变化，其扩增出的泳带表现出应有的“梯度”特征，该结果表明，利用perl计算机语言批量设计est-ssr引物的方法有效、可靠，可以作为ssr引物设计的方法之一。其次，通过对电泳图谱的进一步分析，199对ssr引物的pcr扩增产物有四种结果：一、对照间带型差异较小（图3a），二、对照间带型一致（图3b），三、参试样本之一没有pcr扩增产物（图3d），四、对照间带型具有显著差异（图3c），扩增出四种带型图谱所用ssr引物的比例为依次为106:88:4:1，基于本次试验以筛选鉴定引物为目的，因此，对比琼脂糖电泳初筛结果，舍弃图3a、3b、3d泳带对应的ssr引物，以扩增出图3c泳带图谱的引物作为初筛鉴定引物。此外，该试验结果表明，利用差异较大的百合品种做相互参照，结合梯度pcr与琼脂糖凝胶电泳，进行ssr鉴定引物筛选的方式是有效的。
2.3初筛鉴定引物对参试百合品种的pcr扩增结果
丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，初筛获得的1对ssr引物对参试的240份百合样本均能进行pcr扩增，除宜兴百合外，其余参试的百合品种均有明显的特征泳带，由于参试样本中存在同一品种来源地不同及不同性状农产品（鲜百合、百合干）参与的状况，且经过多次重复试验，试验结果一致，因此，试验结果较为可靠，该引物可以作为参试百合品种的鉴定引物，其应用鉴定的详细信息分别为，引物（f:taagtatgtccagcccggag，r:gtgggtcccttcagggttt）；tm值57℃；鉴别位点：甘肃兰州百合甘肃兰州百合310bp，175bp，48bp，宜兴百合315bp，四川岷江百合225bp，140bp，江西永丰龙牙百合495bp，260bp，湖南隆回龙牙百合550bp，495bp，260bp。（图4）。
图5中a:兰州百合;b:岷江百合;c:麝香百合;d:永丰龙牙百合;e:隆回龙牙百合
图5为五种食用百合的丙烯酰胺凝胶电泳图谱；泳道从左往右依次为：1泳道：marker500；2-7泳道：兰州百合；8-13泳道：岷江百合；14-19泳道：麝香百合（花卉）；20-25泳道：宜兴百合；26-31泳道：永丰龙牙百合；32-37泳道：隆回龙牙百合，38泳道：marker500，其中兰州百合特异性条带为a处，岷江百合特异性条带为b处，麝香百合特异性条带为c处，宜兴百合特异性条带为d处，龙牙百合特异性条带为e处。