本发明属于无创产前筛查检测领域，具体是指一种胎儿染色体非整倍体检测中dna的检测及质控方法。
背景技术：
生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。第一代测序仪对电泳分离技术的依赖，使其难以进一步提高分析的速度和并行化程度，也难以通过微型化降低测序成本。经过不断的技术开发和改进，21世纪初，以roche454技术、illumina公司的genomeanalyzer技术和abi公司的solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代技术大大降低了测序成本，还大幅度提高了测序速度并保持了高准确性。其中，illumina公司的第一台测序仪于2006年问世，之后开发出来一系列的测序仪，如hiseq2000、hiseq2500、miseq、hiseqx等，在准确性、通量、成本和速度方面表现更优秀，而使其成为全球使用量最大的第二代测序仪。在第二代测序平台不断完善的同时，以对单分子dna进行非pcr测序为主要特征的第三代测序技术也初显端倪。但由于其关键技术问题尚待解决，目前还未得到广泛应用。
唐氏综合征，又称21-三体综合征或者先天愚型，是由新生儿染色体异常所引起的先天性疾病。唐氏综合征的发病概率大约在1/800～1/600，在小儿三体型染色体疾病中占的比重最高，约为70％～80％，而且该病的发病率会随着产妇生育年龄的增高而上升。产前诊断筛查对于筛查唐氏综合症是很重要而且很有实用性的一部分，大家所熟知的产前诊断筛查方法主要是传统的一些筛查方法，如羊膜腔穿刺抽取羊水、绒毛膜取样以及穿刺抽取脐带血等方法。这些方法带有一定的创伤性，对孕妇和胎儿也会造成一定的危险，严重者甚至可能会带来流产的风险。而且，穿刺抽取羊水要在孕妇孕周达到16周以后才能进行，因为孕周16周后胎儿才能达到一定的成熟度，易于检测。如果此时诊断结果显示胎儿染色体异常，则已经错过了最佳的流产时期，可能需要通过引产来解决，这大大增加了孕妇的痛苦且增加了并发症发生的可能。
上世纪九十年代，有研究报道了孕妇的血液循环中有胎儿游离dna(cff-dna)的存在，后来有研究也报道发现孕妇血浆中存在胎儿核糖核酸(rna)，这些重大的临床研究发现为无创性产前筛查胎儿染色体异常提供了新的可能性。近年来无创性产前筛查诊断取得了巨大的突破和进展，胎儿游离细胞已经成功地应用于非侵入性产前诊断胎儿性别和rh血型鉴定，这些重大的研究和成果都是建立在对母体血浆中cff-dna序列测定的基础上实现的。但是在孕妇血浆中，母源性游离dna含量占整个游离dna的绝大部分，cff-dna只占孕妇血浆中游离dna总量的3％～5％，所以传统的dna提取技术及pcr等方法难以对胎儿唐氏综合征进行准确的判断。
因此，高效、准确的检测判断胎儿染色体是否为非整倍体就显得极为重要，同时也成为了无创产前筛查技术的关键。
按照目前现有的样本采集流方法，样本采集过程不标准，样品保存和质控不合格、容易导致样本失效、采样量不够、血浆分离不彻底等问题，影响检测各环节的成功率。
因此，如何研发一种胎儿染色体非整倍体检测中dna的检测及质控方法，能够解决上述问题，便成为亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
本申请解决的主要问题是提供一种胎儿染色体非整倍体检测中dna的检测及质控方法，操作简单、流程科学，标准明确，实践操作效果好，样品合格率更高、保存和质控更合理明晰。以解决一种胎儿染色体非整倍体检测中dna的检测及质控方法成本高、流程不科学，标准不明确，实践操作效果不佳、操作难度高、难以复制操作、样本采集过程不标准，样品保存和质控不合格、容易导致样本失效、采样量不够、血浆分离不彻底等问题，影响后续的检测和后续环节的成功率的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种胎儿染色体非整倍体检测中dna的检测及质控方法，其技术方案如下：
一种胎儿染色体非整倍体检测中dna的检测及质控方法，其特征在于，包括：
步骤a：样本采集、保存及质控；
步骤b：dna提取；
步骤c：文库构建；
步骤d：文库浓度测定及保存；
步骤e：上机测序；
步骤f：结果分析；
其中，所述步骤a包括：
样本采集：采血管一采集5.0ml孕妇外周血，采集完毕后，轻柔颠倒采血管并及时将采血管放置冰箱中；采血管二采集10.0ml孕妇外周血，采集完毕后，轻柔颠倒采血管并常温保存；预冷低速离心机至温度稳定后，放入采血管二，离心分钟，吸取上清血浆，转移至置于冰盒上的2.0mlep管中，标记相应的样品编号；预冷高速离心机至温度稳定后，放入上步所得2.0mlep管并离心，枪头对着非白细胞沉淀处，在冰盒上吸取上清血浆，分装至置于冰盒上的1.5mlep管中，每管转入400ul血浆，标记样品编号和血浆管数，立即放入冰箱中保存；对该保存的样品进行质控和处理。
进一步的，所述步骤c包括：
步骤a：对样本dna进行物理打断，得到片段化dna溶液；
步骤b：对所述片段化dna进行末端修复及磁珠纯化，得到纯化好的平末端dna；
步骤c：对所述平末端dna进行接头连接，得到连接接头的dna；
步骤d：对所述连接接头的dna进行pcr扩增，得到文库；
其中，所述步骤c具体包括：
在离心管中依次加入25ul平末端dna、16ul无核酸酶水、5ul连接缓冲液、1uldntp、1uldna连接酶、1ulp1接头和1ul标签序列x并混匀，将反应液振荡混匀3秒，瞬瞬时离心，25c下反应30分钟，4℃保存，反应结束后向对应孔中加入80ul磁珠b2，吹打混匀，静置5分钟；
将离心管放置在磁力架上，待磁珠吸附完全溶液变澄清之后吸去上清；加入75％乙醇，转动离心管两圈，溶液澄清后吸去上清；重复加入75％乙醇，转动离心管两圈，溶液澄清后吸去上清；
取下离心管，离心数秒后将离心管置于磁力架上，待磁珠吸附完全之后吸去残留溶液，敞开管盖，室温晾干≤5分钟；
加入20ulte溶液，吹打混匀后静置5min；瞬时离心，将离心管置于磁力架上静置至溶液澄清，将管内液体转移18.2ul至pcr管④中，即为纯化好的连接接头的dna。
所述步骤b具体包括：
在所述39.5ul片段化dna溶液中依次加入10ul末端修复缓冲液和0.5ul末端修复酶，涡旋混匀，离心后室温反应18-25分钟；
将磁珠b1、b2置于室温平衡并振荡摇匀，往上步溶液中加入100ul磁珠b1，振荡30秒，静静置5分钟，瞬时离心，放置磁力架上静置3分钟；
向新管②中加入100ul磁珠b2，待磁珠b1吸附完全溶液变澄清之后，对应编号将全部上清液小心转移至新管②中，振荡3秒，静置5分钟，瞬瞬时离心，放置磁力架上静置，待磁珠吸附完全溶液变澄清之后后，吸去上清，注意不要吸到磁珠；
加入新鲜配制的75％乙醇500ul，转动离心管2圈，放置磁力力架上静置，待液体澄清后弃上清留约5μl；重复加入新鲜配制的75％乙醇500ul，转动离心管2圈，放置磁力力架上静置，待液体澄清后弃上清留约5μl；取下离心管，离心数秒后将离心管再次置于磁力架上，待磁珠吸附完全之后吸去残留溶液，管壁上不能有残留，打开离心管管盖，使乙醇充分挥发，晾干磁珠；磁珠颜色变浅，无水样光泽，不可干至表面裂开。
加入27ulte溶液，涡旋混匀静置5分钟，将离心管放置在磁力架上，待磁珠吸附完全，溶液变澄清之后将管内液体转移25l至1.5ml第三新管中，得到纯化好的平末端dna，置于-20℃保存。
所述步骤d具体包括：
在pcr管中一次加入18.2ul连接接头的dna、50ulpcr扩增试剂和1.8ulpcr引物；振荡混匀3秒，瞬时离心，将pcr管放pcr仪上，按下表条件进行反应：
取出对应数量的1.5ml低吸附离心管，在管盖标记样本编号,将已室温平衡30分钟的磁珠b2振荡1分钟，充分混匀，往每个1.5ml低吸吸附离心管中加入85ul磁珠b2；所述磁珠b2振荡混匀之前室温平衡20-35分钟；
pcr反应结東后，取下pcr管，将所述步骤2扩增反应得到的溶液离心2秒，将pcr管中样品转移到所述步骤3中的低吸吸附离心管中，混匀后静置5分钟，瞬时离心；
将离心管放置在磁力架上，待磁珠吸附完全溶液变澄清之后吸去上清，注意不要吸到磁珠。加入75％乙醇500l，转动ep管两圈，溶液澄清后吸去上清，重复加入75％乙醇500l，转动ep管两圈，溶液澄清后吸去上清；取下离心管，离心数秒后将离心管再次置于磁力架上，待磁珠吸附完全之后吸去残留溶液，管不能有残留，打开离心管管盖，使乙醇充分挥发，晾干磁珠；
加入50ulte溶溶液，吹打混匀，静置5分钟；瞬时离心，将离心管置于磁力架上静置至溶液澄清，将上清全部转移至新管中，得到文库。
进一步的，所述步骤d包括：
步骤d1：稀释待测样品，准备标准品，并将两者都低温保存；
步骤d2：取离心管，在管盖上做好标记，按照下表中的反应体系配制反应混合液，配制时按照每个样品做2次重复反应所需的量配制体系，反应混合液包括定量扩增试剂、无核酸酸酶水、p1引物和p2引物，配制完成后，将反应混合液振荡，瞬时离心至管底；
步骤d3：将所述步骤d2中配好的反应混和液加到反应板的各反应管孔中，向标准品反应孔中分别加入2l的标准品，每个反应板同时设置无模板对照反应孔，孔中加入2ul无核酸酶水；
步骤d4：使用封膜工具和光学粘性膜密封所述反应板，使用离心机离心反应板，将反应板装载到荧光定量pcr扩增仪并进行设置后开始运行qpcr反应，得到文库浓度测定结果。
进一步的，所述步骤d4中设置程序具体包括：
步骤1：在platesetup界面，选好标准品孔和样本孔，重复系数均为2；
步骤2：在荧光定量pcr扩增仪上设置程序：先95℃1分钟；后95℃15秒，65℃15秒，72℃30秒循环30次；再后95℃15秒，65℃1分钟，95℃15秒；
步骤3：在meltingcurvestage阶段中设置“65℃1分钟，95℃15秒”，65℃到95℃的升温过程中设置收集熔解曲线，如有收集熔解曲线方式选项，则选择stepandhold方式；
步骤4：设置反应体系为20ul，单击run开始进行qpcr反应。
进一步的，所述步骤c包括：包括：
步骤一：对样本dna进行物理打断，得到片段化dna溶液；
步骤二：对所述片段化dna进行末端修复及磁珠纯化，得到纯化好的平末端dna；
步骤三：对所述平末端dna进行接头连接，得到连接接头的dna；
步骤四：对所述连接接头的dna进行pcr扩增，得到文库；
其中，所述步骤三具体为：在离心管中依次加入平末端dna、无核酸酶水、连接缓冲液、dntp、dna连接酶、p1接头和标签序列x并混匀，反应后离心纯化。
进一步的，所述步骤三具体包括：
在离心管中依次加入平末端dna、无核酸酶水、连接缓冲液、dntp、dna连接酶、p1接头和标签序列x并混匀，反应后加入磁珠吹打混匀，静置5分钟；
将离心管放置在磁力架上，待磁珠吸附完全溶液变澄清之后吸去上清；加入75％乙醇，转动离心管，溶液澄清后吸去上清；
取下离心管，离心数秒后将离心管置于磁力架上，待磁珠吸附完全之后吸去残留溶液，敞开管盖，室温晾干；
加入te溶液，吹打混匀后静置；瞬时离心后将离心管置于磁力架上静置至溶液澄清，将管内液体转移至pcr管，得到连接接头的dna。
进一步的，所述步骤二具体包括：
在步骤一所述片段化dna溶液中依次加入末端修复缓冲液和末端修复酶，涡旋混匀，离心后室温反应18-25分钟；
加入磁珠b1，振荡后静置，离心后放置磁力架上静置；
向新管中加入磁珠b2，待磁珠b1吸附完全溶液变澄清之后，将全部上清液转移至另一新管中，振荡后静置，离心后放置磁力架上静置，待磁珠吸附完全溶液变澄清之后，吸去上清；
加入75％乙醇，转动离心管，放置于磁力架上静置，待液体澄清后弃上层清液；取下离心管，离心数秒后将离心管再次置于磁力架上，待磁珠吸附完全之后吸去残留溶液，打开离心管管盖，使乙醇充分挥发，晾干磁珠；
加入te溶液，涡旋混匀静置，将离心管放置在磁力架上，待磁珠吸附完全，溶液变澄清之后将管内液体转移至第三新管中，得到纯化好的平末端dna。
进一步的，所述步骤四具体包括：
在pcr管中一次加入连接接头的dna、pcr扩增试剂和pcr引物；
将步骤1得到的反应液振荡混匀，瞬时离心，将pcr管放pcr仪上进行pcr扩增反应；
将磁珠b2振荡混匀放入低吸吸附离心管；
将所述步骤2扩增反应得到的溶液离心后转移到所述步骤3中的低吸吸附离心管中静置，瞬时离心；
将离心管放置在磁力架上，待磁珠吸附完全溶液变澄清之后吸去上清，加入75％乙醇，转转动ep管两圈，溶液澄清后吸去上清，取下离心管，离心数秒后将离心管再次置于磁力架上，待磁珠吸附完全之后吸去残留溶液，打开离心管管盖，使乙醇充分挥发，晾干磁珠；
加入te溶溶液，吹打混匀，静置后离心，再将离心管置于磁力架上静置至溶液澄清，将上清全部转移至第四新管中，得到文库。
本申请提供的胎儿染色体非整倍体检测中dna的检测及质控方法操作简单便利并且灵活，流程科学，标准明确，实践操作效果好。各环节标准严格清晰，高效严谨，进而实现对21三体综合征,18三体综合征和13三体综合征进行快速的产前辅助诊断。
各环节的操作标准实现了对整个检测过程中的质控，流程中的主要问题的辨析和处理均有体现，可操作性强。
具体实施方式
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例一：
一种胎儿染色体非整倍体检测中dna的检测及质控方法，其特征在于，包括：
步骤a：样本采集、保存及质控；
步骤b：dna提取；
步骤c：文库构建；
步骤d：文库浓度测定及保存；
步骤e：上机测序；
步骤f：结果分析；
其中，所述步骤a包括：
样本采集：采血管一采集5.0ml孕妇外周血，采集完毕后，轻柔颠倒采血管并及时将采血管放置冰箱中；采血管二采集10.0ml孕妇外周血，采集完毕后，轻柔颠倒采血管并常温保存；预冷低速离心机至温度稳定后，放入采血管二，离心分钟，吸取上清血浆，转移至置于冰盒上的2.0mlep管中，标记相应的样品编号；预冷高速离心机至温度稳定后，放入上步所得2.0mlep管并离心，枪头对着非白细胞沉淀处，在冰盒上吸取上清血浆，分装至置于冰盒上的1.5mlep管中，每管转入400ul血浆，标记样品编号和血浆管数，立即放入冰箱中保存；对该保存的样品进行质控和处理。
所述步骤b包括：对血浆游离dna提取试剂盒中的缓冲液及试剂进行处理，根据实验样本数，准备相应数量的1.5ml离心管，并写上相应的样本编号；按照dna提取记录表中的血浆编号，将所需血浆400ul从-80℃冰箱取出，室温溶解；对血浆游离dna提取试剂盒中的缓冲液及试剂进行处理包括：在buffermwi中加入56ml无水乙醇，上下颠倒混匀；在buffermwii加入200ml无水乙醇，上下颠倒混匀；在proteinasek干粉中加入3mlproteinasedissolvebuffer，颠倒混匀10-15次，充分溶解，并用2.0mlep管分装，-20.0c保存。
向血浆管即1.5ml离心管中加入20ulproteinasek和30ulmagpureparticlesg，震荡混匀5秒；加入500ulbuffermlf，涡旋混匀15秒；将血浆管转移到预热至37℃的恒温混匀仪中，转速调至1000rpm；置磁力架上3min，澄清后弃液，取下离心管；加入500ulbuffermwi，振荡混匀，瞬时离心，置磁力架3分钟，吸附完全后吸出管内液体；
加入500ulbuffermwii，振荡混匀，瞬时离心，置磁力架，吸附完全后吸出管内液体；重复加入500ulbuffermwii，振荡混匀，瞬时离心，置磁力架，吸附完全后吸出管内液体；瞬时离心，置磁力架上收集管壁上的液滴，吸去残留的液体；打开离心管管盖，37℃晾干磁珠；
加入43ul预热至37.0℃的bufferae，重悬磁珠，静至5分钟；期间轻轻晃荡两次使dna充分洗脱，操作时不要让液体弹到管壁上；
高速微离，置磁力架上3分钟，澄清后吸取39.5uldna溶液到对应编号的1.5ml新管中，得到提取的dna溶液，将所述提取的dna溶液于-20.0℃下保存。
所述步骤c包括：
步骤a：对样本dna进行物理打断，得到片段化dna溶液；
步骤b：对所述片段化dna进行末端修复及磁珠纯化，得到纯化好的平末端dna；
步骤c：对所述平末端dna进行接头连接，得到连接接头的dna；
步骤d：对所述连接接头的dna进行pcr扩增，得到文库；
其中，所述步骤c具体包括：
在离心管中依次加入平末端dna、无核酸酶水、连接缓冲液、dntp、dna连接酶、p1接头和标签序列x并混匀，反应后加入磁珠吹打混匀，静置5分钟；
将离心管放置在磁力架上，待磁珠吸附完全溶液变澄清之后吸去上清；加入75％乙醇，转动离心管，溶液澄清后吸去上清；
取下离心管，离心数秒后将离心管置于磁力架上，待磁珠吸附完全之后吸去残留溶液，敞开管盖，室温晾干；
加入te溶液，吹打混匀后静置；瞬时离心后将离心管置于磁力架上静置至溶液澄清，将管内液体转移至pcr管，得到连接接头的dna。
所述步骤b包括：在步骤a所述片段化dna溶液中依次加入末端修复缓冲液和末端修复酶，涡旋混匀，离心后室温反应18-25分钟；
加入磁珠b1，振荡后静置，离心后放置磁力架上静置；
向新管中加入磁珠b2，待磁珠b1吸附完全溶液变澄清之后，将全部上清液转移至另一新管中，振荡后静置，离心后放置磁力架上静置，待磁珠吸附完全溶液变澄清之后，吸去上清；所述磁珠b2振荡混匀之前室温平衡20-35分钟的；
加入75％乙醇，转动离心管，放置于磁力架上静置，待液体澄清后弃上层清液；取下离心管，离心数秒后将离心管再次置于磁力架上，待磁珠吸附完全之后吸去残留溶液，打开离心管管盖，使乙醇充分挥发，晾干磁珠；
加入te溶液，涡旋混匀静置，将离心管放置在磁力架上，待磁珠吸附完全，溶液变澄清之后将管内液体转移至第三新管中，得到纯化好的平末端dna。
所述步骤d包括：在pcr管中一次加入连接接头的dna、pcr扩增试剂和pcr引物；振荡混匀，瞬时离心，将pcr管放pcr仪上进行pcr扩增反应；
将磁珠b2振荡混匀放入低吸附离心管；将pcr扩增反应得到的溶液离心后转移到该低吸附离心管中静置，瞬时离心；
将离心管放置在磁力架上，待磁珠吸附完全溶液变澄清之后吸去上清，加入75％乙醇，转动ep管两圈，溶液澄清后吸去上清，取下离心管，离心数秒后将离心管再次置于磁力架上，待磁珠吸附完全之后吸去残留溶液，打开离心管管盖，使乙醇充分挥发，晾干磁珠；
加入te溶溶液，吹打混匀，静置后离心，再将离心管置于磁力架上静置至溶液澄清，将上清全部转移至第四新管中，得到文库。
所述步骤d包括：
步骤d1：稀释待测样品，准备标准品，并将两者都低温保存；
步骤d2：取离心管，在管盖上做好标记，按照下表中的反应体系配制反应混合液，配制时按照每个样品做2次重复反应所需的量配制体系，反应混合液包括定量扩增试剂、无核酸酸酶水、p1引物和p2引物，配制完成后，将反应混合液振荡，瞬时离心至管底；所述定量扩增试剂、无核酸酸酶水、p1引物和p2引物单次反应所需用量分别为10ul、7.2ul、0.4ul和0.4ul，mix体系总量为18ul；
步骤d3：将所述步骤d2中配好的反应混和液加到反应板的各反应管孔中，向标准品反应孔中分别加入2l的标准品，每个反应板同时设置无模板对照反应孔，孔中加入2ul无核酸酶水；
步骤d4：使用封膜工具和光学粘性膜密封所述反应板，使用离心机离心反应板，将反应板装载到荧光定量pcr扩增仪并进行设置后开始运行qpcr反应，得到文库浓度测定结果。
所述步骤d4中设置程序具体包括：
步骤1：在platesetup界面，选好标准品孔和样本孔，重复系数均为2，分别输入10倍梯度稀释的标准品一、标准品二、标准品三和标准品四的浓度分别为：0.135、0.0135、0.00135、0.000135；
步骤2：在荧光定量pcr扩增仪上设置程序：先95℃1分钟；后95℃15秒，65℃15秒，72℃30秒循环30次；再后95℃15秒，65℃1分钟，95℃15秒；同时设置在72℃30秒这个阶段收集荧光信号；
步骤3：在meltingcurvestage阶段中设置“65℃1分钟，95℃15秒”，65℃到95℃的升温过程中设置收集熔解曲线，如有收集熔解曲线方式选项，则选择stepandhold方式；
步骤4：设置反应体系为20ul，单击run开始进行qpcr反应。
所述步骤d1具体包括：根据样本数量，取相应数量的1.5ml离心管，标记样本编号；分别吸取599ul无核酸酶水至每个离心管中；将待测文库的样品原管涡旋振荡30秒混匀，瞬时离心后，分别移取1ul样品溶液至相对应599ul无核酸酶水的离心管中，涡旋振荡1分钟，瞬时离心至管底。将已稀释的样品置于4℃或冰上；
取出标准品s1s4，将其置于冰盒上，融化后充分振荡混匀，置于4℃或冰上。
使用bioeletronseq4000测序，测序结束后，运用《无创产前数据分析管理软件》对测序数据进行分析，得到样本21号染色体、18号染色体和13号染色体的z值，根据每个测序样本的z值进行结果判判断。
结果解释：
1、判定阴性样本：当21、18或13号染色体z值1.96时，表明检测样本的21、18或13号染色体与参考数据库中正常的染色体无显著差异，即21、18或13号染色体数目正常
2、判判定灰区样本：当当21、18或13号染色体z值落于灰区[1.96，4]范围内时，因无法排除由于胎儿dna浓度过低(<4％)而而导致假阴性的可能，故建议重新抽血取样后复检。
3、判判定阳性标本：当21、18或13号染色体z值>4时，表明检测样本的21、18或13号染色体与参考数据库中正常的染色体有明显差异，即21、18或13号染色体数目异常，预测该胎儿患有相应染色体三体综合征，需要进一步的临床诊断确认，进一步确诊方法主要是羊水穿刺。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。