阿维菌素生产菌株及提高阿维菌素产量的方法与流程

本发明涉及基因工程领域，具体涉及阿维菌素生产菌株及提高阿维菌素产量的方法

背景技术

阿维菌素(avermectins)是由阿维链霉菌(streptomycesavermitilis)发酵产生的一组结构相似的十六元环大环内酯类抗生素，具有高效、广谱、低毒的杀虫活性，其天然发酵产物包含8个组份：a1a、a1b、a2a、a2b、b1a、b1b、b2a和b2b，其中b1的杀虫活性最强，是商品化阿维菌素的组份，几乎抗所有与农业有关的线虫和节肢动物等害虫，被广泛应用于农业生产上。伊维菌素是阿维菌素b1在c-22,23位的双氢还原产物，它与阿维菌素杀虫活性相同，但毒性低2-3倍，使用更安全，更适用于人和动物体内外寄生虫的防治，被广泛应用于兽药和医药上。阿维菌素和伊维菌素的作用机制与一般杀虫剂不同，对哺乳动物的毒性很小，选择性极高。由于阿维菌素衍生物伊维菌素从根本上降低了盘尾丝虫症(河盲症)和淋巴丝虫病(象皮病)的发病率，阿维菌素的发现者omura和campbell获得了2015年诺贝尔生理学或医学奖。阿维菌素对常用农药产生耐药和抗药性的害虫具有良好的功效，而相对于化学农药，它的使用量较少而且效用时间长，同时在植物和土壤的表面可在日光下迅速分解，因此对人、畜和生态环境有较高的安全性。被业内人士称为“青春永驻”的阿维菌素，自上世纪80年代由merk公司投放市场以来，几十年宝刀不老，目前已是全球用量最大，使用技术最成熟的绿色生物农药。国内经“七五”至“九五”的连续攻关，使阿维菌素实现了产业化，截至2015年9月，中国成为阿维菌素唯一生产国。阿维菌素是仅有的一个年产值达到30亿元的生物农药，为我国带来了巨大的经济和社会效益。但如何进一步提高阿维菌素产量，降低生产成本，提升我国阿维菌素的产业化水平，是阿维菌素研究中一个永恒的主题。因此，通过基因工程手段改造阿维链霉菌以提高阿维菌素的产量，具有重要的意义和实际应用价值。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供阿维菌素的生产菌株及提高阿维菌素产量的方法。

本发明提供一种阿维菌素生产菌株，所述生产菌株中sav3804基因失活或减弱表达。

本领域技术人员应当理解，sav3804基因失活可以通过在sav3804基因中缺失、插入或替换一个或多个碱基实现，使得sav3804基因丧失功能。

优选地，所述失活为通过将sav3804基因部分或全部缺失；所述减弱表达为通过将sav3804基因的转录或表达调控元件替换为具有较低活性的元件。

所述生产菌株可以是任何能够产生阿维菌素的链霉菌属细菌，优选为阿维链霉菌。所述生产菌株的出发菌株可以是任何能够产生阿维菌素的链霉菌属细菌，优选为阿维链霉菌。本领域技术人员应当理解，能够产生阿维菌素的菌株可以是阿维链霉菌野生型菌株，或者经诱变和/或基因工程改造后能够产生阿维菌素的菌株。在本申请的具体实施方式中，采用的出发菌株为阿维链霉菌野生型菌株atcc31267，和经常规诱变获得的阿维菌素高产菌株76-02-e(李丽莉,郭佳,文莹,等.过表达核糖体循环因子提高阿维链霉菌菌株中的阿维菌素产量.工业微生物生物技术杂志,2010,37:673–679)。

所述sav3804基因具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，或如seqidno.1所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明还提供一种制备所述生产菌株的方法，包括如下步骤：构建sav3804基因的遗传修饰载体，并将所述载体引入产阿维菌素的菌株中获得sav3804基因失活或减弱表达的菌株。

具体地，所述遗传修饰载体的出发载体可以为任意一种含有链霉菌温度敏感型复制子的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体。优选为pkc1139、pgm160、phz132或pcza185等。

在本发明提供的具体实施方式中，以pkc1139为出发载体构建了sav3804基因缺失载体pd3804。

所述将载体引入产阿维菌素的菌株中，可以采用微生物基因工程领域中常用的方法，例如peg介导的原生质体转化法、电转化法、接合转移法等，优选peg介导的原生质体转化法。

为提高转化效率，可以先将遗传修饰载体转化到限制修饰作用缺陷的大肠杆菌中，从中提取质粒再转化到产阿维菌素的菌株中。

本发明通过失活或减弱表达sav3804基因，构建的阿维菌素生产菌株，其阿维菌素产量显著提高，证明sav3804基因能够用于提高阿维菌素的产量。

因此，本发明还提供了sav3804基因在提高阿维菌素产量中的应用。

具体地，所述应用为通过将sav3804基因失活或减弱表达，所述应用为在链霉菌属细菌中，优选地，为在阿维链霉菌(streptomycesavermitilis)中。

进一步地，本发明还提供一种提高阿维菌素产量的方法以及生产阿维菌素的方法，通过发酵具有失活或减弱表达的sav3804基因的生产菌株实现。

本发明的有益效果在于：通过控制sav3804基因的表达水平，构建阿维菌素生产菌株。将阿维链霉菌野生型菌株中的sav3804基因缺失，其阿维菌素发酵产量提高了4.4～4.6倍；将阿维菌素高产菌76-02-e中的sav3804基因缺失，其阿维菌素产量提高了23.5～27％，因此，本发明提供的通过失活或减弱表达sav3804基因的改造策略，可以显著提高阿维菌素的产量，降低阿维菌素的生产成本，可以在实践中用于阿维菌素的发酵生产。

附图说明

图1为sav3804基因缺失载体pd3804的质粒图谱。

图2为sav3804基因缺失载体pd3804与阿维链霉菌染色体的同源双交换示意图。

图3为阿维链霉菌野生型菌株atcc31267及其sav3804缺失突变株的阿维菌素发酵单位。

图4为阿维菌素高产菌株76-02-e及其sav3804缺失突变株的阿维菌素发酵单位。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1sav3804基因缺失载体的构建

为寻找影响阿维菌素产量的关键因子，我们对野生型菌株atcc31267和阿维菌素高产菌株的转录组进行分析，发现sav3804基因在高产菌株中的表达显著下调，暗示该基因产物负调控阿维菌素的生物合成。

一、阿维链霉菌sav3804基因上、下臂的克隆

阿维链霉菌基因组中的sav3804基因编码一个含有980个氨基酸(seqidno.2)的sarp家族转录调控因子。根据genbank公布的阿维链霉菌野生型菌株atcc31267中sav3804基因[nc_003155.4(4704929..4707871)]的序列及其上、下游的序列设计pcr引物：

primerlws60：5′-ggaattctgccgcccaggaaggtca-3′,ecori

primerlws61：5′-ccgttcagggacttgccgcgctttctccccgtgcca-3′

primerlws62：5′-tggcacggggagaaagcgcggcaagtccctgaacgg-3′

primerlws63：5′-cccaagcttgtctcgccgtcgtcctcg-3′,hindiii

引物序列下划线部分为限制性内切酶ecori和hindiii的酶切位点。以阿维链霉菌atcc31267基因组dna为模板，分别以引物对lws60/lws61和lws62/lws63进行pcr扩增。pcr反应条件：95℃，5min；(95℃，50s；60℃，50s；72℃，40s)×29个循环；72℃，10min；25℃,1min。电泳检测pcr产物，分别在471bp(lws60/lws61)和574bp(lws62/lws63)处有特异性的扩增条带，分别命名为上臂和下臂。

二、sav3804缺失载体的构建

上述上臂和下臂片段经pcr产物纯化试剂盒纯化后，通过融合pcr进行连接，连接产物经ecori/hindiii双酶切，纯化后连接于经ecori/hindiii双酶切的载体pkc1139(biermanm,loganr,o’brienk,等.用于从大肠杆菌到链霉菌dna接合转移的质粒克隆载体.基因,1992,116:43–49)上，得到sav3804缺失载体pd3804。测序表明所扩增的片段确实为sav3804基因的上下游序列，且与所公布的序列一致。pd3804的质粒图谱如图1所示。

实施例2重组质粒的转化

通过实施例1构建了sav3804基因的缺失质粒载体pd3804，作为对照的原始质粒为pkc1139。

由于阿维链霉菌中存在很强的限制修饰作用，用提取自大肠杆菌jm109或dh5α的质粒直接转化阿维链霉菌，转化效率极低，有时甚至得不到转化子。而用来自没有限制修饰作用的受体菌大肠杆菌et12567的质粒，其转化效率明显提高。因此，将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌et12567(kiesert,bibbmj,buttnermj,等.实用链霉菌遗传手册,2000,norwich:约翰英纳斯基金会)中以获得非甲基化的dna，然后再用非甲基化的质粒dna转化阿维链霉菌的原生质体。

本实施例选用阿维链霉菌菌株atcc31267和76-02-e(李丽莉,郭佳,文莹,等.过表达核糖体循环因子提高阿维链霉菌菌株中的阿维菌素产量.工业微生物生物技术杂志,2010,37:673–679)作为出发菌株。atcc31267是阿维链霉菌野生型菌株，产灰色孢子；76-02-e是阿维菌素高产菌株，也产灰色孢子，但颜色比野生型浅。制备阿维链霉菌菌株的原生质体，用从大肠杆菌et12567中提取的质粒转化原生质体，涂于已吹干的不加抗生素的rm14平板上，28℃培养16-20小时后，在平板上涂1ml含1000μg安普霉素的水溶液，在28℃继续培养7-10天，长出的菌落即为转化子。由于阿维链霉菌的转化子在rm14再生培养基上不产孢，故各挑取三个转化子，接种于含10μg/ml安普霉素的yms平板上，28℃培养7-10天恢复产孢。转化子经质粒提取及pcr验证正确。

本实施例中大肠杆菌的转化、阿维链霉菌原生质体的制备及转化方法、rm14及yms培养基的配制参见郭佳的博士论文(郭佳.阿维菌素生物合成相关基因的功能研究，博士学位论文，2011，北京：中国农业大学)。

实施例3sav3804基因缺失突变株的获得

分别收集以上经验证正确的含有pd3804质粒和对照质粒pkc1139转化子的孢子，以每培养皿约100个孢子涂布于含有安普霉素的yms平板上，置于28℃培养48-72小时，当菌落直径约2mm左右，即将形成气生菌丝时，将平板转移至39℃高温培养7天后，含有pd3804的一些菌落上出现扇形生长，而含有pkc1139的菌落移至39℃后不再生长。这是由于pkc1139为温敏型的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，当温度高于34℃时不能自我复制，因此在含有安普霉素的yms培养基上无法生长；只有当重组质粒pd3804所携带的sav3804基因上、下游序列与阿维链霉菌染色体上同源区段发生同源重组，并通过单交换整合到染色体上的菌株才能表达安普霉素的抗性基因，从而在含有安普霉素的yms培养基上生长。将39℃长出的抗安普霉素的单交换突变株在不添加抗生素的yms平板上传代，共转接2-4次后，筛选安普霉素敏感的双交换突变株。利用pcr对安普霉素敏感的突变株加以验证。分别获得多株atcc31267和76-02-e的sav3804缺失突变株。sav3804缺失载体pd3804与阿维链霉菌染色体的同源双交换示意图如图2所示。

实施例4阿维链霉菌发酵生产阿维菌素

一、阿维链霉菌的摇瓶发酵

种子培养基：可溶性淀粉30g，麦芽膏2g，大豆蛋白胨2g，cocl2·6h2o5mg，加蒸馏水至1l，调ph至7.0-7.2。

发酵培养基i：可溶性淀粉50g，酵母粉12g，mgso4·7h2o0.5g，k2hpo4·3h2o0.5g，kcl4g，caco32g，cocl2·6h2o5mg，加蒸馏水至1l，调ph至7.0-7.2。

二、发酵产物的hplc分析

1.样品处理：取1.0ml发酵液，加入4.0ml甲醇，浸泡30分钟以上，每隔10分钟振荡一次，4000rpm离心10分钟，取上清液进样分析；

2.hplc分析条件：c18反相柱，柱长150mm，柱内径4.6mm，柱温40℃，流动相为甲醇：水(85:15)，流速1.0ml/min，进样体积20μl，波长为246nm。

三、atcc31267及其不同sav3804缺失突变株的发酵结果

阿维链霉菌野生型菌株atcc31267及其sav3804缺失突变株在yms培养基上长出丰富的孢子后接种于种子培养基(装量为100ml/500ml三角瓶)中，28℃摇床培养24小时(转速230rpm，偏心距1.8cm)。按5％接种量接种于发酵培养基(装量为50ml/250ml三角瓶)中，28℃培养10天(转速250rpm，偏心距2.5cm)，放瓶，用甲醇提取后，hplc法测定阿维菌素的发酵单位，结果如图3所示。

与出发菌株atcc31267相比，sav3804缺失突变株的阿维菌素发酵单位均明显增加。出发菌株的阿维菌素b1组份产量为80μg/ml，缺失突变株的阿维菌素b1组份产量为432～450μg/ml，缺失突变株的阿维菌素b1组份产量比出发菌株提高了4.4～4.6倍，表明sav3804基因缺失显著促进了阿维菌素合成(图3)。

四、76-02-e及其不同sav3804缺失突变株的发酵结果

发酵培养的具体操作如实施例4的三所述，发酵结果显示，与出发菌株76-02-e相比，sav3804缺失突变株的阿维菌素发酵单位均明显增加。出发菌株的阿维菌素b1组份产量为3600μg/ml，缺失突变株的阿维菌素b1组份产量为4446～4572μg/ml，缺失突变株的阿维菌素b1组份产量比出发菌株提高了23.5～27％，表明sav3804基因缺失可提高高产菌株阿维菌素产量。因此，该方法可应用于工业生产菌株的遗传改造，以进一步提高阿维菌素产量(图4)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>阿维菌素生产菌株及提高阿维菌素产量的方法

<130>khp181112667.3

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2943

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggacggtgtgccgcgagtaccggagcagtggcgtcccgaggaatcggcggcgctgcgc60

ttcggcgtgctcggcccggtccgcgcctggcacggggagaaagcgctgtccaccggttcc120

ccgcagcaacgcgccctgctggccgcgctgttgctgcgcgagggccgcaccgcgacggcc180

ggtgagctcatcgacgccctgtggggcgacgagccgccgtcgcaggccctggccgccgta240

cggacctacgcctcccggctgcgcaaggtactgccggccggagtcatggtcagcgagtcg300

ggcgggtacgcgatccgcggcctgcccgaggaggcgctggacgtgtccctggcccaggcg360

ctcgccgccgacgcggagaaggcgaaggccgcgggcgacctgtgccgggcccgcgccctg420

ctcaacgaggcgctggccctgtgggacggggagccgctggcgagcctgccgggaccgtac480

gccgagacccagcgggcccgcctcgacgaatggcggctccagctcctggagtcccggctc540

gacatggacctggaacagggctgccacgcggaggccgtctcggagctgaccgccctgacg600

gccgcgcaccccctgcgggagcggctgcgcgagctgctgatgctcgcgctgtaccgcagc660

ggccggcaggcggaggccctcgcggtctacgcggacacccggcacctgctggccgaggaa720

ctcggcgtcgacccccgctccggcctgaaggaactccagcagcgcatcctccaggcggac780

ccgggcctggcggagccctccggcccggccgccgaacccccgccggcgcccgtacgcccc840

gcccagctccccgccacggtgcccgacttcaccggccgggacgccttcgtcgccgaactg900

agcgacgtgctcgcgtccgccgagggccgggtgatggcggtctcggcactggccgggatc960

ggcggcgtcggcaagacgaccctcgccgtgcacgtggcccaccaggcgcgggccgccttc1020

cccgacggccagctgtacgtggacctccagggcgccggacagcgggcggcggagccggag1080

accgtcctgggcgcgttcctgcgggccctcggcaccgcggactcggcgatccccgactcc1140

ctggaggaacgctccgccctgtaccgctcggtcctcgacggccgccgcgtgctggtcctg1200

ctggacaacgcccgcgacgccgcccaggtgcgtccgctgctgcccggcatggagggctgc1260

gcggccctggtcacctcccgggtacggatggtgggcctggccggggcgcacctcgtggac1320

ctcgacgtgatgtcgccggaggaggccctccagctcttcacgaagatcgtgggcgaggag1380

cgggtggcatcggagcgcgaggcggcccttgacgtggtggcggcgtgcggtttccttccc1440

ctggcgatccgcatcgccgcgtcccggctggcggcccggcgcacctggaccgtctccgta1500

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gccgtgaaggccaccttcgagctgggctacggccagctggacccgccccaggcccgcgcc1620

ttccgcctgctgggcctcgcggacggcccggacatgtccctggccgcggccgcggcggtc1680

ctcgacctcccggccgaggagaccgaggacctgctggagtccctcgtcgacacgtccctg1740

ctggagtcggcggctcccggccggtaccggtaccacgacctggtccgcctctacgcccgc1800

gcgtgcgcggagcgcgacgagcacccgccgagcgagcgggacgcggccatggcgcggttg1860

ctggacttctatctggccacggccgcggaggtcttcgccatcgagcggcccggggaccgg1920

ctggtggatcacctggagcagacccggaccccgggactggtcttcccggaccgccgcgcc1980

gcccaggactggctctactccgaggccgtgccgctcctggcctgcgtacggcagtcgtcg2040

ggcggtgcgacgctcaggcgtgccgtcgacctgttgtgggccgctgtcgacctggcggaa2100

tcgggggcgaacgccaaggagtacgaggcggccgcgacggcgctgcgggacgcggcgcgg2160

gtcgcttcggaccgccgggcggaggggcgggccatcctcgtcctggccaacgcacgccac2220

tggtccggcctgttcgaccaggccgatcaggaggcacggcaggcgctcgcgctctccgag2280

gcggccgcggatccgttgccctgctgctgggcggcgaacatcctgggcgccttcgcgttc2340

taccagagccgctacgcggaggccgaggagtacctggagcgggccatccgggagttccgc2400

gcctgcggggaccgctccggcgcggcggccgccctgtgcaatctctcccggctgcacctg2460

gagacggatcgcgcccacagcgccgtcgatctcgcccagcagggcaccgagatgtacgag2520

gagctcgggcattccctcaaggtcgccaacggccgctacgcgctggggatggccctcagc2580

aagagcggccggccggccgacgccacccatcgtctccgggaggcgctccaggtcttccgc2640

gcgagccgtcagcggttgtgggaggggatgaccctcttccggctggccgaggtcgatctc2700

ctggcccagcgcccggcgcaggcggcggccaactccgagatggcgctggcgttgctgcgg2760

gggatcggcggcgagtggcgtcgcggcaacgtgctcacggtgctcggcaagtccctgaac2820

gggatcggccagcccggcagggctcaggtctgctggcgcgaggccctcgaaatctacgtg2880

aaactgaactctcccgaggccgccgaggtgcaggcactgctggctccggccgccgctgcc2940

tga2943

<210>2

<211>980

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metaspglyvalproargvalprogluglntrpargproglugluser

151015

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202530

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65707580

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115120125

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165170175

gluserargleuaspmetaspleugluglnglycyshisalagluala

180185190

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195200205

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210215220

glualaleualavaltyralaaspthrarghisleuleualagluglu

225230235240

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245250255

leuglnalaaspproglyleualagluproserglyproalaalaglu

260265270

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275280285

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290295300

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305310315320

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325330335

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340345350

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355360365

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370375380

seralaleutyrargservalleuaspglyargargvalleuvalleu

385390395400

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405410415

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465470475480

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485490495

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515520525

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565570575

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580585590

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595600605

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690695700

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725730735

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820825830

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