本发明属于土壤修复技术领域，具体涉及用于修复三氮污染土壤的微生物制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
土壤是大气、水体以及固体废弃物中污染物在环境中迁移、直流和沉积的目标，是长期环境污染的承受着，随着社会经济和工业化发展加快，某些工业废水如焦化废水和合成氨化肥废水等造成了三氮污染，三氮污染即氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮污染，氨氮污染主要来源于生活污水中含氮有机物受微生物作用的分解产物，亚硝酸盐氮为一种致癌性物质，对人体健康危害很大，硝酸盐一方面可造成水体的藻化现象，另一方面在肠胃中可被还原为亚硝酸盐形成致癌物亚硝胺，危害生命健康，目前我国地下水硝酸盐污染严重，农田土壤硝酸盐淋失是造成地下水污染的主要原因。
对于土壤污染的修复技术与方法，国外自70年代末80年代初已经开始研究，初期一般采用物理和化学方法进行污染土壤的修复，如热处理法和化学浸出法，但费用昂贵，不适于大面积应用。80年代末和90年代初期，国外开始研究基于物理、化学过程的微生物、植物分解代谢土壤污染的生物修复方法，近几年发展非常迅速，不仅较物理、化学方法经济，同时也不易产生二次污染，更适于大面积土壤的修复，而生物修复技术已经开始作为了土壤修复的主要处理技术，而且扮演了越来越重要的角色，但是目前的修复技术能存在氨氮去除率低，微生物不稳定、酶法处理容易失活等问题，因此，亟待全面解决并修复氨氮污染土壤的问题。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是提供一种用于修复三氮污染土壤的微生物制剂，该微生物制剂主要用于修复氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的污染。
本发明的另一目的在于提供上述用于修复三氮污染土壤的微生物制剂的制备方法和应用。
技术方案：本发明提供了一种用于修复三氮污染土壤的微生物制剂，该微生物制剂包括施氏假单胞菌sc221-m菌剂、异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂和固定化葡萄糖氧化酶。
其中，所述施氏假单胞菌sc221-m菌剂、异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂的重量比为0.1～2:1～5。
其中，所述固定化葡萄糖氧化酶占微生物制剂重量的1/10～1/5。
其中，所述微生物制剂中，所述施氏假单胞菌sc221-m菌剂的活菌含量为5×108～8×1010cfu/g，所述异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂的活菌含量为3×109～5×1010cfu/g。
其中，所述微生物制剂中，所述固定化葡萄糖氧化酶浓度为20～30u/mg。
本发明内容还包括一种制备所述的用于修复三氮污染土壤的微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：
1)将施氏假单胞菌sc221-m菌剂和异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂按照0.1～2:1～5的质量比混合均匀得到复合菌剂；
2)向步骤1)制得的复合菌剂中加入所述固定化葡萄糖氧化酶，混合均匀，即得所述的用于修复三氮污染土壤的微生物制剂。
其中，所述施氏假单胞菌sc221-m菌剂的制备方法包括：将施氏假单胞菌sc221-m培养到对数期，然后按培养基体积3％～10％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，30～35℃，摇床震荡180～220rpm，培养40～48小时，得到施氏假单胞菌sc221-m的发酵液，向该发酵液中加入吸附剂，干燥，即得施氏假单胞菌sc221-m菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭一种或几种。
其中，所述培养基为小麦秸秆粉和红薯藤粉为碳源、硫酸铵和蛋白胨为氮源的培养基。
其中，所述异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂的制备方法包括：将异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551在r2a液体培养基中培养到对数期，然后按培养基体积3％～6％的接种量将培养到对数期的菌种接种到r2a液体培养基中，30～40℃下，摇床震荡120～180rpm，培养24～48小时，加入吸附剂，干燥，制得异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭中的一种或几种。
本发明内容还包括用于修复三氮污染土壤的微生物制剂在三氮污染土壤修复中的应用。
有益效果：本发明首次将施氏假单胞菌sc221-m菌剂和异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂与固定化葡萄糖氧化酶混合制备得到了微生物制剂，该微生物制剂借助了异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂硝化与反硝化作用，能够在同体系内将nh4+-n转化为无害的气体，同时葡萄糖氧化酶的能够有效氧化污染土壤中的糖类物质，有效降解有害微生物，发明人通过与上述两种微生物制剂联合使用发现，在脱氮方面效果优于分别单独和联合使用两种菌剂的效果，氨氮去除率达到了95％以上、亚硝酸盐氮除率达到了95％以上、硝酸盐氮除率达到了96％以上。
具体实施方式
本发明中施氏假单胞菌sc221-m菌为中国科学院微生物研究所馈赠，异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551购买于美国atcc细胞库。本发明中所有的试剂均为市面上购买获得。
实施例1
葡萄糖氧化酶的固定化：将介孔分子筛材料sba-15加入到葡萄糖氧化酶中，在温度为10℃；ph为4.5；转速为180rpm；固定化时间为10h下进行固定化后获得。
施氏假单胞菌sc221-m菌剂的制备方法包括：将施氏假单胞菌sc221-m培养到对数期，该培养基为以小麦秸秆粉和红薯藤粉为碳源、硫酸铵和蛋白胨为氮源的培养基，然后按培养基体积3％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，30℃，摇床震荡220rpm，培养48小时，得到施氏假单胞菌sc221-m的发酵液，向该发酵液中加入活性炭，干燥，即得施氏假单胞菌sc221-m菌剂。该施氏假单胞菌sc221-m菌剂的活菌含量为5×108cfu/g。
异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂的制备方法包括：将异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551在r2a液体培养基(购买于青岛海博生物)中培养到对数期，然后按培养基体积3％的接种量将培养到对数期的菌种接种到r2a液体培养基中，30℃，摇床震荡180rpm，培养48小时，加入膨润土，干燥，制得异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂。该异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂的活菌含量为3×109cfu/g。
用于修复三氮污染土壤的微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：
1)将施氏假单胞菌sc221-m菌剂和异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂按照0.1:1的质量比混合均匀得到复合菌剂；
2)向步骤1)制得的复合菌剂中加入所述固定化葡萄糖氧化酶，该固定化葡萄糖氧化酶占微生物制剂重量的1/10，该固定化葡萄糖氧化酶浓度为30u/mg，混合均匀，即得所述的用于修复三氮污染土壤的微生物制剂。
实施例2
葡萄糖氧化酶的固定化：将介孔分子筛材料sba-15加入到葡萄糖氧化酶中，在温度为8℃；ph为3.5；转速为180rpm；固定化时间为10h下进行固定化后获得。
施氏假单胞菌sc221-m菌剂的制备方法包括：将施氏假单胞菌sc221-m培养到对数期，该培养基为以小麦秸秆粉和红薯藤粉为碳源、硫酸铵和蛋白胨为氮源的培养基，然后按培养基体积10％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，35℃，摇床震荡180rpm，培养24小时，得到施氏假单胞菌sc221-m的发酵液，向该发酵液中加入膨润土，干燥，即得施氏假单胞菌sc221-m菌剂。该施氏假单胞菌sc221-m菌剂的活菌含量为8×1010cfu/g。
异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂的制备方法包括：将异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551在r2a液体培养基(购买于青岛海博生物)中培养到对数期，然后按培养基体积6％的接种量将培养到对数期的菌种接种到r2a液体培养基中，40℃，摇床震荡180rpm，培养24小时，加入活性炭，干燥，制得异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂。该异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂的活菌含量为5×1010cfu/g。
用于修复三氮污染土壤的微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：
1)将施氏假单胞菌sc221-m菌剂和异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂按照2:5的质量比混合均匀得到复合菌剂；
2)向步骤1)制得的复合菌剂中加入所述固定化葡萄糖氧化酶，该固定化葡萄糖氧化酶占微生物制剂重量的1/5，该固定化葡萄糖氧化酶浓度为20u/mg，混合均匀，即得所述的用于修复三氮污染土壤的微生物制剂。
实施例3
葡萄糖氧化酶的固定化：将介孔分子筛材料sba-15加入到葡萄糖氧化酶中，在温度为12℃；ph为5.5；转速为120rpm；固定化时间为12h下进行固定化后获得。
施氏假单胞菌sc221-m菌剂的制备方法包括：将施氏假单胞菌sc221-m培养到对数期，该培养基为以小麦秸秆粉和红薯藤粉为碳源、硫酸铵和蛋白胨为氮源的培养基，然后按培养基体积6％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，32℃，摇床震荡200rpm，培养44小时，得到施氏假单胞菌sc221-m的发酵液，向该发酵液中加入活性炭，干燥，即得施氏假单胞菌sc221-m菌剂。该施氏假单胞菌sc221-m菌剂的活菌含量为4×1010cfu/g。
异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂的制备方法包括：将异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551在r2a液体培养基(购买于青岛海博生物)中培养到对数期，然后按培养基体积4％的接种量将培养到对数期的菌种接种到r2a液体培养基中，35℃，摇床震荡150rpm，培养36小时，加入活性炭，干燥，制得异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂。该异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂的活菌含量为2.5×1010cfu/g。
用于修复三氮污染土壤的微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：
1)将施氏假单胞菌sc221-m菌剂和异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂按照0.1:5的质量比混合均匀得到复合菌剂；
2)向步骤1)制得的复合菌剂中加入所述固定化葡萄糖氧化酶，该固定化葡萄糖氧化酶占微生物制剂重量的3/20，该固定化葡萄糖氧化酶浓度为25u/mg，混合均匀，即得所述的用于修复三氮污染土壤的微生物制剂。
对比例1未经过固定化的酶制剂与菌剂制备得到的复合微生物菌剂
施氏假单胞菌sc221-m菌剂的制备方法包括：将施氏假单胞菌sc221-m培养到对数期，该培养基为以小麦秸秆粉和红薯藤粉为碳源、硫酸铵和蛋白胨为氮源的培养基，然后按培养基体积3％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，30℃，摇床震荡220rpm，培养48小时，得到施氏假单胞菌sc221-m的发酵液，向该发酵液中加入活性炭，干燥，即得施氏假单胞菌sc221-m菌剂。该施氏假单胞菌sc221-m菌剂的活菌含量为5×108cfu/g。
异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂的制备方法包括：将异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551在r2a液体培养基(购买于青岛海博生物)中培养到对数期，然后按培养基体积3％的接种量将培养到对数期的菌种接种到r2a液体培养基中，30℃，摇床震荡180rpm，培养48小时，加入膨润土，干燥，制得异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂。该异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂的活菌含量为3×109cfu/g。
用于修复三氮污染土壤的微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：
1)将施氏假单胞菌sc221-m菌剂和异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂按照0.1:1的质量比混合均匀得到复合菌剂；
2)向步骤1)制得的复合菌剂中加入葡萄糖氧化酶，该葡萄糖氧化酶占微生物制剂重量的1/10，该葡萄糖氧化酶浓度为30u/mg，混合均匀，即得所述的用于修复三氮污染土壤的微生物制剂。
对比例2仅采用施氏假单胞菌sc221-m菌剂和固定化氧化酶
葡萄糖氧化酶的固定化：将介孔分子筛材料sba-15加入到葡萄糖氧化酶中，在温度为8℃；ph为3.5；转速为180rpm；固定化时间为10h下进行固定化后获得。
施氏假单胞菌sc221-m菌剂的制备方法包括：将施氏假单胞菌sc221-m培养到对数期，该培养基为以小麦秸秆粉和红薯藤粉为碳源、硫酸铵和蛋白胨为氮源的培养基，然后按培养基体积10％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，35℃，摇床震荡180rpm，培养24小时，得到施氏假单胞菌sc221-m的发酵液，向该发酵液中加入活性炭，干燥，即得施氏假单胞菌sc221-m菌剂。该施氏假单胞菌sc221-m菌剂的活菌含量为8×1010cfu/g。
用于修复三氮污染土壤的微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：
将上述的施氏假单胞菌sc221-m菌剂中加入所述固定化葡萄糖氧化酶，该固定化葡萄糖氧化酶占施氏假单胞菌sc221-m菌剂重量的1/5，该固定化葡萄糖氧化酶浓度为20u/mg，混合均匀，即得所述的用于修复三氮污染土壤的微生物制剂。
对比例3仅采用异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂和固定化氧化酶
葡萄糖氧化酶的固定化：将介孔分子筛材料sba-15加入到葡萄糖氧化酶中，在温度为12℃；ph为5.5；转速为120rpm；固定化时间为12h下进行固定化后获得。
异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂的制备方法包括：将异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551在r2a液体培养基(购买于青岛海博生物)中培养到对数期，然后按培养基体积4％的接种量将培养到对数期的菌种接种到r2a液体培养基中，35℃，摇床震荡150rpm，培养36小时，加入活性炭，干燥，制得异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂。该异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂的活菌含量为2.5×1010cfu/g。
用于修复三氮污染土壤的微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：
将异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂中加入所述固定化葡萄糖氧化酶，该固定化葡萄糖氧化酶占异氧硝化-好氧反硝化细菌paracoccuspantotrophusatcc3551菌剂重量的3/20，该固定化葡萄糖氧化酶浓度为25u/mg，混合均匀，即得所述的用于修复三氮污染土壤的微生物制剂。
实施例4
参照国家环境部发布hj636-2012《土壤氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的测定氯化钾溶液提取-分光光度法》标准，适用于土壤中氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的测定。
样品前处理：用氯化钾溶液提取土壤中的三氮，提取液经离心分离，取上清液分析。
1、氨氮的测定：氨离子与苯酚反应→蓝色靛酚染料→630nm分光光度计测定；
2、亚硝酸盐氮的测定：硝酸盐氮与磺胺反应→重氮盐→再与盐酸n-(1-萘基)-乙二胺偶联反应→红色染料→543nm分光光度计测定；
3、硝酸盐氮的测定：硝酸盐氮还原→亚硝酸盐氮→比色反应同上→543nm分光光度计测定(亚硝酸盐氮+硝酸盐的总含量)→亚硝酸盐氮含量＝总含量-硝酸盐氮含量
用于修复三氮污染土壤的微生物制剂对土壤中氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的降解能力测试：
1)选取被氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮等污染的土壤，平均分成18份，分别置于消毒后的容器中，将18份灭菌后的土壤分成6组，每组3份。
2)取实施例1～3和对比例1～3制得的用于修复三氮污染土壤的微生物制剂，每个实施例/对比例制得的用于修复三氮污染土壤的微生物制剂对应加入到其中一组土壤中，混合均匀，其中土壤中加入的用于修复三氮污染土壤的微生物制剂的质量占土壤质量的0.5％。
3)两个月后检测经处理后的土壤中氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的含量，每组3份取平均值，结果如表1所示。
表1