本发明属于生物检测领域，涉及基于外周血游离核苷酸mirnas超灵敏检测装置的试剂盒，还涉及利用该试剂盒的检测方法。
背景技术：
微小rna(mirna)是一类内源性长约21-25bp的单链短小分子rna，通过调控基因调节细胞生长、凋亡和信号传导。mirna多态性与药物代谢和耐药密切相关，异常表达mirna对预测肿瘤的发生、发展及药物敏感性有重要作用；目前外周血中存在着稳定的mirna，可作为灵敏度高和特异性强的生物标志物。
目前，外周血mirna主要的检测方法有克隆测序、real-timepcr、rna印迹杂交、芯片等；微量外周血mirna通常需要通过扩增进行检测，但由于mirna序列较短，普通pcr难以进行，虽然目前已有基于茎-环(stem-loop)及基于polya加尾的real-timepcr等，但这些特殊扩增技术难度高不易普及应用。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于外周血游离核苷酸mirnas超灵敏检测装置的试剂盒；还涉及利用该试剂盒的检测方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种基于外周血游离核苷酸mirnas超灵敏检测装置的试剂盒，包括1)微阵列检测池、2)与检测池底部结构匹配的外接磁力板、3)预混合反应液a和4)预混合反应液b。
优选的，所述微阵列为n*n排列，其中n大于或等于2。
更优选的，所述检测池底部为“v”形。
优选的，所述外接磁力板与微阵列检测池离合式连接。
更优选的，所述预混合液a为与纳米磁珠经过基团偶联的多环链接荧光发夹探针；所述预混合反应液b为tne缓冲液，由tris、edta、nacl组成，缓冲液ph为8.0。
优选的，所述预混合反应液a含有一种检测靶标物的探针，检测多个待测靶标物时，平行配置分别对应检测一种待测靶标物预混合反应液，分别记为预混合反应液a1、预混合反应液a2。
所述荧光发夹探针为与mirna-150特异性结合的双环连接的探针，探针序列如下：
d1：fam-cgcgattctcccaacccttgtaccagtgatcgcgtgagcacatgaaatacactggagaatcg-bhq1(seqidno.1)
d2：fam-atgcgctctcccaacccttgtaccagtggcgcatcgattctccagtgtacaatcccacagtg-nh2(seqidno.2)
d3：cactgtgggattgtatttcatgtgctca-bhq1(seqidno.3)。
2.利用所述的试剂盒检测外周血游离核苷酸mirnas的方法，包括如下步骤
(1)将预混合液滴入检测装置的检测池中；
(2)将待测生物样品点入检测池内，与预混合反应液a和预混合反应液b混合均匀，每个样品设置3个重复；
(3)将点样微阵列检测池置于杂交盒内，进行杂交，整个过程保持严格避光状态；
(4)将步骤(3)处理后的微阵列检测池置于外接磁力板上，达到纳磁荧光聚集效果；
(5)荧光识读比对。
优选的，所述其中待测生物样品包括患者外周血液mirnas提取样本、健康血液mirnas提取样本、人工合成mirna靶序列和人工合成单链nc序列中的至少一种。更优选的，所述杂交为95℃水浴10min、0℃冰浴30min后取出，18～25℃放置30min。
本发明的有益效果在于：
mirnas稳定存在于外周血中，可作为灵敏度高、特异性强的生物标志物，但其通常需要通过扩增进行检测，且存在扩增技术难度高不易普及应用；本发明可直接检测外周血中mirnas的表达量，无需扩增。
本发明所述试剂盒，通过独特设计的“v”形底部微阵列基片、和外接磁力板对纳磁微球的吸附达到了双重荧光富集效果，极大提高了mirnas的检测灵敏度。
本发明所述试剂盒，通过设计多组预混合反应液(每组预混合反应液为一种含有特异性环序列的多环链接发夹探针)，实现了在一块微阵列基片上同时反应多个生物标志物表达量的目的，对肿瘤疾病诊断、疗效及预后等有直接、快速的指挥作用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1双环链接发夹探针靶序列检测原理图(a：探针结构及原理图；b：探针不同区段检测溶解曲线；c：page电泳图)。
图2基于双环链接发夹探针作识别分子的纳米磁珠信号放大微阵列芯片检测原理图。
图3为荧光富集装置及效果原理图(a：装置结构图；b：效果原理图)。
图4为非小细胞肺癌患者外周血中mirna-150荧光图。
图5为mirnas灵敏度验证荧光图。
图6为mirnas灵敏度验证荧光曲线图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1、一种外周血游离核苷酸mirnas超灵敏检测装置
一种外周血游离核苷酸mirnas超灵敏检测装置，结构如图3中a所示，包括微阵列检测池1和与检测池底部结构匹配的离合式外接磁力板2；其中，微阵列为n*n排列，如6×6，n大于或等于2；检测池由顶部至底部直径逐渐减小，优选的检测池底部为“v”形，“v”形微阵列检测池更利于荧光富集，提高探针检测灵敏度。
检测时，将预混合反应液与待测生物样品在微阵列基片上反应完成后，通过外接磁力板对纳磁微球的吸附作用，达到对反应体系的荧光富集效果，从而提高检测效率(图3，b)。当检测检测多个待测靶标物时，平行配置分别对应检测一种待测靶标物预混合反应液，分别记为预混合反应液a1、预混合反应液a2。不同颜色表示针对不同mirna的不同纳米磁多环链接荧光发夹探针，每个检测检测池只放一种特异性探针，多孔间互不干扰，利于结果判断。
实施例2、检测外周血游离核苷酸mirnas的方法
利用实施例1中的检测装置检测非小细胞肺癌患者(nsclc)外周血游离核苷酸mirna-150的方法，包括如下步骤：
(1)将预混合液a和预混合液b滴入检测装置的检测池中，预混合液a即为与mirna-150特异性结合的双环链接荧光发夹探针，探针序列如下：
d1：fam-cgcgattctcccaacccttgtaccagtgatcgcgtgagcacatgaaatacactggagaatcg-bhq1(seqidno.1)；
d2：fam-atgcgctctcccaacccttgtaccagtggcgcatcgattctccagtgtacaatcccacagtg-nh2(seqidno.2)；
d3：cactgtgggattgtatttcatgtgctca-bhq1(seqidno.3)；
所述混合反应液b为tne缓冲液，由tris、edta、nacl组成，缓冲液ph为8.0。
上述探针序列经过互补配对形成双环链接荧光发夹探针，结果和检测原理如图1中a和图2所示，本实施例中双环识别的待测靶序列相同，也可以设计识别不同靶序列的双环链接荧光发夹探针，可以在同一检测池检测2种靶序列，还可以将双环设计为识别相同待测靶序列或识别不同靶序列的多环，识别不同靶序列的多环可以在同一检测池检测多个靶序列。此外，为验证本实施例设计的双环链接荧光发夹探针，分别将d1、d1+d2、d1+d2+d3杂交检测荧光强度，然后在98℃→0℃观察溶解曲线，结果如图1中b所示。结果表明，加入含淬灭基团的探针序列d3后，双环链接发夹探针结构形成，荧光信号显著减弱，荧光共振能量转移效果得以实现；如图1中c(page电泳图)所示，同时加入探针序列d1、d2、d3的电泳通道内，出现了一条碱基数显著增大的条带，该条带显示一个碱基数大于d1、d2、d3的新的核酸分子形成，即双环链接发夹探针结构形成，同时加入探针序列d1、d2、d3及mirna-150的电泳通道内，出现条带显示碱基数较前一通道增加，表明双环探针与靶序列mirna-150杂交。
(2)将待测生物样品点入检测池内，与预混液反应液a和混液反应液b混合均匀，每个样品设置3个重复；其中待测生物样本包括：mirna-n1(非小细胞肺癌初诊未化疗患者外周血液mirnas提取样本)、mirna-n2(非小细胞肺癌化疗患者外周血液mirnas提取样本)、mirna-h(健康血液mirnas提取样本)；
(3)将点样微阵列检测池置于杂交盒内，进行95℃水浴10min、0℃冰浴30min后取出，室温(18～25℃)放置30min，整个过程保持严格避光状态；
(4)将步骤(3)处理后的微阵列检测池置于外接磁力板上，达到纳磁荧光聚集效果；
(5)荧光识读比对，即可得到肿瘤患者外周血中mirnas异常表达比对结果，结果如图4和表1所示。
表1非小细胞肺癌患者外周血中mirna-150检测结果
实施例3、检测外周血游离核苷酸mirnas的灵敏度验证
以梯度稀释后的mirna-150为模板，验证本发明所述基于外周血游离核苷酸mirnas超灵敏检测装置的试剂盒及其检测方法的灵敏度，具体步骤如下：
(1)将oligomirna-150(由takara公司合成)进行梯度稀释至1μm、1nm、10pm及1pm，作为灵敏度验证实验样本；
(2)利用实施例1中的装置进行检测，将预混合液a和预混合液b滴入检测装置的检测池中，预混合液a即为与mirna-150特异性结合的双环链接荧光发夹探针，探针序列如下：
d1：fam-cgcgattctcccaacccttgtaccagtgatcgcgtgagcacatgaaatacactggagaatcg-bhq1(seqidno.1)；
d2：fam-atgcgctctcccaacccttgtaccagtggcgcatcgattctccagtgtacaatcccacagtg-nh2(seqidno.2)；
d3：cactgtgggattgtatttcatgtgctca-bhq1(seqidno.3)；
所述混合反应液b为tne缓冲液，由tris、edta、nacl组成，缓冲液ph为8.0。
(3)将(1)中梯度稀释样本点入检测池内，与预混液反应液a混合均匀，每个样品设置3个重复；同时以探针组及空白组(tne缓冲液)作对照；
(4)将点样微阵列检测池置于杂交盒内，进行95℃水浴10min、0℃冰浴30min后取出，室温(18～25℃)放置30min；整个过程保持严格避光状态；
(5)将步骤(4)处理后的微阵列检测池置于外接磁力板上，达到纳磁荧光聚集效果；
(6)荧光识读比对，得到灵敏度验证结果，结果如图5、图6和表2所示。
表2、mirnas灵敏度验证结果
结果表明：本发明所述基于外周血游离核苷酸mirnas超灵敏检测装置的试剂盒及其检测方法，通过独特设计的“v”形底部微阵列基片、和外接磁力板对纳磁微球的吸附达到了双重荧光富集效果，极大提高了对mirnas的检测灵敏度，最低检测限可到10pm级别。
本发明所述基于外周血游离核苷酸mirnas超灵敏检测装置的试剂盒及其检测方法，其独特设计的预混合反应液为一种含有特异性环序列的多环链接发夹探针，每种探针可特异性结合外周血中的mirna靶向标志物，实现了在一块微阵列基片上同时反应多个肿瘤标志物不同表达量的目的；实验结果还表明：基于本发明的高度特异性，通过最终的荧光强度对比，可显著区分阳性患者及健康对照组。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
<120>基于外周血游离核苷酸mirnas超灵敏检测装置的试剂盒及其检测方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>62
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cgcgattctcccaacccttgtaccagtgatcgcgtgagcacatgaaatacactggagaat60
cg62
<210>2
<211>62
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
atgcgctctcccaacccttgtaccagtggcgcatcgattctccagtgtacaatcccacag60
tg62
<210>3
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cactgtgggattgtatttcatgtgctca28