本发明涉及生物技术及疾病检测领域，特别是一种基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法。
背景技术：
：结直肠癌(crc)是世界第三大恶性肿瘤，也被称为大肠癌，发生在结肠(大肠)或直肠中，通常发展缓慢，随着食品结构和生活习惯的改变，以及环境问题的日益突出，导致大肠癌发生率快速增长。中国近年来结直肠癌发病率逐年上升，估计每年约有40万新发病例，在我国消化系统恶性肿瘤中位列第二。国家癌症早诊早治项目专家委员会2013年研究报告指出，中国40岁以上高危人群患进展期腺瘤和早期肠癌比率为6％。这些癌变病灶不及时切除，90％的情况下将会转化为恶性肠癌。研究表明，早期结直肠癌患者手术5年生存率可高达90％以上，中、晚期患者5年生存率仅10％左右，而临床诊断的结直肠癌约80％为中晚期，这是导致其死亡率居高不下的关键因素之一。由于大多数患者没有进行癌症早筛查的意识，发现症状后才到医院检查，至结直肠癌确诊时，癌细胞已经扩散，后期疗效不明显，致使近半数肠癌患者生存期不超过五年。因此结直肠癌的早期发现、早期诊断及早期治疗显得尤为重要。研究表明，结直肠癌的早期发生与结直肠癌相关基因启动子区域的甲基化存在很大关系。骨形态发生蛋白基因(bmp3)属于转化生长因子-β(tgf-β)超家族成员，最初由于具有诱导异位骨和软骨形成的能力而被命名。近年研究表明，bmp3基因与肿瘤发生、发展及转移密切相关，在结直肠癌中bmp3基因的表达水平都被抑制，预示着bmp3基因甲基化水平可作为结直肠癌早期发生的重要生物学特征。若能够寻找到与结直肠癌发生相关的甲基化位点，就能够用于早期结直肠癌的辅助诊断，本发明解决这样的问题。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，通过检测bmp3基因启动子区的分子标记物是否发生甲基化，辅助诊断早期结直肠癌；检测方法为从组织、粪便样本中提取dna，经亚硫酸氢盐处理后，进行实时定量pcr测定，通过计算bmp3目标基因(fam信号)ct值与b2m内参基因(joe信号)ct值的差值，判断样本中是否发生甲基化以及甲基化水平；这样的检测方式无创，可用于早期结直肠癌的辅助诊断。为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，bmp3基因的甲基化序列如下：gttagtttggtmcgggtgtttttaaaaataaagmcgaggagggaaggtatagatagattttgaaaatattmcgggttatatamcgtmcgmcgatttatagtttttttttagmcgttggagtggagamcggmcgttmcgtagmcgttttgmcgmcgggtgaggttmcgmcgtagttgttggggaagagtttatttgttaggttgmcgttgggttagmcgtagtaagtggggttggtmcgttatttmcgttgtattmcggtmcgmcgtttmcgggtttmcgtgmcgttttmcgttttagmcg表示cpg岛的c发生了甲基化修饰；诊断方法包括如下步骤：步骤一，从生物样本中提取基因组dna；步骤二，设计bmp3基因甲基化序列的引物和探针；步骤三，将提取的基因组dna经过转化液处理；步骤四，将转化液处理后的dna进行定量pcr检测；步骤五，结果判定：自动设置基线，手动设置阈值线，根据实际情况调节阈值线至fam和joe扩增曲线升起的拐点处，且目标基因fam信号的阈值线需超过正常阴性对照的最高点处设定的阈值线；根据待测样本的定量pcr检测信号，达到设定阈值线所需的循环次数，得到ct值；若△ct＝bmp3目标基因fam信号的ct值-b2m内参基因joe信号的ct值≤临界值，则该样本为发生甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阳性；若△ct＝bmp3目标基因fam信号的ct值-b2m内参基因joe信号的ct值>临界值，则该样本为未发生甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阴性；临界值为bmp3基因检测体系检测浓度为5ng/μl的1％比例甲基化参考品对应的△ct值。基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，bmp3基因的甲基化序列如下：gttagtttggtmcgggtgtttttaaaaataaagmcgaggagggaaggtatagatagattttgaaaatattmcgggttatatamcgtmcgmcgatttatagtttttttttagmcgttggagtggagamcggmcgttmcgtagmcgttttgmcgmcgggtgaggttmcgmcgtagttgttggggaagagtttatttgttaggttgmcgttgggttagmcgtagtaagtggggttggtmcgttatttmcgttgtattmcggtmcgmcgtttmcgggtttmcgtgmcgttttmcgttttagmcg表示cpg岛的c发生了甲基化修饰；诊断方法包括如下步骤：步骤一，从生物样本中提取基因组dna；步骤二，设计bmp3基因甲基化序列的引物，探针，阳性质控和阴性质控；内部质控，用b2m基因作为内参基因，碱基序列为ncbi数据库中基因序列编号为ng_012920.1第3886到4010位，对应的序列cg以外序列中c转换成t；针对这段转换的序列设计内部控制引物和内控探针，并对内控的上下游引物进行筛选，使非模版体系没有明显的扩增曲线，样本有明显的扩增曲线正常；步骤三，将提取的基因组dna经过转化液处理；步骤四，将转化液处理后的dna进行定量pcr检测；步骤五，结果判定：先判断样本是否符合要求，若阳性质控体系的目标基因bmp3对应的fam信号有明显的扩增曲线，内部质控b2m基因对应的joe有明显的扩增曲线，且joe信号的ct值的差值，即△ct≤临界值，则符合要求，检测结果正确，该样本为甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阳性；若阴性质控体系的fam无扩增曲线，joe有明显的扩增曲线，且joe信号的ct值的差值，即△ct＞临界值，则符合要求，检测结果正确，该样本为甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阴性；临界值为bmp3基因检测体系检测浓度为5ng/μl的1％比例甲基化参考品对应的△ct值。前述的基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，临界值为9。前述的基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，步骤一，从组织样本中提取基因组dna；采用takaraminibestffpednaextractionkit从ffpe样本中提取基因组dna；具体步骤如下：用灭菌手术刀刮取30mg的石蜡切片组织，去除多余的石蜡；将石蜡切片组织放入1.5ml的离心管中，加入500μlbufferdp，混匀后于80℃水浴1分钟，趁热涡旋震荡10秒，加入180μlbuffergl，涡旋震荡；然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成两层，上层油相，下层水相，向下层水相中加入20μlproteinasek，20mg/ml和10μlrnase，10mg/ml，吸打混匀，然后56℃水浴1小时，将处理后的样品90℃水浴30分钟，冷却至室温；将处理的样品加入200μlbuffergb和200μl100％乙醇，涡旋震荡10秒；然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成两层，上层油相，下层水相；将spincolumn安置于collectiontube上，将样品的下层水相溶液移至spincolumn中，然后12000rpm室温离心2分钟，弃滤液；将500μl的bufferwa加至spincolumn中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；将500μl的bufferwb加至spincolumn中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；重复上一步，将500μl的bufferwb加至spincolumn中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；将spincolumn安置于collectiontube上，12000rpm室温离心2分钟；将spincolumn安置于新的1.5ml离心管上，在spincolumn膜的中央处加入50-100μl灭菌水或者elutionbuffer，室温静置5分钟；12000rpm室温离心2分钟，洗脱dna；将离心得到的dna溶液用nanodrop检测浓度及纯度；将检测合格的dna保存于-20℃冰箱，备用。前述的基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，步骤一，从粪便样本中提取基因组dna；取粪便样本(4-6g)加入裂解液40ml，涡旋振荡，充分混匀后50℃孵育16小时；孵育结束后5000rpm离心10min，离心前注意称重平衡，离心结束后，小心地取出离心管，勿剧烈晃动；移取9ml上清液于新的50ml离心管中，再分别加入1ml提取辅佐液、60μl磁珠液和10ml异丙醇，旋涡振荡10sec，65℃孵育20min，孵育期间每隔5min上下颠倒混匀一次。孵育结束后，将50ml离心管放在磁力架上，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；将离心管从磁力架中取出，加入12ml洗涤液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再次放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；加15ml80％乙醇溶液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；重复上一步骤1次；用移液器吸尽底部残余液体，开盖，将离心管65℃中孵育5min，待磁珠干燥后取出，加入1.5ml预热的洗脱液i，用1000μl移液器将磁珠从管壁上吹洗下来，反复抽吸，连同磁珠一起转移至2ml离心管中，闭合离心管盖65℃孵育5min；13000rpm离心3min，移取600μl上清液至新的1.5ml离心管，加入600μl柱结合液，充分混匀；转移600μl混合液至dna纯化柱中，13000rpm离心1min，弃废液；向dna纯化柱中加入600μl的90％乙醇溶液，13000rpm离心1min，弃废液；重复上一步骤2次；13000rpm离心3min，将dna纯化柱放入新的1.5ml离心管，打开离心管盖65℃孵育5min，烘干；向dna纯化柱中间位置悬空滴加100μl预热的洗脱液ii，闭合盖子65℃孵育5min，13000rpm离心2min，得洗脱后的dna溶液，2～8℃保存备用，若长期保存需保存在-25～-15℃。前述的基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，步骤二，设计bmp3基因的甲基化序列的引物和探针；bmp3引物包括：bmp3正向引物，bmp3反向引物；bmp3正向引物包括：seqidno.1：aaataaagcgaggagggaagg；seqidno.2：gagacggcgttcgtagcg；seqidno.3：agcgttggagtggagacgg；bmp3反向引物包括：seqidno.4：cccaacaactacgcgaacc；seqidno.5：cgaaataacgaccaaccccac；seqidno.6：aaacccgaaacgcgacc；bmp3探针包括：seqidno.7：tcgggttatatacgtcgcga；seqidno.8：gttcgcgtagttgttggg；seqidno.9：gtgaggttcgcgtagttgttg；前述的基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，bmp3的正向引物为seqidno.3，bmp3的反向引物为seqidno.6；bmp3探针为seqidno.9。前述的基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，bmp3的阳性标准物为含有seqidno.10的核苷酸序列；gttagtttggtcgggtgtttttaaaaataaagcgaggagggaaggtatagatagattttgaaaatattcgggttatatacgtcgcgatttatagtttttttttagcgttggagtggagacggcgttcgtagcgttttgcgcgggtgaggttcgcgtagttgttggggaagagtttatttgttaggttgcgttgggttagcgtagtaagtggggttggtcgttatttcgttgtattcggtcgcgtttcgggtttcgtgcgttttcgttttag；bmp3的阴性标准物为含有seqidno.11的核苷酸序列；gttagtttggttgggtgtttttaaaaataaagtgaggagggaaggtatagatagattttgaaaatatttgggttatatatgttgtgatttatagtttttttttagtgttggagtggagatggtgtttgtagtgttttgtgtgggtgaggtttgtgtagttgttggggaagagtttatttgttaggttgtgttgggttagtgtagtaagtggggttggttgttattttgttgtatttggttgtgttttgggttttgtgtgtttttgttttag；正向质控引物为seqidno.12：ttgtggattttattattaygaaatgg；反向质控引物为seqidno.13：aaactacatctaccttaaacccaacc；质控探针为核苷酸序列seqidno.14：gtattttatttatggttattttagagggt；质控标准物含有seqidno.15：agaaaagatttgtggattttattattacgaaatggcggtattttatttatggttattttagagggtaggtttttttaatgggtttgtttgttatgtttaacgtttttggttgggtttaaggtagatgtagtttaaatttttattaaaattgtcgag。前述的基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，步骤三，将提取的基因组dna经过亚硫酸氢盐转化液处理；具体包括如下步骤：将提取的基因组dna从冰箱取出解冻，稀释dna浓度至20ng/μl。取40μl稀释后的dna溶液加入到1.5ml离心管中，然后加入4μl3m的naoh溶液，42℃孵育20min；加入400μl亚硫酸氢盐转化液，混匀，50℃避光孵育16小时；加入550μl柱结合液，混匀，然后将溶液转移至dna纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心3分钟，弃废液；加入600μl90％乙醇至dna纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心15秒；加入300μl脱硫液，常温放置30分钟，13000rpm离心90秒，弃废液；加入600μl90％乙醇，13000rpm离心90秒，弃废液，重复此步骤1次，再次离心3分钟；将dna纯化柱放入新的1.5ml离心管中，加入40μl洗脱液，50℃孵育30分钟，13000rpm离心90秒，得转化后的dna溶液，于-20℃保存备用。前述的基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，步骤四，将转化液处理后的dna进行定量pcr检测；定量pcr检测具体步骤包括：配制检测反应体系，pcr反应体系中组分如下：10×pcr缓冲液：5～10μlmgcl2：2.0～5.0mmoldntp：0.2～0.8mmol各条引物：0.1～1.0μmol各条探针：0.1～1.0μmolfastmasterpremix：5～10μl样品dna模板：2μl其余用超纯水补足总体积：20μl。实时荧光pcr扩增反应条件优选为：第一阶段：95℃5min；第二阶段：95℃20s，60℃40s，15个循环；第三阶段:95℃20s，58℃20s，30个循环；第三阶段:30个循环中58℃时，收集荧光信号。本发明的有益之处在于：本发明利用分子标记物检测疾病的方法，灵敏度高，可以准确检出低至0.01ng/μl的基因组dna，适用于粪便样本中脱落的细胞即浓度很低的样本也能准确检出；特异性强，对于高至500ng的粪便样本dna也能够准确检出，因此，可以减少稀释样本的过程，提取出的样本直接上母液都能准确检测而不会出现结果误判；本发明从组织、粪便样本中提取dna；这样的检测方式无创，不会给病人带来痛苦；本发明设计的引物和探针能与待测位点互补，具有高灵敏度和高特异性；本发明的检测方法用亚硫酸氢盐处理dna片段，以便将dna样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，获得经过转换的dna片段，将dna样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变；本发明通过实时荧光定量pcr检测，通过计算计算△ct值：△ct＝bmp3目标基因fam信号的ct值-b2m内参基因joe信号的ct值≤临界值为发生甲基化样本；△ct＝bmp3目标基因fam信号的ct值-b2m内参基因joe信号的ct值>临界值为未发生甲基化样本。此检测方法具有高通量和高敏感性的优点，无需在pcr后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差；本发明设置有质控品，从而避免漏检、及初步判断样本dna量是否在允许范围内，质控品，还设有阴性质控和检测引物的阳性质控；为了避免假阴性及漏检，设有阳性质控，若阳性质控检测呈阳性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阴性结果及漏检；为了避免假阳性及漏检，设有阴性对照，若阴性对照检测呈阴性结果，说明检测体系没有问题；这样的设计使得检测严谨，有效避免漏检、错检的可能。附图说明图1为本发明检测方法的一种实施例的流程图；图2为本发明bmp3启动子区序列(2000bp)的cpg岛预测图；图3为本发明bmp3基因启动子区4个扩增子的位置示意图；图4为本发明bmp3基因启动子区在肠癌组织患者样本中cpg位点发生百分比；图5为本发明bmp3基因启动子区在进展期腺瘤组织患者样本中cpg位点发生百分比；图6为本发明bmp3基因甲基化序列获得的流程图；图7为本发明bmp3基因启动子区不同引物探针组合对比扩增曲线；图8为本发明bmp3基因甲基化检测体系灵敏度扩增曲线；图9为本发明bmp3基因甲基化阳性样本扩增曲线；图10为本发明bmp3基因甲基化阴性样本扩增曲线。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。实验一，如图6所示，bmp3基因启动子区甲基化cpg岛的发现过程如下所示：一、样本收集收集了191例经肠镜病理确定的不同病程分布的临床样本，包括：50例结直肠癌组织样本，49例配对的临近正常组织，46例进展期腺瘤组织样本，46例配对的临近正常组织；样本信息如表1所示：表1结直肠癌(crc)组织样本crc-临近正常组织进展期腺瘤(aa)组织样本aa-临近正常组织50494646结直肠癌样本与临近正常组织样本和进展期腺瘤样本与临近正常组织样本信息如表2所示：表2二、组织样本提取采用takaraminibestffpednaextractionkit(货号：9782)从ffpe样本中提取基因组dna。具体步骤如下：(1)用灭菌手术刀刮取30mg的石蜡切片组织，尽量去除多余的石蜡。(2)将石蜡切片组织放入1.5ml的离心管中，加入500μlbufferdp，混匀后于80℃水浴1分钟，趁热涡旋震荡10秒，加入180μlbuffergl，涡旋震荡。(3)然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成两层(上层油相，下层水相)，向下层水相中加入20μlproteinasek(20mg/ml)和10μlrnase(10mg/ml)，吸打混匀。注意不要破坏分层，然后56℃水浴1小时。(4)将步骤(3)处理后的样品90℃水浴30分钟，冷却至室温。(5)向步骤(4)处理的样品加入200μlbuffergb和200μl100％乙醇，涡旋震荡10秒。(6)然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成2层(上层油相，下层水相)。(7)将spincolumn安置于collectiontube上，将步骤(6)样品的下层水相溶液移至spincolumn中。注意不要取到上层油相溶液，然后12000rpm室温离心2分钟，弃滤液。(8)将500μl的bufferwa加至spincolumn中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液。(9)将500μl的bufferwb加至spincolumn中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液。(10)重复步骤(9)。(11)将spincolumn安置于collectiontube上，12000rpm室温离心2分钟。(12)将spincolumn安置于新的1.5ml离心管上，在spincolumn膜的中央处加入50-100μl灭菌水或者elutionbuffer，室温静置5分钟。(13)12000rpm室温离心2分钟，洗脱dna。(14)将离心得到的dna溶液用nanodrop检测浓度及纯度。(15)将检测合格的dna保存于-20℃冰箱，备用。三、bmp3启动子区预测及引物设计；(1)bmp3基因启动区cpg岛的预测下载bmp3基因启动子区前2000bp的dna序列，见序列seqidno.16(见表3)。用methprimer软件预测cpg岛，预测结果如附图2。由附图2可见，cpg岛集中在启动子区前879bp的序列。(2)启动子区前1000bp序列扩增的引物设计针对1000bp的dna序列设计4对引物。引物序列及扩增子见序列seqidno.17-seqidno.28(见表3)。扩增子相对位置如附图3。将4对引物等浓度(2μm)混合，配置成引物mix，-20℃保存备用。表3四、亚硫酸氢盐处理；(1)将提取的基因组dna从冰箱取出解冻，稀释dna浓度至20ng/μl。取40μl稀释后的dna溶液加入到1.5ml离心管中，然后加入4μl3m的naoh溶液，42℃孵育20min。(2)加入400μl转化液，混匀，50℃避光孵育16小时。(3)加入550μl柱结合液，混匀，然后将溶液转移至dna纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心3分钟，弃废液。(4)加入600μl90％乙醇至dna纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心15秒。(5)加入300μl脱硫液(0.3mnaoh的90％乙醇溶液)，常温放置30分钟，13000rpm离心90秒，弃废液。(6)加入600μl90％乙醇，13000rpm离心90秒，弃废液，重复此步骤1次，再次离心3分钟。(7)将dna纯化柱放入新的1.5ml离心管中，加入40μl洗脱液，50℃孵育30分钟，13000rpm离心90秒，得转化后的dna溶液，于-20℃保存备用。五、文库制备与上机测序；1.多重pcr扩增按照如下体系和反应条件进行pcr扩增。多重pcr反应采用qiagenmultiplexpcrkit(货号：206143)进行。具体步骤如下：1)将2×qiagenmultiplexpcrmastermix、引物mix从-20℃取出，室温解冻。准备好亚硫酸氢盐处理后的dna、rnase-freewater。使用前，将2×qiagenmultiplexpcrmastermix和引物mix旋涡混匀。2)根据表4配制mastermix，旋涡短暂混匀。表4序号组分体积(μl)/反应终浓度12×qiagenmultiplexpcrmastermix251×210×primermix(2μmeach)50.2μm3rnase-freewater104亚硫酸氢盐处理后的dna10总体积501)向每个pcr管中加入40μlmastermix，然后加入10μl亚硫酸氢盐处理后的dna。3)旋涡混匀pcr管，然后按照表5的条件进行扩增。表52.电泳检测pcr产物配制1％的琼脂糖凝胶电泳，将5μl的pcr产物与2μl6×loadingbuffer(厂家：takara，货号：9156)混合，上样进行电泳检测，dnamarker为dl2000dnamarker(厂家：takara，货号：3427q)，120v电泳40分钟。如电泳检测有非特异性扩增，需将剩余45μl的pcr产物电泳后切胶回收(厂家：qiagen，货号：28704)，具体操作按试剂盒说明书进行。3.pcr产物纯化与定量(1)采用qiagen的minelutepcrpurificationkit进行pcr产物纯化(货号：28004)，按照试剂盒说明书进行。(2)采用qubittmdsdnabrassaykit试剂盒(货号：q32850)进行纯化后产物的定量。4.接头连接与纯化(1)采用neb的quickligationmodule(货号：e6056l)进行接头连接。按照表6配制mastermix。表6序号组分体积(μl)/反应1nebnextquickligationreactionbuffer(5×)102adapter53quickt4dnaligase54rnase-freewater105纯化后的pcr产物20总体积50(2)将pcr管旋涡混匀，短暂离心后，按照表7的条件进行反应。表7步骤温度时间循环数step120℃15min1step24℃hold15.连接产物纯化；提前将agencourtampurexpbeads(厂家：beckmancoulter，货号：a63882)从4℃冰箱放置到室温平衡。(1)将pcr管于280g20℃离心1分钟，使连接产物收集到管底。(2)将移液器量程调至50μl，将连接产物全部转移到新的96孔板中。(3)将ampurexp磁珠旋涡混匀30秒，确保磁珠均匀分散。(4)向96孔板的每个样本孔中加入56μlampurexp磁珠。(5)用移液器轻轻吹打10次，混匀。(6)室温静止孵育5分钟。(7)将96孔板放置到96孔磁力板上，静止2分钟，直至上清液澄清。(8)保持96孔板放置在96孔磁力板上，用移液器移去上清液。(9)保持96孔板放置在96孔磁力板上，加入200μl新鲜配置的80％乙醇到每个样本孔中，孵育30秒，然后小心移去上清(第一次洗涤)。(10)保持96孔板放置在96孔磁力板上，加入200μl新鲜配置的80％乙醇到每个样本孔中，孵育30秒，然后小心移去上清，用带有小枪头的移液器(10μl)移去剩余的乙醇(第二次洗涤)。(11)保持96孔板在磁力板上，让磁珠自然干燥10分钟。(12)将96孔板从磁力板上移走，加27.5μl的10mmtris(ph8.5)到每个样本孔中。用移液器轻轻吹打10次，直到磁珠完全混匀。然后室温静止孵育2分钟。(13)将96孔板放在磁力板上，静止2分钟，直到上清液澄清。(14)用移液器小心吸取25μl上清液到新的pcr管中，-20℃保存备用。6.pcr扩增；(1)采用neb的ultratmiimastermix(货号：m0544)进行pcr扩增。按照表8配制pcr反应mix，然后加入5μl纯化后的连接产物。表8序号名称用量(μl)/样本终浓度1nebnextultraq5mastermix251×2forwardprimer(10μm)51μm3reverseprimer(10μm)51μm4接头连接的dna105nuclease-freewater5总体积50(2)将pcr管旋涡混匀，短暂离心后，按照表9的条件进行pcr扩增。表97.pcr产物纯化；与步骤5同，在此不再赘述。8.文库质控；采用qubittmdsdnabrassaykit试剂盒(货号：q32850)进行文库定量检测，agilent2100bioanalyzerinstruments进行文库片段大小检测。9.文库合并与上机测序将文库等摩尔浓度混合后，上机测序；采用illuminahiseq2500进行测序，读长pe125。六、数据分析与处理按照index对数据进行拆分，采用shrimpv2.04进行reads比对，根据比对结果分析可能的甲基化cpg位点。验证结果表明，发现有26个cpg位点在结直肠癌组织样本与临近正常组织样本、进展期腺瘤组织样本与临近正常组织样本中的甲基化频率存在显著差异(p<0.01)，见图4、5。由此推断，该甲基化序列可以用于早期结直肠癌的辅助诊断。下表10、11为：结直肠癌组织样本、进展期腺瘤组织样本和临近正常组织样本中bmp3启动子区甲基化频率，甲基化频率指cpg岛甲基化的样本数/样本总数。表10表11早期结直肠癌与bmp3基因的甲基化序列相关位点如下：gttagtttggtmcgggtgtttttaaaaataaagmcgaggagggaaggtatagatagattttgaaaatattmcgggttatatamcgtmcgmcgatttatagtttttttttagmcgttggagtggagamcggmcgttmcgtagmcgttttgmcgmcgggtgaggttmcgmcgtagttgttggggaagagtttatttgttaggttgmcgttgggttagmcgtagtaagtggggttggtmcgttatttmcgttgtattmcggtmcgmcgtttmcgggtttmcgtgmcgttttmcgttttag备注：mcg表示cpg岛的c发生了甲基化修饰。提示，bmp3基因甲基化cpg位点可能是一种早期结直肠癌辅助诊断的分子标志物；于是，针对这26个甲基化位点对应的序列设计引物与探针，进行qpcr验证。七、bmp3基因启动子区甲基化cpg岛在组织样本中的qpcr验证；针对基于bmp3基因启动子区序列中发现的cpg岛位点，设计msp(methylation-specificpcr)引物和探针，同时设置内部质控，用b2m基因作为内参基因；使用191例组织样本对引物探针组合进行筛选，对提取的dna进行亚硫酸氢盐处理，使用优选设计的3对引物探针组合进行荧光定量pcr验证。步骤一，191例组织组织样本采用takaraminibestffpednaextractionkit提取基因组dna；步骤二，设计bmp3基因的甲基化序列的引物，探针，阳性质控和阴性质控；内部质控，用b2m基因作为内参基因，碱基序列为ncbi数据库中基因序列编号为ng_012920.1第3886到4010位，对应的序列cg以外序列中c转换成t；针对这段转换的序列设计内部控制引物和内控探针，并对内控的上下游引物进行筛选，使非模版体系(ntc)没有明显的扩增曲线(不起线)，样本有明显的扩增曲线(起线)正常。设计bmp3基因的甲基化序列的引物和探针；bmp3引物包括：bmp3正向引物，bmp3反向引物；所述bmp3正向引物包括：seqidno.1：aaataaagcgaggagggaagg；seqidno.2：gagacggcgttcgtagcg；seqidno.3：agcgttggagtggagacgg；所述bmp3反向引物包括：seqidno.4：cccaacaactacgcgaacc；seqidno.5：cgaaataacgaccaaccccac；seqidno.6：aaacccgaaacgcgacc；bmp3探针包括：seqidno.7：tcgggttatatacgtcgcga；seqidno.8：gttcgcgtagttgttggg；seqidno.9：gtgaggttcgcgtagttgttg；bmp3的阳性标准物为含有seqidno.10的核苷酸序列；gttagtttggtcgggtgtttttaaaaataaagcgaggagggaaggtatagatagattttgaaaatattcgggttatatacgtcgcgatttatagtttttttttagcgttggagtggagacggcgttcgtagcgttttgcgcgggtgaggttcgcgtagttgttggggaagagtttatttgttaggttgcgttgggttagcgtagtaagtggggttggtcgttatttcgttgtattcggtcgcgtttcgggtttcgtgcgttttcgttttag；bmp3的阴性标准物为含有seqidno.11的核苷酸序列；gttagtttggttgggtgtttttaaaaataaagtgaggagggaaggtatagatagattttgaaaatatttgggttatatatgttgtgatttatagtttttttttagtgttggagtggagatggtgtttgtagtgttttgtgtgggtgaggtttgtgtagttgttggggaagagtttatttgttaggttgtgttgggttagtgtagtaagtggggttggttgttattttgttgtatttggttgtgttttgggttttgtgtgtttttgttttag；引物探针组合1：正向引物序列：seqidno.1；反向引物序列：seqidno.4；探针序列：seqidno.7；引物探针组合2：正向引物序列：seqidno.2；反向引物序列：seqidno.5；探针序列：seqidno.8；引物探针组合3：正向引物序列：seqidno.3；反向引物序列：seqidno.6；探针序列：seqidno.9；内部质控，用b2m基因作为内参基因，碱基序列为ncbi数据库中基因序列编号为ng_012920.1第3886到4010位，对应的序列cg以外序列中c转换成t；针对这段转换的序列设计内部控制引物和内控探针，并对内控的上下游引物进行筛选，使非模版体系(ntc)没有明显的扩增曲线(不起线)，样本有明显的扩增曲线(起线)正常。正向质控引物为seqidno.12：ttgtggattttattattaygaaatgg；反向质控引物为seqidno.13：aaactacatctaccttaaacccaacc；质控探针为核苷酸序列seqidno.14：gtattttatttatggttattttagagggt；质控标准物含有seqidno.15：agaaaagatttgtggattttattattacgaaatggcggtattttatttatggttattttagagggtaggtttttttaatgggtttgtttgttatgtttaacgtttttggttgggtttaaggtagatgtagtttaaatttttattaaaattgtcgag。步骤三，将提取的基因组dna经过亚硫酸氢盐转化液处理；具体包括如下步骤：将提取的基因组dna从冰箱取出解冻，稀释dna浓度至20ng/μl。取40μl稀释后的dna溶液加入到1.5ml离心管中，然后加入4μl3m的naoh溶液，42℃孵育20min；加入400μl亚硫酸氢盐转化液，混匀，50℃避光孵育16小时；加入550μl柱结合液，混匀，然后将溶液转移至dna纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心3分钟，弃废液；加入600μl90％乙醇至dna纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心15秒；加入300μl脱硫液(0.3mnaoh的90％乙醇溶液)，常温放置30分钟，13000rpm离心90秒，弃废液；加入600μl90％乙醇，13000rpm离心90秒，弃废液，重复此步骤1次，再次离心3分钟；将dna纯化柱放入新的1.5ml离心管中，加入40μl洗脱液，50℃孵育30分钟，13000rpm离心90秒，得转化后的dna溶液，于-20℃保存备用。步骤四，将转化液处理后的dna进行定量pcr检测；配制检测反应体系，pcr反应体系中组分如下：10×pcr缓冲液：5～10μlmgcl2：2.0～5.0mmoldntp：0.2～0.8mmol各条引物：0.1～1.0μmol各条探针：0.1～1.0μmolfastmasterpremix：5～10μl样品dna模板：2μl其余用超纯水补足总体积：20μl。实时荧光pcr扩增反应条件优选为：第一阶段：95℃5min；第二阶段：95℃20s，60℃40s，15个循环；第三阶段:95℃20s，58℃20s，30个循环；第三阶段:30个循环中58℃时，收集荧光信号。收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，自动设置基线，手动设置阈值线，根据实际情况调节阈值线至fam和joe扩增曲线升起的拐点处，且目标基因fam信号的阈值线需超过正常阴性对照的最高点处设定阈值线；步骤五，数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线值线，所述阈值值线为刚好超过正常阴性对照的最高点的值，根据实际情况调节threshold至fam和joe扩增曲线升起的拐点处，得到ct值，计算△ct值；结果判定：首先内部质控b2m基因对应的joe有明显的扩增曲线且joe信号的ct值小于25，则符合要求；阳性质控体系的目标基因bmp3对应的fam信号有明显的扩增曲线，内部质控b2m基因对应的joe有明显的扩增曲线的ct值的差值，即△ct≤临界值，则符合要求，检测结果正确；阴性质控体系的fam无扩增曲线，joe有明显的扩增曲线且joe信号的ct值的差值，即△ct＞临界值，则符合要求，检测结果正确；样本判定：△ct＝bmp3目标基因fam信号的ct值-b2m内参基因joe信号的ct值≤临界值为发生甲基化样本；△ct＝bmp3目标基因fam信号的ct值-b2m内参基因joe信号的ct值>临界值为未发生甲基化样本。使用3组引物探针组合对191例组织样本进行检测，统计每个样本目标基因和内参基因的ct值，计算△ct值：即bmp3目标基因fam信号的ct值-b2m内参基因joe信号的ct值，统计检测结果的△ct值。以△ct值为检验变量，病理结果为状态变量，用roc曲线对△ct值进行分析，综合三种组合检测结果，使用cutoff对应的△ct值为9分析甲基化水平与肠癌及进展期腺瘤相关性的性能结果分析见表12，通过对比引物探针组合3的性能指标较优。表12备注：引物探针组合1：正向引物：seqidno.1+反向引物：seqidno.4+探针：seqidno.7；引物探针组合2：正向引物：seqidno.2+反向引物：seqidno.5+探针：seqidno.8；引物探针组合3：正向引物：seqidno.3+反向引物：seqidno.6；探针：seqidno.9；灵敏度为甲基化检测阳性(真阳性)的样本/总的阳性样本；特异性为甲基化检测阴性(真阴性)的样本/总的阴性样本。实验二：bmp3启动子区甲基化cpg岛在粪便样本中的qpcr测试；普通人每天数以百万计的细胞从结肠壁脱落进入到排泄系统，包括肠道肿瘤形成过程中的细胞。进入排泄系统后的细胞中含有相应的dna，其中含有和肿瘤密切相关的遗传信息，反映结直肠癌或肿瘤的形成过程。早期肠癌细胞中有些基因发生甲基化转变，是肠癌的预兆，这些细胞会自然脱落到肠道中，与粪便一起排出。通过检测这些dna标记物，就可以发现结直肠癌或肿瘤等在肠壁的存在。因此，从粪便中提取dna进行肿瘤相关基因检测，可以实现非侵入性、无创无痛、方便家中采样，无需前往医院，无需饮食或用药限制。人体生物样本包括：组织、细胞、血液、分泌物和排泄物；其中排泄物为粪便。作为一种优选，基于无侵入性和低廉方便考虑，优选粪便样本。为了验证粪便样本能够精确的实现结直肠癌早期检测，做如下实验：步骤一，收集49例结直肠癌病人、20例进展期腺瘤病人与51例健康人(年龄大于40岁进行结直肠癌筛查，结果阴性的样本)的粪便样本(样本信息见表13)，对验证的这段甲基化cpg岛进行qpcr测试(流程图见图1)，检测体系中以b2m基因作为内参基因。对数据自动设置基线，手动设置临界值线，根据实际情况调节threshold至fam和joe扩增曲线升起的拐点处，得到ct值，计算△ct值：即bmp3目标基因(fam信号)ct值与b2m内参基因(joe信号)ct值的差值，若△ct≤临界值为发生甲基化样本；若△ct>临界值为未发生甲基化样本。表13粪便样本中提取基因组dna；取粪便样本(4-6g)加入裂解液40ml，涡旋振荡，充分混匀后50℃孵育16小时；孵育结束后5000rpm离心10min，离心前注意称重平衡，离心结束后，小心地取出离心管，勿剧烈晃动；移取9ml上清液于新的50ml离心管中，再分别加入1ml提取辅佐液、60μl磁珠液和10ml异丙醇，旋涡振荡10sec，65℃孵育20min，孵育期间每隔5min上下颠倒混匀一次。孵育结束后，将50ml离心管放在磁力架上，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；将离心管从磁力架中取出，加入12ml洗涤液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再次放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；加15ml80％乙醇溶液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；重复上一步骤1次；用移液器吸尽底部残余液体，开盖，将离心管65℃中孵育5min，待磁珠干燥后取出，加入1.5ml预热的洗脱液i，用1000μl移液器将磁珠从管壁上吹洗下来，反复抽吸，连同磁珠一起转移至2ml离心管中，闭合离心管盖65℃孵育5min；13000rpm离心3min，移取600μl上清液至新的1.5ml离心管，加入600μl柱结合液，充分混匀；转移600μl混合液至dna纯化柱中，13000rpm离心1min，弃废液；向dna纯化柱中加入600μl的90％乙醇溶液，13000rpm离心1min，弃废液；重复上一步骤2次；13000rpm离心3min，将dna纯化柱放入新的1.5ml离心管，打开离心管盖65℃孵育5min，烘干；向dna纯化柱中间位置悬空滴加100μl预热的洗脱液ii，闭合盖子65℃孵育5min，13000rpm离心2min，得洗脱后的dna溶液，2～8℃保存备用，若长期保存需保存在-25～-15℃。步骤二，设计bmp3基因的甲基化序列的引物，探针，阳性质控和阴性质控；内部质控，用b2m基因作为内参基因，碱基序列为ncbi数据库中基因序列编号为ng_012920.1第3886到4010位，对应的序列cg以外序列中c转换成t；针对这段转换的序列设计内部控制引物和内控探针，并对内控的上下游引物进行筛选，使非模版体系(ntc)没有明显的扩增曲线(不起线)，样本有明显的扩增曲线(起线)正常。设计bmp3基因的甲基化序列的引物和探针；bmp3引物包括：bmp3正向引物，bmp3反向引物；所述bmp3正向引物包括：seqidno.1：aaataaagcgaggagggaagg；seqidno.2：gagacggcgttcgtagcg；seqidno.3：agcgttggagtggagacgg；所述bmp3反向引物包括：seqidno.4：cccaacaactacgcgaacc；seqidno.5：cgaaataacgaccaaccccac；seqidno.6：aaacccgaaacgcgacc；bmp3探针包括：seqidno.7：tcgggttatatacgtcgcga；seqidno.8：gttcgcgtagttgttggg；seqidno.9：gtgaggttcgcgtagttgttg；bmp3的阳性标准物为含有seqidno.10的核苷酸序列；gttagtttggtcgggtgtttttaaaaataaagcgaggagggaaggtatagatagattttgaaaatattcgggttatatacgtcgcgatttatagtttttttttagcgttggagtggagacggcgttcgtagcgttttgcgcgggtgaggttcgcgtagttgttggggaagagtttatttgttaggttgcgttgggttagcgtagtaagtggggttggtcgttatttcgttgtattcggtcgcgtttcgggtttcgtgcgttttcgttttag；bmp3的阴性标准物为含有seqidno.11的核苷酸序列；gttagtttggttgggtgtttttaaaaataaagtgaggagggaaggtatagatagattttgaaaatatttgggttatatatgttgtgatttatagtttttttttagtgttggagtggagatggtgtttgtagtgttttgtgtgggtgaggtttgtgtagttgttggggaagagtttatttgttaggttgtgttgggttagtgtagtaagtggggttggttgttattttgttgtatttggttgtgttttgggttttgtgtgtttttgttttag；引物探针组合1：正向引物序列：seqidno.1；反向引物序列：seqidno.4；探针序列：seqidno.7；引物探针组合2：正向引物序列：seqidno.2；反向引物序列：seqidno.5；探针序列：seqidno.8；引物探针组合3：正向引物序列：seqidno.3；反向引物序列：seqidno.6；探针序列：seqidno.9；内部质控，用b2m基因作为内参基因，碱基序列为ncbi数据库中基因序列编号为ng_012920.1第3886到4010位，对应的序列cg以外序列中c转换成t；针对这段转换的序列设计内部控制引物和内控探针，并对内控的上下游引物进行筛选，使非模版体系(ntc)没有明显的扩增曲线(不起线)，样本有明显的扩增曲线(起线)正常。正向质控引物为seqidno.12：ttgtggattttattattaygaaatgg；反向质控引物为seqidno.13：aaactacatctaccttaaacccaacc；质控探针为核苷酸序列seqidno.14：gtattttatttatggttattttagagggt；质控标准物含有seqidno.15：agaaaagatttgtggattttattattacgaaatggcggtattttatttatggttattttagagggtaggtttttttaatgggtttgtttgttatgtttaacgtttttggttgggtttaaggtagatgtagtttaaatttttattaaaattgtcgag。步骤三，将提取的基因组dna经过亚硫酸氢盐转化液处理；具体包括如下步骤：将提取的基因组dna从冰箱取出解冻，稀释dna浓度至20ng/μl。取40μl稀释后的dna溶液加入到1.5ml离心管中，然后加入4μl3m的naoh溶液，42℃孵育20min；加入400μl亚硫酸氢盐转化液，混匀，50℃避光孵育16小时；加入550μl柱结合液，混匀，然后将溶液转移至dna纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心3分钟，弃废液；加入600μl90％乙醇至dna纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心15秒；加入300μl脱硫液(0.3mnaoh的90％乙醇溶液)，常温放置30分钟，13000rpm离心90秒，弃废液；加入600μl90％乙醇，13000rpm离心90秒，弃废液，重复此步骤1次，再次离心3分钟；将dna纯化柱放入新的1.5ml离心管中，加入40μl洗脱液，50℃孵育30分钟，13000rpm离心90秒，得转化后的dna溶液，于-20℃保存备用。步骤四，将转化液处理后的dna进行定量pcr检测；配制检测反应体系，pcr反应体系中组分如下：10×pcr缓冲液：5～10μlmgcl2：2.0～5.0mmoldntp：0.2～0.8mmol各条引物：0.1～1.0μmol各条探针：0.1～1.0μmolfastmasterpremix：5～10μl样品dna模板：2μl其余用超纯水补足总体积：20μl。实时荧光pcr扩增反应条件优选为：第一阶段：95℃5min；第二阶段：95℃20s，60℃40s，15个循环；第三阶段:95℃20s，58℃20s，30个循环；第三阶段:30个循环中58℃时，收集荧光信号。收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，自动设置基线，手动设置阈值线，根据实际情况调节阈值线至fam和joe扩增曲线升起的拐点处，且目标基因fam信号的阈值线需超过正常阴性对照的最高点处设定阈值线；步骤五，数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线值线，所述阈值值线为刚好超过正常阴性对照的最高点的值，根据实际情况调节threshold至fam和joe扩增曲线升起的拐点处，得到ct值，计算△ct值；结果判定：首先内部质控b2m基因对应的joe有明显的扩增曲线且joe信号的ct值小于25，则符合要求；阳性质控体系的目标基因bmp3对应的fam信号有明显的扩增曲线，内部质控b2m基因对应的joe有明显的扩增曲线的ct值的差值，即△ct≤临界值，则符合要求，检测结果正确；阴性质控体系的fam无扩增曲线，joe有明显的扩增曲线且joe信号的ct值的差值，即△ct＞临界值，则符合要求，检测结果正确；样本判定：△ct＝bmp3目标基因fam信号的ct值-b2m内参基因joe信号的ct值≤临界值为发生甲基化样本；△ct＝bmp3目标基因fam信号的ct值-b2m内参基因joe信号的ct值>临界值为未发生甲基化样本。使用3对引物探针组合对120例粪便样本进行检测，统计每个样本目标基因和内参基因的ct值，计算△ct值：即bmp3目标基因fam信号的ct值-b2m内参基因joe信号的ct值，统计检测结果的△ct值。以△ct值为检验变量，病理结果为状态变量，用roc曲线对△ct值进行分析，综合三种组合检测结果，使用cutoff对应的△ct值为9分析甲基化水平与肠癌及进展期腺瘤相关性的性能结果分析见表14，通过对比引物探针组合3的性能指标较优。表14备注：引物探针组合1：正向引物：seqidno.1+反向引物：seqidno.4+探针：seqidno.7；引物探针组合2：正向引物：seqidno.2+反向引物：seqidno.5+探针：seqidno.8；引物探针组合3：正向引物：seqidno.3+反向引物：seqidno.6；探针：seqidno.9；灵敏度为甲基化检测阳性(真阳性)的样本/总的阳性样本；特异性为甲基化检测阴性(真阴性)的样本/总的阴性样本。本发明通过检测bmp3基因启动子区的一段甲基化序列甲基化，用于辅助诊断早期结直肠癌；本发明从粪便样本中提取dna；这样的检测方式无创，不会给病人带来痛苦；本发明设计的引物和探针能与待测位点互补，具有高灵敏度和高特异性；本发明的检测方法用亚硫酸氢盐处理dna片段，以便将dna样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，获得经过转换的dna片段，将dna样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变；本发明通过进行实时定量pcr检测，通过计算bmp3目标基因(fam信号)ct值与b2m内参基因(joe信号)ct值的差值，判断样本中是否发生甲基化以及甲基化水平；这样的检测具有高通量和高敏感性的优点，无需在pcr后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。当前第1页12