一种转氨酶突变体及其生产L-草铵膦的应用的制作方法

文档序号:16103274发布日期:2018-11-28 00:24阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种转氨酶突变体,其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列第23位的组氨酸取代为谷氨酰胺、第34位的精氨酸取代为脯氨酸、第116位的谷氨酸取代为缬氨酸、第325位的丙氨酸取代为甘氨酸、第397位的亮氨酸取代为谷氨酰胺、第415位的谷氨酸取代为天冬氨酸。

2.一种权利要求1所述转氨酶突变体的编码基因,其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。

3.一种权利要求1所述转氨酶突变体在生物催化合成L-草铵膦中的应用。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述的应用以含有转氨酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂,以2-羰基-4-(甲基羟基磷酰基)-丁酸为底物,以磷酸吡哆醛为辅酶、以氨基供体为辅底物,以6-9缓冲液为反应介质构成反应体系,在温度30-50℃、搅拌速度150-250r/min的条件下进行生物催化反应,反应结束后,将反应液分离纯化,获得L-草铵膦;所述氨基供体为L-谷氨酸、L-天冬氨酸或L-丙氨酸中的一种或两种任意比例的混合。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述反应体系中,湿菌体用量终浓度为10~200g/L,所述底物的加入终浓度为10~500mmol/L,所述辅酶的加入终浓度为0.1~20mmol/L,氨基供体加入终浓度为10~1750mmol/L。

6.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述缓冲液为硼砂-硼酸缓冲液。

7.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述氨基供体为L-丙氨酸。

8.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:将含有转氨酶突变体编码基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基,37℃,200rpm下培养12h,再以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中,于37℃,150rpm下培养至菌体OD600达0.6~0.8,加入终浓度为0.1mM的IPTG,28℃下诱导培养12h后,4℃、8000rpm离心10min,弃去上清液,收集湿菌体。

9.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述反应液分离纯化的方法为:(1)预处理:取反应液减压浓缩至原体积的10-50%后调节pH值至2-5,获得预处理液;

(2)将步骤(1)得到的预处理液,使用钠型001×7阳离子树脂进行离子吸附,离子交换柱高径比为13:1,上样流速为1BV/h,上样后用超纯水冲洗4BV,收集水洗液;

(3)将步骤(2)收集到的水洗液以0.5BV/h的流速上样,使用氢型001×7树脂进行离子吸附,离子交换柱高径比为13:1,上样后用超纯水冲洗4BV,随后以0.5BV/h的流速用2mol/L氨水洗脱,根据茚三酮显色反应,收集目标洗脱液,获得含L-草铵膦的流出液;

(4)将步骤(3)L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重,加入混合溶剂和聚丙烯酰胺,加热使L-草铵膦溶解,在0℃条件下缓慢搅拌12小时使得L-草铵膦结晶析出后,将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥,获得L-草铵膦晶体;所述混合溶剂是水和丙酮以体积比1:9的混合,所述混合溶剂体积用量以聚丙烯酰胺重量计为100-1000ml/g,所述聚丙烯酰胺与恒重的L-草铵膦质量比为20-25:1。

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