本发明涉及生物
技术领域：
，具体而言，涉及一种金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组、其lamp检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)属于微球菌科葡萄球菌属，是一种革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界，如空气、水、人和动物的排泄物中，是人类化脓性感染和细菌性中毒中最常见的病原体之一，可引起局部化脓性感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至引起败血症、脓毒症等全身感染。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占全球感染的第二位，所以金黄色葡萄球菌所引起的疾病已成为全球性的公共卫生问题，严重危害人类安全和健康。而对于金黄色葡萄球菌的感染的快速检验，是指导临床感染治疗用药的关键。目前对于金黄色葡萄球菌包括耐药菌的检测方法主要是微生物培养及生化鉴定、免疫检测和各种pcr检测等。微生物培养及生化鉴定培养方法是检验金黄色葡萄球菌的经典方法，存在需要专业的实验室，操作繁琐，检测时间长等缺点。目前，多采用pcr技术测到金黄色葡萄球菌，但因技术对模板的数量和质量都有较高的要求，需要热循环及凝胶电泳等设备，价格相对昂贵，很难做到现场快速测定。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组，其利用金黄色葡萄球菌的特定区域，进行lamp，能够快速、简便且精准地实现金黄色葡萄球菌的扩增。本发明的第二目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的lamp检测试剂盒，其利用上述lamp检测引物组进行lamp，能够有效缩短检测时间，提高金黄色葡萄球菌检测的准确率。本发明的第三目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法，其利用上述金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组或其lamp检测试剂盒进行金黄色葡萄球菌的快速检测，其具有灵敏度高，特异性好的优点。本发明是这样实现的：一种金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组，其包括有外引物对和内引物对，外引物对包括序列如seqidno.1所示的上游引物以及序列seqidno.2所示的下游引物，内引物对包括序列如seqidno.3的上游引物以及序列如seqidno.4所示的下游引物。根据上述的lamp检测引物组在扩增或检测金黄色葡萄球菌中的应用。一种金黄色葡萄球菌的lamp检测试剂盒，其包括有如上述金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组。一种金黄色葡萄球菌的检测方法，其包括以下步骤：利用外引物对、内引物对和/或环引物对在lamp反应体系下，扩增目的基因；外引物对包括序列如seqidno.1所示的上游引物以及序列seqidno.2所示的下游引物，内引物对包括序列如seqidno.3的上游引物以及序列如seqidno.4所示的下游引物；环引物对包括序列如seqidno.5所示的上游引物以及序列如seqidno.6所示的下游引物。本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供一种金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组，其包括有外引物对和内引物对，其针对金黄色葡萄球菌上的特定区域，利用lamp技术能够扩增金黄色葡萄球菌上的靶基因，实现金黄色葡萄球菌的快速检测，同时，提升金黄色葡萄球菌检测结果的准确率。此外，本发明还提供一种包括该lamp检测引物组的金黄色葡萄球菌的lamp检测试剂盒以及其检测方法，其能够实现金黄色葡萄球菌的快速检测，具有灵敏度高，特异性好的优点。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明第七实施例中的不同硫酸镁浓度下的lamp反应颜色变化图；图2为本发明第七实施例中的不同硫酸镁浓度下的lamp反应电泳图(其中，m:markerdl2000；c:阴性对照；1:mgso4浓度2mm；2:3mm；3:4mm；4:5mm；5:6mm；6:7mm；7:8mm)；图3为本发明第八实施例中的lamp特异性实验结果图(其中，m:markerdl2000；c:阴性对照；1:金黄色葡萄球菌atcc29213；2:金黄色葡萄球菌atcc25923；3:金黄色葡萄球菌atcc43300；4:人葡萄球菌；5:腐生葡萄球菌；6:肺炎链球菌；7:表面葡萄球菌；8:铜绿假单胞菌；9:粪肠球菌)；图4为本发明第九实施例中金黄色葡萄球菌atcc29213灵敏度实验(1:1ng/μl；2:100pg/μl；3:10pg/μl；4:1pg/μl；5:100fg/μl；6:10fg/μl；7:1fg/μl)；图5为为本发明第九实施例中金黄色葡萄球菌atcc29213灵敏度实验电泳图(m:markerdl2000；c:阴性对照；1:1ng/μl；2:100pg/μl；3:10pg/μl；4:1pg/μl；5:100fg/μl；6:10fg/μl；7:1fg/μl)；图6为本发明第九实施例中金黄色葡萄球菌atcc25923灵敏度实验(1:1ng/μl；2:100pg/μl；3:10pg/μl；4:1pg/μl；5:100fg/μl；6:10fg/μl；7:1fg/μl)；图7为本发明第九实施例中金黄色葡萄球菌atcc25923灵敏度实验电泳图(m:markerdl2000；c:阴性对照；1:1ng/μl；2:100pg/μl；3:10pg/μl；4:1pg/μl；5:100fg/μl；6:10fg/μl；7:1fg/μl)。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的一种金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组、其lamp检测试剂盒及其检测方法进行具体说明。lamp，loop-mediatedisothermalamplification，又称环介导等温扩增技术。lamp法的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型dna聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，反应能产生大量的扩增产物，即焦磷酸镁白色沉淀，通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。本发明实施例采用环介导等温扩增(lamp)技术，并针对金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)设计了lamp检测引物组。本发明实施例提供的一种金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组，其包括有外引物对和内引物对，外引物对包括序列如seqidno.1所示的上游引物以及序列seqidno.2所示的下游引物，内引物对包括序列如seqidno.3的上游引物以及序列如seqidno.4所示的下游引物。进一步地，在本发明的一些实施例中，金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组还可以包括有环引物对，环引物对包括序列如seqidno.5所示的上游引物以及序列如seqidno.6所示的下游引物。环引物对可以在外引物对以及内引物对的基础上增加lamp扩增反应的速率，有效提高目的基因的扩增效率。本发明实施例提供上述金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组在扩增或检测金黄色葡萄球菌中的应用。具体地，其包括将上述金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组进行pcr反应或lamp反应以扩增或检测金黄色葡萄球菌。本发明实施例还提供一种金黄色葡萄球菌的lamp检测试剂盒，其包括有上述金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组。进一步地，在本发明的一些实施例中，lamp检测试剂盒包括有以下一种或多种成分：bstdna聚合酶、10×反应缓冲液、染料、dntps、标准阳性模板以及阴性对照。进一步地，在本发明的一些实施例中，10×反应缓冲液包括有以下一种或多种成分：10×buffer缓冲液、甜菜碱、dntps以及硫酸镁。其中，10×buffer缓冲液可以包括有200mmtris-hcl、ph8.8、100mm(nh4)2so4、500mmkcl、20mmmgso4以及0.1％tritonx-100；染料为浓度3mm的羟基萘酚蓝染料hnb；标准阳性模板为金黄色葡萄球菌标准菌株基因组dna；阴性对照为灭菌超纯水。此外，本发明实施例还提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法，其包括有以下步骤：利用外引物对和内引物对在lamp反应体系下，扩增目的基因；外引物对包括序列如seqidno.1所示的上游引物nuc-f3以及序列seqidno.2所示的下游引物nuc-b3；内引物对包括序列如seqidno.3的上游引物nuc-fip以及序列如seqidno.4所示的下游引物nuc-bip；进一步地，在本发明的一些实施例中，还包括使用环引物对在lamp反应体系下，扩增目的基因；环引物对包括序列如seqidno.5所示的上游引物以及序列如seqidno.6所示的下游引物。进一步地，在本发明的一些实施例中，在上述lamp反应体系中，外引物与内引物的摩尔比为1：(4～5)；进一步地，外引物与环引物的摩尔比为1：(2～3)。该摩尔比能够增加目的基因在lamp扩增反应的速率和稳定性。进一步地，在本发明的一些实施例中，在上述lamp反应体系中，lamp的反应温度为60℃～67℃，优选地，反应温度为65℃。在该反应温度下，上述金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组能够高效、快速地扩增目的基因，即在该反应温度下，能够得到一个更加清晰的扩增结果或实验结果。lamp扩增反应：首先，配制lamp反应体系：bstdna聚合酶、10×buffer缓冲液、染料、dntps、甜菜碱、镁离子、金黄色葡萄球菌引物组、以及待测样品的基因组dna，用灭菌超纯水补至25μl，同时设置阳性对照和阴性对照，将配制好的溶液放置于反应管或检测管中，混匀后置于60℃～67℃温度下反应30min，并于80℃中断反应。然后，将上述反应管置于比色卡中，根据颜色变化来判断，检测结果呈蓝色，检测结果判定为阳性，即检测样品中含有金黄色葡萄球菌；若检测结果呈紫色，检测结果判定为阴性，即检测样品中不含有金黄色葡萄球菌。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。第一实施例本实施例提供一种金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组，其包括有外引物对和内引物对。外引物对包括有上游引物nuc-f3和下游引物nuc-b3，序列如下:nuc-f3:5’-tcgagtttgacaaaggtca-3’；nuc-b3:5’-gttgtcttcgctccaaat-3’；内引物对包括有上游引物nuc-fip和下游引物nuc-bip，序列如下:nuc-fip:5’-tgacgaactaaagcttcgtttacc-ctgataaatatggacgtggc-3’；nuc-bip:5-ggcttggctaaagttgcttatgt-tttttcgcttgtgcttcac-3’；进一步地，在本实施例中，lamp检测引物组还包括环引物对。环引物对包括有上游引物nuc-lf和下游引物nuc-lb，序列如下:nuc-lf:5’-ccatcagcataaatatacgct-3’；nuc-lb:5’-cctaacaatacacatgaacaac-3’。第二实施例本实施例提供一种金黄色葡萄球菌的lamp检测试剂盒。具体地，lamp检测试剂盒包括有反应预混液和检测管。反应预混液包括有bstdna聚合酶8u、10×buffer缓冲液2.5μl(200mmtris-hcl，ph8.8，100mm(nh4)2so4，500mmkcl，20mmmgso4，0.1％tritonx-100)、hnb染料1μl、dntps1.6mm、甜菜碱0.8m、硫酸镁6mm、模板dna1μl、以及第一实施例提供的金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组，在上述反应预混液中加入灭菌超纯水制备成25μl检测溶液放入检测管中。第三实施例本实施例提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法。该检测方法包括以下步骤：利用第一实施例提供的外引物对、内引物对和环引物对在lamp体系下，扩增目的基因。具体如下：首先，提取待测样品的dna：取待测样品1ml进行12000rpm离心3min，并取沉淀，向沉淀中加入50～75μl无菌水重悬，然后放置95℃～100℃中保温10min，冷却后12000rpm离心1min，取上清液，放置于4℃保存备用。然后，利用第一实施例提供的检测引物组进行lamp扩增，在lamp反应体系中，外引物和内引物的摩尔比为1：4；外引物与环引物的摩尔比为1：2。lamp反应体系中包括有：bstdna聚合酶8u、10×buffer缓冲液2.5μl(200mmtris-hcl，ph8.8，100mm(nh4)2so4，500mmkcl，20mmmgso4，0.1％tritonx-100)、hnb染料120μm、dntps1.6mm、甜菜碱0.8m、硫酸镁6mm、模板dna1μl、以及第一实施例提供的金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组(外引物对的上游引物0.4μm和下游引物0.4μm，内引物对的上游引物1.6μm和下游引物1.6μm，环引物对的上游引物0.8μm和下游引物0.8μm)，在上述反应预混液中加入灭菌超纯水制备成25μl检测溶液放入检测管中。取1μl上述含有待测样品的dna的上清液，加入至检测管中，65℃反应30min。最后，将检测管在比色卡背景下观察反应液颜色，蓝色则说明样品中含有金黄色葡萄球菌，紫色则说明样品中没有金黄色葡萄球菌。第四实施例本实施例提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法。该检测方法与第三实施例提供的检测方法大致相同，区别在于：在lamp反应体系中，第一实施例提供的lamp检测引物组的外引物和内引物的摩尔比为1:5；外引物与环引物的摩尔比为1:2，即外引物0.4μm、内引物2.0μm以及环引物0.8μm；lamp反应温度为66℃；镁离子(硫酸镁)的浓度为5mm。第五实施例本实施例提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法。该检测方法与第三实施例提供的检测方法大致相同，区别在于：在lamp反应体系中，第一实施例提供的lamp检测引物组的外引物和内引物的摩尔比为1:4；外引物与环引物的摩尔比为1:3，即外引物0.4μm、内引物1.6μm以及环引物1.2μm。lamp反应温度为65℃；镁离子(硫酸镁)的浓度为6mm。第六实施例验证第三～四实施例提供的金黄色葡萄球菌的lamp检测方法中，lamp检测引物组的外引物、内引物以及环引物的最优摩尔比。1.实验方法采用第三～五实施例提供的的金黄色葡萄球菌的lamp检测方法检测提取的含金黄色葡萄球菌的待测样品dna。具体地，在25μl的lamp体系中，具体成分为10×buffer2.5μl，dntps(10mm)4μl(终浓度1.6mm)，甜菜碱(5m)4μl(终浓度0.8m)，mgso4(50mm)3μl(终浓度6mm)，bstdna聚合酶1μl，hnb染料(3mm)1μl(终浓度120μm)，dna模板1μl，depc水补足体系。外设置阴性对照，用1μldepc水代替dna模板。设置15组引物比例，其外引物：环引物：内引物比例分别为1:1:2、1:1:3、1:1:4、1:1:5、1:1:6、1:2:2、1:2:3、1:2:4、1:2:5、1:2:6、1:3:2、1:3:3、1:3:4、1:3:5、1:3:6，具体请参照附图1。外引物浓度为0.4μm，环引物和内引物的浓度随比例相应变化。2.实验结果表1第六实施例的不同引物比例的lamp反应结果引物比例1:1:21:1:31:1:41:1:51:1:6lamp结果-----引物比例1:2:21:2:31:2:41:2:51:2:6lamp结果--++-引物比例1:3:21:3:31:3:41:3:51:3:6lamp结果--++-备注：(“-”表示反应成阴性，“+”表示反应呈阳性)由表1可知，当引物比例为1:2:4、1:2:5和1:3:4、1:3:5时，能够产生lamp扩增反应，其他引物比例均没有发生反应，说明当外引物：环引物：内引物为1：(1～3)：(2～6)时，能够进行lamp反应。第七实施例验证第三～五实施例提供的金黄色葡萄球菌的lamp检测方法中，硫酸镁的最优浓度。mgso4对于扩增反应的进行有重要作用，太高或太低的浓度可能都会影响扩增反应进行。在使用hnb羟基萘酚蓝显色指示的lamp体系中，mgso4溶液浓度越大，反应液的颜色将会越偏紫红色，浓度过低时，反应液在反应前即呈蓝色，失去反应指示作用。同时dntps的浓度也会影响反应液的颜色，dntps的浓度越高，反应液颜色越偏蓝，本lamp体系保持dntps的浓度不变，对mgso4的浓度进行了优化。此处所指优化的mgso4溶液浓度不包括10×buffer中的mgso4。1.实验方法采用第三、四实施例提供的金黄色葡萄球菌的lamp检测方法检测。具体地，在25μl的lamp体系中，具体成分为10×buffer2.5μl，dntps(10mm)4μl(终浓度1.6mm)，甜菜碱(5m)4μl(终浓度0.8m)，pirmermix1μl，bstdna聚合酶1μl，hnb染料(3mm)1μl(终浓度120μm)，dna模板1μl。mgso4(50mm)终浓度分别为2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm(如表2)，最后加入depc水补足体系。另外设置阴性对照，用1μldepc水代替dna模板，mgso4浓度设为6mm。表2lamp反应不同的硫酸镁浓度观察并记录反应前后反应液的颜色变化，反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。取5μl的lamp产物与2μl10×loadingbuffer混合均匀后，上样。分析反应结果确定硫酸镁最佳浓度，实验结果如附图2所示。2.实验结果在反应前，加入了hnb染料的反应液颜色因为硫酸镁的浓度变化而有所不同，随着硫酸镁浓度从2mm增加到8mm,颜色从蓝色逐渐偏向紫红色(由于要求附图不能有彩色，这里颜色变化无法在图中明显展现，采取文字方法说明)。反应后，根据电泳图，请参照附图2，当硫酸镁浓度为2mm和3mm时，硫酸镁浓度浓度过低而没有发生lamp扩增反应，电泳结果没有出现lamp反应的典型梯状条带。当硫酸镁浓度达到4mm之后，电泳开始出现梯形条带，并且条带随浓度增大而越来越清晰，说明硫酸镁浓度在5～7mm时能够实现稳定高效的lamp反应。但硫酸镁浓度越高，hnb染料的变色效应则会变弱(图1)，因此综合lamp反应和显色反应的灵敏程度，因此，将硫酸镁浓度设为5mm～6mm，既能保证lamp反应高效进行又有明显的颜色差距，又利于使用肉眼直接判断lamp反应的发生。第八实施例验证第一实施例中金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组的特异性。1.实验方法本实验选取金黄色葡萄球菌(atcc29213)，金黄色葡萄球菌(atcc25923)，金黄色葡萄球菌(atcc43300)，肺炎链球菌(atcc49619)，腐生葡萄球菌(atcc49453)，表皮葡萄球菌(atcc49134)，人葡萄球菌(atcc27844)，屎肠球菌(atcc19434)，粪肠球菌(atcc19433)，大肠埃希氏杆菌(atcc35150)，铜绿假单胞菌(atcc15442)所提取的dna用于lamp检测。采用第三～四实施例提供的检测方法检测。具体为，在25μl的lamp体系中，具体成分为10×buffer2.5μl，dntps(10mm)4μl(终浓度1.6mm)，甜菜碱(5m)4μl(终浓度0.8m)，mgso4(50mm)3μl(终浓度6mm)，pirmermix1μl，bstdna聚合酶1μl，hnb染料(3mm)1μl(终浓度120μm)，dna模板1μl，最后加入depc水补足体系。外设置阴性对照，用1μldepc水代替dna模板。根据添加的hnb染料为依据，发生lamp反应则溶液变为蓝色，未反应溶液和阴性对照为紫色不变。反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果请参照附图3，电泳图中发生lamp反应的样品呈现梯形条带，未反应样品没有梯形条带。2.实验结果由图3可知，金黄色葡萄球菌(atcc29213)，金黄色葡萄球菌(atcc25923)，金黄色葡萄球菌(atcc43300)dna出现了lamp扩增反应，电泳结果出现明显的梯状电泳带。肺炎链球菌(atcc49619)，腐生葡萄球菌(atcc49453)，表皮葡萄球菌(atcc49134)，人葡萄球菌(atcc27844)，粪肠球菌(atcc19433)，铜绿假单胞菌(atcc15442)所提取的dna并没有发生lamp反应。说明第一实施例提供的lamp检测引物组具有特异性。第九实施例验证第一实施例中金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组或第二实施例提供的lamp检测试剂盒的灵敏性。1.实验方法使用试剂盒提取金黄色葡萄球菌atcc29213和atcc25923的dna，测定dna溶液浓度并稀释下列浓度：1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl。采用第三或四实施提供的检测方法进行lamp检测。具体地，在lamp体系中，具体成分为10×buffer2.5μl，dntps(10mm)4μl(终浓度1.6mm)，甜菜碱(5m)4μl(终浓度0.8m)，mgso4(50mm)3μl(终浓度6mm)，pirmermix1μl，bstdna聚合酶1μl，hnb染料(3mm)1μl(终浓度120μm)，dna模板1μl，最后加入depc水补足体系。外设置阴性对照，用1μldepc水代替dna模板。lamp实验后，将上述lamp反应溶液进行电泳实验。金黄色葡萄球菌atcc29213的灵敏度实验如图4所示，其电泳实验如图5所示。金黄色葡萄球菌atcc25923的灵敏度实验如图6所示，其电泳实验如图7所示。根据添加的hnb染料为依据，发生lamp反应则溶液变为蓝色，未反应溶液和阴性对照为紫色不变。电泳胶图中发生lamp反应的样品呈现梯形条带，未反应样品没有梯形条带。2.实验结果由反应液颜色变化和电泳图显示，金黄色葡萄球菌atcc29213和atcc25923均在dna添加量为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl时发生扩增反应，反应后颜色由紫变蓝，电泳胶图中出现梯形条带。第三～四实施例提供的lamp检测方法中lamp体系对于金黄色葡萄球菌的dna检出限为1pg/μl。综上所述，本发明实施例提供一种金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组，其包括有一对外引物和一对内引物，其针对金黄色葡萄球菌上的特定区域，利用lamp技术能够扩增金黄色葡萄球菌上的靶基因，实现金黄色葡萄球菌的快速检测，同时，提升金黄色葡萄球菌检测结果的准确率。此外，本发明还提供一种包括该lamp检测引物组的金黄色葡萄球菌的lamp检测试剂盒以及其检测方法，其能够实现金黄色葡萄球菌的快速检测，具有灵敏度高，特异性好的优点。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>华南理工大学和广州白云山制药集团股份公司白云山制药总厂<120>一种金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组合物、其lamp检测试剂盒及其检测方法<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1tcgagtttgacaaaggtca19<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2gttgtcttcgctccaaat18<210>3<211>44<212>dna<213>人工序列<400>3tgacgaactaaagcttcgtttaccctgataaatatggacgtggc44<210>4<211>42<212>dna<213>人工序列<400>4ggcttggctaaagttgcttatgttttttcgcttgtgcttcac42<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5ccatcagcataaatatacgct21<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6cctaacaatacacatgaacaac22当前第1页12