本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，本发明涉及一种胶质瘤mgmt基因甲基化检测引物及其检测方法。。
技术背景
胶质瘤是起源于神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤。恶性胶质瘤约占原发性恶性脑肿瘤的70％，年发病率约为5-7/10万人。
mgmt全称o6-甲基鸟嘌呤dna甲基转移酶(o6-methylguanine-dnamethyltransferase)，是唯一能将o6鸟嘌呤复合物从dna上移除的蛋白，可保护染色体免受烷化剂的致突变、致癌和细胞毒作用的损伤。mgmt主要通过不可逆地将烷化基团从o6-mg转移到mgmt蛋白145位的半胱氨酸残基上而保护细胞免受烷化剂的损伤。在这一过程中，mgmt既作为甲基转移酶，又作为甲基受体蛋白，单独完成转移反应。mgmt蛋白在细胞内的修复作用能力，主要取决于其在细胞内的含量及合成速率。
mgmt基因启动子甲基化状态与mgmt蛋白的表达关系密切，启动子甲基化是mgmt基因最常见的异常，多发生于mgmt基因启动子cpg岛，导致该基因转录停止，蛋白表达减少。通过研究肿瘤细胞株，发现正常表达mgmt的细胞株，其mgmt基因启动子区均未发生甲基化，而相反，mgmt表达水平下调的细胞株，其mgmt基因启动子区发生了过甲基化。通过检查239例肿瘤组织样本，发现mgmt基因启动子区甲基化与mgmt蛋白表达水平下调符合率高达83％，证明了mgmt基因启动子甲基化是细胞内缺乏mgmt蛋白的主要原因。
mgmt基因启动子甲基化程度越高，预后越差，其对肿瘤病人的预后和生存期的预示作用较肿瘤的分级、临床、年龄等其他特征更有效。
目前mgmt基因启动子甲基化检测常用方法有甲基化特异性pcr(msp)、亚硫酸氢盐测序pcr(bsp)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(ms-hrm)、荧光定量法，基因芯片法等。上述这些方法往往存在着操作繁琐，检测周期长，假阳性高等不足之处，不适于临床诊断。
因此临床上迫切需求一种具有检测时间迅速，假阳性率低且测序准确性高的检测引物和检测方法。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题就是，发明人提供一种一种胶质瘤mgmt基因甲基化检测引物，其中，所述引物包括重亚硫酸盐转化后mgmt基因启动子扩增引物对，分别为seqidno.1和seqidno.2所示，和重亚硫酸盐转化后mgmt基因启动子的测序引物，为seqidno.3所示。
本发明的第一个目的是提供一组特异性扩增mgmt启动子区的引物，其特征在于：
用于扩增和检测mgmt基因启动子区的核苷酸扩增引物如下：
正向引物：5’-ttcgggttaggcgtataggg-3’，如seqidno:1所示；
反向引物：5’-cgacccaaacactcaccaaa-3’，如seqidno:2所示；
测序引物：5’-gtttttagaacgttttgcgttt-3’，如seqidno:3所示；
扩增序列为：seqidno:5所示的mgmt启动子区序列(部分，重亚硫酸盐转化后)中第80位到473位核苷酸；
其中所述mgmt启动子区序列(部分，重亚硫酸盐转化后)如seqidno:5所示，该部分对应的mgmt启动子区序列(部分，重亚硫酸盐转化前)如seqidno:4所示。
发明人提供了一种人类组织样本中mgmt基因甲基化检测方法，其中，使用权利要求1所述的扩增引物对重亚硫酸盐转化后人胶质瘤mgmt基因启动子进行扩增，并使用所述测序引物对所检测的基因区域4个cpg位点的甲基化比例进行检测，通过测甲基化率测定mgmt基因在组织中表达水平。
进一步地，在上述的人类组织样本中mgmt基因甲基化检测方法中，包括步骤：组织样本采集、液氮保存、基因组dna提取、重亚硫酸盐转化，mgmt启动子区pcr扩增反应，焦磷酸测序反应和结果分析。
优选地，上述方法的具体包括步骤：
(1)收集胶质瘤患者肿瘤组织样本；
(2)组织采集后快速液氮冷冻保存；
(3)用有机溶剂抽提方法提取胶质瘤组织样本中基因组dna，经乙醇洗涤，弃上清后干燥、溶解并测定浓度；
(4)基因组dna经过重亚硫酸盐转化，其中未甲基化的胞嘧啶(c)转变为尿嘧啶(u，pcr扩增后转变为t)，而甲基化的胞嘧啶(c)不变；
(5)用权利要求1所述的引物进行pcr扩增反应，通过焦磷酸测序反应检测目标区域cpg岛甲基化水平。
所述有机溶剂抽提法及重亚硫酸盐转化方法为本领域的常规技术方法。
本发明的第三个目的是提供一种用于胶质瘤mgmt基因甲基化诊断的试剂盒，其特征在于：包含：
(1)组织样本中基因组dna提取试剂；
(2)基因组dna重亚硫酸盐转化及分离纯化试剂；
(3)扩增mgmt基因启动子目标区域试剂及正向和反向扩增引物seqid.no1和seqidno.2以及灭菌水；
(4)纯化及分离单链dna的试剂及测序英语seqidno.3
(5)检测mgmt基因启动子区甲基化的试剂；
(6)表明焦磷酸测序所用的分析序列的说明书。
根据市面上现有的提取试剂盒，发明人提供了一个甲基化的商用组合试剂盒。
具体包含：
(1)组织样本中基因组dna提取试剂，具体包括：proteinasek、缓冲液gb、无水乙醇、缓冲液gd、漂洗液pw、洗脱液te；
(2)基因组dna重亚硫酸盐转化及分离纯化试剂，具体包括bisulfitemix、rnasefreewater、dnaprotectbuffer、bl缓冲液、bw缓冲液、bd缓冲液、eb洗脱液、carrierdna；
(3)扩增mgmt基因启动子目标区域试剂：2×mastermix、10×concentrate、3um正向和反向扩增引物(如seqidno1、seqidno2所示)以及灭菌水；
(4)纯化及分离单链dna的试剂：sshpbeads(streptavidinsepharosehighperformancebeads)、bindingbuffer、测序引物(如seqidno3所示)、annealingbuffer、70％(v/v)乙醇溶液；
(5)检测mgmt基因启动子区甲基化的试剂，具体包括：酶e(固体粉末)、底物s(固体粉末)、四种dntp、rnasefreewater；
(6)表明焦磷酸测序所用的分析序列的说明书。
上述未公布具体成分的试剂为市场上的商业试剂，见具体实施例。
本发明进一步提供了上述胶质瘤mgmt基因甲基化检测引物在检测mgmt基因启动子甲基化中的应用。
优选地，所述样品为生物样品，优选所述样品为组织样品，和更优选所述样品选自活组织检查样品。
本发明的方法有较高的重复稳定性，不需重复实验。利用本方法提供的mgmt基因启动子区扩增及甲基化检测引物，构建胶质瘤组织样本mgmt基因甲基化检测试剂盒，可以准确可靠的预测胶质瘤患者替莫唑胺治疗效果及预后，为后期制定个体化的化疗及用药方案提供实验依据。
具体实施方式
下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
本文所涉及细胞生物学及分子生物学中的相关术语的定义参看如下著作：
余龙等译的基因viii，科学出版社出版(2005)，isbn:978-7-03-014597-0；
张瑾峰等译的细胞与分子生物学，中信出版社出版(2004)，isbn:978-7-50-860075-8；
王镜岩等编的生物化学，高等教育出版社出版(2002)，isbn:978-7-04-011088-3；
kendrew,j.等人(编),theencyclopediaofmolecularbiology,blackwellscienceltd.出版(1994),isbn0-632-02182-9；
meyers,r.a.(编),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,vchpublishers,inc.出版(1995),isbn1-56081-5698。
本文所涉及全部科技术语均具有所属领域普通科技人员理解的意义，有特殊标注说明的科技术语不在此列。
实施例1：
一种胶质瘤患者组织中mgmt基因甲基化检测方法：
1.样本收集与保存
手术取材时，组织取材在组织离体30min内完成，取材动作尽量快速。然后将组织切成小块，放入灭菌的冻存管中，置于液氮冻存。
2.基因组dna提取(选用qiagen，catno./id:69504)
切取不多于30mg的胶质瘤病人瘤体组织材料，放入装有200ul裂解液的离心管中，涡旋振荡15秒。加入20ulproteinasek(20mg/ml)溶液，涡旋混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。在56℃放置，直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
加入200ul缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。向上述吸附柱中加入500ul缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600ul漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。之后重复本步骤一次。将吸附柱放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
3.重亚硫酸盐转化基因组dna(qiagen，catno./id:59104)
加足量bisulfitemix，加800ulrna-free水到每个孔，充分溶解,200ulpcr管加入1ng-2ugdna，不要超过20ul体积，不够的话rna-free水补至20ul,依次加入bisulfitemix85ul，protectbuffer35ul，一共140ul.
pcr上机进行重亚硫酸盐转化，步骤如下；
下机后短暂离心，迅速转移到1.5ml离心管
加560ul新鲜制备的blbuffer(含carrierrna)，涡旋混匀并短暂离心。
拿出epitect收集管，转移上述溶液到收集管。最高速离心1min，弃液体，管子放回收集柱。每管加入500ulbwbuffer，最高速离心1min，弃液体，管子放回收集柱。每管加入500ulbdbuffer(，室温孵育15min，最高速离心1min，弃液体，管子放回收集柱。每管加入500ulbwbuffer，最高速离心1min，弃液体，管子放回收集柱，洗两遍。收集柱放入新管，最高速离心1min。推荐步骤：收集柱放入新的1.5ml离心管中，56℃孵育5min加入2ulebbuffer到收集柱膜中央，12000rpm离心1min收集洗脱液。重亚硫酸盐转化后模板dna制备完毕。
4.实时定量pcr(qiagen，catno./id:971061)
反应体系：(25ul，按顺序加入)
2×mastermix12.5μl
10×concentrate2.5μl
正向引物(seqidno:1)0.5μl
反向引物(seqidno:2)0.5μl
ddh2o4μl
重亚硫酸盐转化后模板dna5μl
其中，用于扩增mgmt基因启动子区的核苷酸扩增引物如下：
正向引物：5’-ttcgggttaggcgtataggg-3’，如seqidno:1所示；
反向引物：5’-cgacccaaacactcaccaaa-3’，如seqidno:2所示；
扩增反应条件：95℃热激15分钟；然后进行如下循环：95℃20秒，53℃30秒，72℃20秒，共42个循环；72℃5分钟。全程约90分钟。
5.固定pcr产物并分析dna单链(qiagen，catno./id:971061)
加入之前轻柔摇匀sshpbeads
配置预混液：bindingbuffer40ul；beads2ul；超纯水33ul；
分配好后加pcr产物5ul，1400rpm震荡10分钟
稀释测序引物：测序引物seqprimer0.8ul加入annealingbuffer24.2ul
用于焦磷酸测序反应的测序引物如下：
测序引物：5’-gtttttagaacgttttgcgttt-3’，如seqidno:5所示；
q24plate每个孔加入上述稀释液25ul
真空负压工作站分离单链dna(qiagen，catno./id:9001518)：
打开真空梳子开关，插入pcrplate，吸取beads保持15秒
梳子转移到40ml70％乙醇溶液，5秒
梳子转移到40ml变性溶液中，保持5秒
梳子转移到50ml洗液中，保持10秒
梳子竖起来90°，保持5秒，沥干水分
梳子放到q24plate，关闭真空
左右摇晃，使珠子落到q24孔中
梳子转移到超纯水池中，10秒
打开真空，用水冲洗梳子上的probe(70ml水)
90°沥干5秒
关闭真空，梳子回位，关闭pump电源。
6.焦磷酸测序(qiagen，catno./id:9001514)
预热测序仪加热块
样本在q24plate中，80℃2min室温冷却5min。
配置pyromarkq24试剂盒
酶和底物现用现配，加620ul水(试剂盒提供)分别到酶瓶和底物瓶，溶解。9孔试剂盒(标签朝向自己)，按照机器设置分别加入酶，底物，a，g，t，c。打开机器进行甲基化测序，选择之前设置的程序，按run。全程30min。
7，判断结果：
每个位点的甲基化率可直接从机器上读出，以4个cpg位点甲基化率平均值为mgmt基因启动子区甲基化水平的检测值。本方法将甲基化水平小于5％的样本，判定为非甲基化；5％以上甲基化水平样本，判定为甲基化。
所述实验步骤中未说明细节请参照试剂盒说明书。
实施例2：
用于胶质瘤mgmt基因甲基化诊断的试剂盒，包含：
(1)组织样本中基因组dna提取试剂，具体包括：proteinasek、缓冲液gb、无水乙醇、缓冲液gd、漂洗液pw、洗脱液te；
(2)基因组dna重亚硫酸盐转化及分离纯化试剂，具体包括bisulfitemix、rnasefreewater、dnaprotectbuffer、bl缓冲液、bw缓冲液、bd缓冲液、eb洗脱液、carrierdna；
(3)扩增mgmt基因启动子目标区域试剂：2×mastermix、10×concentrate、3um正向和反向扩增引物(如seqno1、seqno2所示)以及灭菌水；
(4)纯化及分离单链dna的试剂：sshpbeads(streptavidinsepharosehighperformancebeads)、bindingbuffer、测序引物(如seqno3所示)、annealingbuffer、70％(v/v)乙醇溶液；
(5)检测mgmt基因启动子区甲基化的试剂，具体包括：酶e(固体粉末)、底物s(固体粉末)、四种dntp、rnasefreewater；
(6)表明焦磷酸测序所用的分析序列的说明书。
所述成分为实施例1中所述商用试剂盒成分。
实施例3：
本试剂盒样本扩增效率评估
方法：使用试剂盒扩增引物正向和反向扩增引物(如seqno1、seqno2所示)对重亚硫酸盐处理后样品进行扩增，扩增结果进行电泳检测。
本试剂盒扩增出的mgmt启动子区片段长度符合预期的394bp，条带清晰，扩增效率较为理想，完全符合后续甲基化检测所需dna含量。
实施例4；
本试剂盒测定甲基化的准确性、精密度评估
选取已知甲基化比例分别为0％，10％，35％，50％，90％的(编号1-5)标准临床样本，本试剂盒进行mgmt甲基化测试，统计每个检测位点甲基化比例，并与理论值进行比较。
检测实验过程和条件均同实施例1所述；实验结束后，记录测序仪所统计4个甲基化位点c碱基的百分比，结果如下：
样本1的四个甲基化位点检测的甲基化率分别为2％，2％，3％，3％，该标准样本甲基化率为0％。
样本2显示样本的四个甲基化位点检测的甲基化率分别为12％，13％，14％，13％，该标准样本甲基化率为10％。
样本3显示样本的四个甲基化位点检测的甲基化率分别为34％，37％，37％，38％，该标准样本甲基化率为35％。
样本4显示样本的四个甲基化位点检测的甲基化率分别为50％，52％，54％，51％，该标准样本甲基化率为50％。
样本5显示样本的四个甲基化位点检测的甲基化率分别为77％，88％，91％，90％，该标准样本甲基化率为90％。
上述结果显示，每种样本的甲基化比例检测值与理论值接近，故检测准确性较高。线性拟合相关系数大于0.99，说明甲基化检测值与理论值呈现较好的线性关系。
基于此，本试剂盒的测序引物和检测方法可应用于mgmt基因甲基化检测。
实施例5：
利用实施例2的试剂盒检测临床样本：
收集2016-2017年12月，在相关医院诊治的94例胶质瘤患者肿瘤组织标本。其中男性65例，女性39例。年龄6-73岁。病理分级(who标准)i级6例，ii级28例，iii级35例，iv级25例。手术取材时，组织取材在组织离体30min内完成，取材动作尽量快速。之后将组织切成小块，放入灭菌的冻存管中，置于液氮冻存。
按实施例1所述方法提取肿瘤组织样本dna，并用焦磷酸法检测mgmt基因启动子甲基化水平。每份样品重复3次，并同时做阳性，阴性，空白对照。根据评分结果进行判断。
阳性和阴性对照结果证明了本检测方法准确。病人样本的甲基化检验结果显示，i级样本甲基化样本1例；ii样本甲基化9例；iii级样本甲基化20例；iv级样本甲基化20例。从甲基化样本所占比例上看，i-iv级样本的甲基化比例分别为平均16.7％；32.1％；57.1％和80.0％。可见，在越恶性胶质瘤患者，其肿瘤组织样本中mgmt基因启动子甲基化水平也越高。本结果证明本试剂盒所检测mgmt甲基化水平可作为预测胶质瘤病人的预后及制定个体化的化疗及用药方案的目的。
研究表明，对所述目标序列的特异扩增能有效避免假阳性。为此本试剂盒提供了一系列为焦磷酸测序特别优化的pcr试剂，确保高的特异性和可靠性。pcr试剂盒包含了一种独特的双阳离子平衡缓冲液(k+、nh4+)，在氨根离子和钾离子的共同作用下，能够增加引物退火的特异性。在较宽的退火温度和mg2+浓度范围内，这种新型缓冲液提供了严格的引物-退火条件。以上优化均有助于pcr反应生成高度特异的扩增子，避免假阳性的结果，因而相比之前的甲基化检测方案，本试剂盒更适合临床应用。
同时，本试剂盒还包含高度特异的聚合酶，具有快速高效扩增目标片段的特点。同时本方法扩增片段仅394bp，较市面上所用类似方法扩增的pcr片段要短，从而缩短了扩增时间，以及整个检测时间。
本发明所选用的焦磷酸测序法，其原理是基于酶与底物的级联反应的测定和定量分析序列的技术。其检测灵敏度远高于传统sanger测序。同时，其检测速度大大提高，检测成本有所下降。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，应当指出的是，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改造，这些都属于本发明的保护范围，因此，本发明专利的保护范围以所附权利要求为准。
序列表
<110>上海润达榕嘉生物科技有限公司
<120>一种mgmt启动子甲基化检测引物及其检测方法
<141>2018-06-07
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna/rna
<213>artificialsequence
<400>1
ttcgggttaggcgtataggg20
<210>2
<211>20
<212>dna/rna
<213>artificialsequence
<400>2
cgacccaaacactcaccaaa20
<210>3
<211>22
<212>dna/rna
<213>artificialsequence
<400>3
gtttttagaacgttttgcgttt22
<210>4
<211>750
<212>dna
<213>homosapiens
<400>4
gccatttggcaaactaaggcacagagcctcaggcggaagctgggaaggcgccgcccggct60
tgtaccggccgaagggccatccgggtcaggcgcacagggcagcggcgctgccggaggacc120
agggccggcgtgccggcgtccagcgaggatgcgcagactgcctcaggcccggcgccgccg180
cacagggcatgcgccgacccggtcgggcgggaacaccccgcccctcccgggctccgcccc240
agctccgcccccgcgcgccccggccccgcccccgcgcgctctcttgcttttctcaggtcc300
tcggctccgccccgctctagaccccgccccacgccgccatccccgtgcccctcggccccg360
cccccgcgccccggatatgctgggacagcccgcgcccctagaacgctttgcgtcccgacg420
cccgcaggtcctcgcggtgcgcaccgtttgcgacttggtgagtgtctgggtcgcctcgct480
cccggaagagtgcggagctctccctcgggacggtggcagcctcgagtggtcctgcaggcg540
ccctcacttcgccgtcgggtgtggggccgccctgacccccacccatcccgggcgagctcc600
aggtgcgccccaagtgcctcccaggtgttgcccagcctttccccgggcctggggttcctg660
gactaggctgcgctgcagtgactgtggactggcgtgtggcgggggtcgtggcagcccctg720
ccttacctctaggtgccagccccaggcccg750
<210>5
<211>750
<212>dna
<213>homosapiens
<400>5
gttatttggtaaattaaggtatagagttttaggcggaagttgggaaggcgtcgttcggtt60
tgtatcggtcgaagggttattcgggttaggcgtatagggtagcggcgttgtcggaggatt120
agggtcggcgtgtcggcgtttagcgaggatgcgtagattgttttaggttcggcgtcgtcg180
tatagggtatgcgtcgattcggtcgggcgggaatatttcgtttttttcgggtttcgtttt240
agtttcgttttcgcgcgtttcggtttcgttttcgcgcgtttttttgttttttttaggttt300
tcggtttcgtttcgttttagatttcgttttacgtcgttattttcgtgtttttcggtttcg360
ttttcgcgtttcggatatgttgggatagttcgcgtttttagaacgttttgcgtttcgacg420
ttcgtaggttttcgcggtgcgtatcgtttgcgatttggtgagtgtttgggtcgtttcgtt480
ttcggaagagtgcggagttttttttcgggacggtggtagtttcgagtggttttgtaggcg540
tttttatttcgtcgtcgggtgtggggtcgttttgatttttatttatttcgggcgagtttt600
aggtgcgttttaagtgttttttaggtgttgtttagttttttttcgggtttggggtttttg660
gattaggttgcgttgtagtgattgtggattggcgtgtggcgggggtcgtggtagtttttg720
ttttatttttaggtgttagttttaggttcg750