本发明涉及疾病的分子诊断，具体地说，涉及一种遗传性骨病的分子诊断方法及试剂盒。
背景技术：
：遗传性骨病是临床最为常见的出生缺陷之一，是一大类临床和遗传异质性较强的骨、软骨发育不良疾病，在我国前十大出生缺陷中就包括多指(趾)畸形(第2位)、马蹄内翻(第5位)、并指(趾)畸形(第7位)、肢体短缩(第9位)等遗传性骨病，严重影响患者生存质量，目前尚无有效的治疗方法。因此，对遗传性骨病遗传成因和分子机制的研究以及早期诊断、预防等的研究，对于降低我国出生缺陷率，提高遗传性骨病的诊治效率，具有重要的理论与实践意义。根据2015年“国际骨骼发育不良协会”最新版的评估标准，共有436种表型被纳入“遗传性骨病”，并按其分子遗传、生化以及影像学特点分为42组，已明确其中364个基因突变可导致遗传性骨病，但仍有约三分之一的遗传性骨病致病机制尚未明确。新的遗传性骨病相关致病基因的发现和鉴定是亟待解决的科学问题。由于遗传性骨病表型多样，涉及基因众多且复杂，导致遗传性骨病基因的异质性及每种综合征类型的遗传性骨病缺乏特异的临床表现、生化指标和影像学特征，导致临床上一直缺少一种对遗传性骨病进行明确诊断和分型的方法手段。建立可靠、有效的分子诊断方法，对提高临床遗传性骨病的确诊率、通过有效的临床遗传咨询和产前诊断进行遗传阻断、提高国民身体素质和人口质量具有重要的科学和社会意义。目前，临床实验室检测基因突变大多采用传统的sanger测序法，而如果对遗传性骨病相关的众多基因同时检测，不仅工作量巨大，而且导致检测效率低，更重要的是浪费珍贵的dna样本、明显增加基因诊断的检测成本，严重制约了其在临床分子诊断中的大规模应用。下一代测序(nextgenerationsequencing，ngs)也称高通量测序，与传统的sanger测序技术相比具有高通量等优势。目标基因高通量平行靶向测序技术(targetsequencing)是一种利用序列捕获技术将候选的特定目标基因区域dna进行捕捉并富集后进行靶向高通量测序的基因组分析方法，在最大限度地发挥下一代测序技术对疾病相关的已知致病基因作单管平行检测的同时，很大程度上又避免了全基因组测序和全外显子组测序产生的海量数据对下游生物信息学分析和解读造成的困难。而在实际的目标基因靶向测序技术中，还是需要克服探针制备、过程优化等众多关键环节的难题。在疾病的临床诊断上，对诊断方法的要求较高，必须具备高度的准确性、敏感性、特异性，且成本也是重要考虑因素之一。目前还未见具有实际临床应用意义的遗传性骨病诊断方法及相关试剂盒。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种遗传性骨病的分子诊断方法、试剂及试剂盒。本发明第一方面提供了一种遗传性骨病的分子诊断方法，所述的分子诊断方法是使用针对561个遗传性骨病相关基因的捕获探针，应用目标基因高通量平行靶向测序方法测定受试者的所述561个遗传性骨病相关基因的序列。优选地，所述的561个遗传性骨病相关基因包括以下59个基因。hand2gas1relacer1hoxd12osr1bmp5pappa2prrx1sox4bmp3fgf18dkk1thbs1sfrp2scxhoxa10rdh10col27a1lect1meox2lummef2cchadgli1matn1egfrnr2f2six2phospho1cytl1hmga2rargsatb2runx3amelxhs6st1tgfb3ltbp3foxi1sox11mmp14fras1dhrs3pdgframmp16crabp2trim45irx5gja5hoxa5gata3foxc2chst11hoxa2robo1prrx2rarbcited2优选地，所述的捕获探针对目标区域的覆盖率达到99.4％以上。本发明另一方面提供了一种遗传性骨病的分子诊断试剂，其包含针对561个遗传性骨病相关基因的捕获探针。优选地，所述的561个遗传性骨病相关基因包括以下59个基因。本发明再一方面提供了一种遗传性骨病的分子诊断试剂盒，其包含如上任一所述的分子诊断试剂。本发明选择与遗传性骨病相关的561个候选基因，设计并构建针对这些基因所有外显子及侧翼序列的文库，通过对目标基因进行捕获，利用高通量的深度测序技术结合生物信息学分析，建立了遗传性骨病的高通量平行靶向测序基因诊断方法。本发明的方法具备以下优势：1、通过以课题组前期收集的50例各类遗传性骨病患者为研究对象，探讨了本方法的检测敏感性与特异性，结果敏感性和特异性均达95％以上；2、传统的sanger测序费用为600元人民币/基因(上海标准)，如果本项目应用传统sanger测序进行突变分析将要耗资600元×561基因＝336,600元人民币；而如果对50例遗传性骨病患者进行分析，单纯传统sanger测序费用就达336,600元人民币×50＝16,830,000元人民币。相反，应用本发明的方法可急剧降低561个已知遗传性骨病致病基因突变分析的费用，可以降低到每位患者2500元。本发明的方法可应用于以下领域：1、基于本发明的方法，可开发相应的检测试剂盒，用于遗传性骨病的临床诊断；2、利用本发明的方法鉴定各类遗传性骨病患者的致病基因，初步分析各种遗传性骨病的基因突变谱，将为遗传性骨病的早期精准诊断、精准治疗、产前诊断和遗传咨询等提供理论依据；3、基于本发明的方法，进一步通过生物信息学分析等研究新的遗传性骨病相关基因变异的功能，初步阐明遗传性骨病的分子致病机制，绘制骨骼发育信号网络基因的构成并初步阐明其在骨骼发育中的功能，可以丰富发育生物学的知识和开展实验性治疗研究。附图说明图1.561个遗传性骨病相关目标基因捕获探针设计信息。图2.序列变异的生物信息学分析流程。图3.测序深度和覆盖度。图4.样本覆盖度。图5.样本q20，q30情况。图6.基因区域分布图。图7.功能分布图。具体实施方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。实施例1一、研究方法(1)遗传性骨病家系患者样本的收集本项目已采集50例遗传性骨病先证者及家系成员血样。(2)已知致病突变的临床遗传性骨病样本筛选(表1)表112例已知致病基因突变的遗传性骨病样本#诊断基因已知致病突变靶向高通量测序结果s01并指畸形gja1c.302g>tc.302g>ts02先天性马蹄内翻足flnbc.4717g>tc.4717g>ts03先天性挛缩畸形tnni2c.533t>gc.533t>gs04手指屈曲畸形fbn2c.3434g>ac.3434g>as05多指畸形gli3c.714t>ac.714t>as06多并指畸形hoxd13c.556c>tc.556c>ts07颅缝早闭fgfrl1c.506g>ac.506g>as8髋关节脱位bicd1c.1165g>ac.1165g>a(3)遗传性骨病候选相关基因的遴选通过ipa通路分析、amigo2、lifemapdiscovery等找寻参与骨、软骨发育、形成过程及骨骼系统疾病的基因，同时利用eurexpress、emage与genepaint数据库，查询在c57bl/6胎鼠中轴骨骨架、肢体(前肢、后肢)、头颅等高表达的基因，共筛选出59个基因(见表2)。查阅文献，已报道遗传性骨病相关基因502个。两者合并后最终共筛选出561个遗传性骨病候选相关基因。表2通路分析及数据库筛选出的59个基因hand2gas1relacer1hoxd12osr1bmp5pappa2prrx1sox4bmp3fgf18dkk1thbs1sfrp2scxhoxa10rdh10col27a1lect1meox2lummef2cchadgli1matn1egfrnr2f2six2phospho1cytl1hmga2rargsatb2runx3amelxhs6st1tgfb3ltbp3foxi1sox11mmp14fras1dhrs3pdgframmp16crabp2trim45irx5gja5hoxa5gata3foxc2chst11hoxa2robo1prrx2rarbcited2(4)遗传性骨病候选相关基因目标区域捕获探针设计本项目组已经利用agilentsuredesign在线设计工具(https://earray.chem.agilent.com/suredesign/home.htm)设计了针对561个遗传性骨病相关基因的捕获探针(图1)，561个遗传性骨病相关基因目标区域大小为1.496mbp，捕获试剂盒共含有30816个捕获探针，总大小为2.08mbp，对目标区域的覆盖率达到99.4％以上，为成功进行下一步实验奠定了坚实的基础。(5)遗传性骨病高通量平行靶向测序方法的建立1)利用agilentsureselecttargetenrichmentsystemkit和illuminamiseq测序平台对12例已知致病突变的临床遗传性骨病样本进行测序分析：①基因组dna的制备及检测，构建片段文库：限制性内切酶消化基因组dna→构建片段文库→样本文库验证；②目标片段的富集、富集文库的扩增和文库质量的检测：文库杂交→靶基因富集→富集效率鉴定→测序文库质量评价；③高通量测序：应用illumina公司的miseq平台进行高通量测序；④测序质量的评估：应用相关软件(如nextgene等)对测序片段与基因组序列的匹配性、测序覆盖度和深度等进行评价；应用snpscan技术(上海天昊生物科技有限公司)对测序基因型准确性进行评价。2)生物信息学分析：测序平台产生的原始数据汇总后，首先过滤遴选质量过关的序列测序结果，然后通过序列变异的生物信息学分析流程(图2)，使用nextgene(softgeneticsinc.)和gatk(genomeanalysistoolkit)两种软件进行遗传性骨病新候选相关基因变异的分析：①nextgene软件分析流程a.应用nextgene软件将fastq文件转换成fasta文件；b.对pair-end测序数据进行condensation模块(默认设置)处理；c.与人类基因组参考序列(hg19)进行alignment(默认设置)处理(比对、注释、功能预测等)；d.将新遗传性骨病候选相关基因变异检测结果利用mutationreport模块转换成vsf格式文件；e.应用ipa变异分析在线工具(ipavariantanalysis)对各样本的新遗传性骨病候选相关基因变异数据进行分析。②gatk软件分析流程a.利用burrows-wheeleraligner(bwa)软件(默认设置)将测序序列比对到人类基因组参考序列(hg19)；b.利用bedtools计算序列质控参数；c.利用gatk软件包中的unifiedgenotyper模块检测snv；d.利用pindelandgatkindelgenotyperv2.0检测indel；e.利用annovar软件对检出的新遗传性骨病候选相关基因的各种类型变异进行注释；f.利用mutationtaster，polyphen-2，sift，fathmm，metalr，revel，m-cap等软件对所有变异的潜在功能影响进行预测。3)实验条件优化：根据初步数据，优化目标捕获及测序流程，以提高测序通量，覆盖率，测序深度及reads中标率(on-targetrate)和测序正确率。建立最佳序列分析流程，以达到高敏感性和特异性。二、结果通过以上方法建立了基于illuminamiseq技术平台的高通量平行靶向测序技术进行遗传性骨病临床分子诊断的方法和流程。对8例已知致病基因突变的遗传性骨病样本靶向高通量测序验证，经验证靶向高通量测序结果与已知致病基因突变完全相同，达到ngs进行遗传性骨病临床分子诊断体系的敏感性和特异性均达95％以上的目标要求。利用建立的靶向测序技术对50例遗传性骨病进行了检测，样本测序信息：1)样本测序总数据量：14g，q20数据达到99.7％，q30数据达到95.7％以上，样本目的区域的总测序深度平均值>300x，有效测序深度的平均值>120x，90％样本的平均测序深度>100x，reads中标率(on-targetrate)：99.3％，ngs进行遗传性骨病临床分子诊断体系的敏感性和特异性均达95％以上(图3)。2)使用fastqc对正反向fastq序列质控，得到质量报告、碱基分布报告和gc含量报告等：①序列每个碱基位置的质量分布：通常长测序末端质量会明显下降，r1序列总体质量一般高于r2。②序列每个碱基位置的atcg含量：通常前几个碱基波动较大，之后稳定在20到40之间。③序列每个碱基位置的gc含量：通常前几个碱基波动较大，之后稳定在40到60之间。④序列质控结果：见表3。表3序列质控结果注：表格中仅显示前3个样本。⑤基因组比对：比对采用bwa软件的mem算法，将fastq文件比对到参考基因组上生成bam格式的文件。比对结果用picard软件进行统计分析，得到有效reads数量、有效碱基数量、平均覆盖深度、2x～30x覆盖比例等等(表4)。表4比对结果⑥样本覆盖度(图4)：样本目的区域的总测序深度平均值>300x，有效测序深度的平均值>120x，90％样本的平均测序深度>100x。⑦样本q20，q30情况(图5)：q20数据达到99.7％，q30数据达到95.7％以上。⑧snv分布统计：见图6、图7。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。当前第1页12