本发明属于水产生物技术领域中的海洋蟹类性别鉴定技术，特别涉及一种基于pcr技术的拟穴青蟹遗传性别快速鉴定方法。
背景技术：
青蟹属(scylla)隶属于甲壳动物纲(crustacea)、十足目(decapoda)、梭子蟹科(portunidae)，主要分布于西太平洋、东南亚、澳大利亚、印度洋、南非等海域。其中，拟穴青蟹主要分布于我国东海和南海沿岸，因其具有体型大、生长快、肉质鲜美和营养丰富等特点，在近代以及现代被视为珍贵海鲜食品，也是我国传统的海水养殖品种和海洋捕捞资源。
近年来，我国拟穴青蟹人工养殖产量不断增加，并保持良好的发展势头，具有很大的发展空间和养殖潜力。据中国渔业年鉴统计，2016年我国青蟹养殖产量超过14万吨，其中广东、福建、浙江、广西和海南是主产区。拟穴青蟹雌雄间在生长速度、个体大小和营养价值等方面存在明显差异，雌性个体显著大于同期雄性个体(jiangetal.2014)，而且发育成熟的雌性青蟹因含有营养价值丰富的膏(卵巢)，因而其市场价值也大大高于雄性个体。因此，建立拟穴青蟹单性育种和养殖技术，将有助于提高养殖产量，增加渔民收入，促进水产养殖产业结构升级和改造。但是，目前尚不清楚拟穴青蟹的性别决定和分化机制，极大阻碍了单性育种和养殖产业的发展。
拟穴青蟹遗传性别的确定对其性别决定和分化机制的研究具有十分重要的意义。对于成蟹，可以通过观察外部形态特征来确定性别。但是，对于幼蟹特别是发育早期的幼体，仅从外部形态特征难以准确区分雌雄。目前拟穴青蟹发育早期性别鉴定主要采取性别相关snp标记的方法，由于该方法需要结合pcr扩增和测序技术来对拟穴青蟹进行性别鉴定，具有操作复杂，成本高且耗时长的缺点，极大地限制了其在实践中，特别是大规模群体性别鉴定中的应用。因此，有必要开发出一种简单方便、准确率高、成本低且实用性强的拟穴青蟹遗传性别快速鉴定方法。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种基于pcr技术的拟穴青蟹遗传性别快速鉴定方法，以便大规模快速鉴定生长发育早期拟穴青蟹的性别，从而推动性别决定和分化机制的研究，促进拟穴青蟹单性育种和养殖产业的发展。
一种基于pcr技术的拟穴青蟹遗传性别快速鉴定方法，主要包括以下步骤：
(1)设计对照引物和利用碱基错配的方法来设计雌性特异性引物；
(2)提取待测拟穴青蟹个体基因组dna；
(3)分别利用对照引物和雌性特异性引物，以拟穴青蟹基因组dna作为模板，在退火温度为65℃下进行pcr扩增，获得相应的pcr产物；
(4)采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，判断雌雄个体。
本发明引物的特点是只有在雌性个体中扩增出大小为320bp的dna片段，而在雄性个体中不能扩增出相应的dna片段。
对照引物是根据已知的dna序列，利用引物设计软件primerpremier5.0进行设计，这对引物在雌雄个体中均可以扩增出282bp的片段。本引物的设计是为了排除性别鉴定时，由于模板问题而导致的鉴定错误。该对引物的特点是：特定退火温度下，在拟穴青蟹雌雄个体中均能扩增出大小为282bp的dna片段。
引物设计完成后，需要对相应的pcr反应体系(成分组成)以及pcr反应程序进行优化。本发明经过体系优化后得出来最适的引物浓度和其他成分组成，以及pcr反应程序中最适退火温度为65℃。
优选的，步骤(1)中所述的利用碱基错配的方法来设计雌性特异性引物主要为：依据已知的雌性特异的snp位点，并利用碱基错配的方法来设计，正向引物中包括四个错配碱基，分别是正向引物(5’-3’)中的第1个、第17个、第25个、第29个碱基；其中，第17个和第25个碱基为雌性特异性snp位点，第1个和第29个碱基错配是为了保证雄性错配率而人为设计的错配。
优选的，步骤(1)中所述的对照引物的核苷酸序列为：
control-f:5’gttctgcttatcatagttattgccttg3’；
control-r:5’ctgccagtgattcagtgacttagc3’；
所述的雌性特异性引物的核苷酸序列为：
female-specific-f：5’cttagtatatcacaactacatcaggatgt3’；
female-specific-r：5’aagatgcttgctgtctcattggt3’。
优选的，步骤(1)中所述雌雄个体的判断方法为：如果对照引物和雌性特异性引物均能扩增出dna片段，且大小分别为282bp和320bp，则判定该个体为雌性；如果只有对照引物可以扩增出大小为282bp的dna片段，而雌性特异性引物不能扩增出大小为320bp的dna片段，则判定该个体为雄性。
优选的，所述待测拟穴青蟹个体基因组dna的提取主要包括以下步骤：采集青蟹的肌肉组织或者幼蟹的整个个体，在裂解液中进行匀浆；然后加入rnaasea消化rna和蛋白酶k消化组织，在55℃水浴锅中消化至澄清；然后采用酚和氯仿分别抽提多次，用冰乙醇沉淀dna，并用70％乙醇清洗dna沉淀，在37℃烘箱中干燥dna，加入适量无菌双蒸水溶解dna，调节dna浓度为50ng/μl，于-20℃中保存备用。
优选的，骤(3)所述的pcr扩增采用的pcr反应体系为20μl,包括2.5μl10×pcrbuffer、1.0μldntp、pcr上下游引物各0.25μl，0.4μltaqdna聚合酶、dna模板1.5μl，然后用ddh2o补足至20μl。为了提高本引物特异性，减少了体系中引物含量，并对反应体系中其他成分含量进行了优化。
优选的，步骤(3)所述的pcr扩增采用的pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
与现有技术相比，本发明利用性别特异性snp位点的碱基错配方法进行雌性特异性引物的设计，可以在雌性中扩增出特异性条带，而在雄性个体中无特异性扩增，从而快速鉴定拟穴青蟹的性别，此外，还设计了一对对照引物，用来排除因为dna模板问题而引起的误判。通过优化的pcr反应体系以及pcr反应程序扩增后进行琼脂糖检测即可实现对拟穴青蟹的遗传性别鉴定，具有重复性好、操作简便、准确率高、成本低和实用性强，基本的实验室条件下即可完成鉴定，有利于该方法的广泛应用。可用于大规模快速鉴定生长发育早期拟穴青蟹的遗传性别，有利于推动性别决定和分化机制的研究，促进拟穴青蟹单性育种和养殖产业的发展。
附图说明
图1是本发明基于pcr技术的拟穴青蟹遗传性别快速鉴定方法的流程图；
图2是基于pcr技术对24只已知性别的拟穴青蟹成蟹遗传性别鉴定的结果；
图3是基于pcr技术对60只未知性别的拟穴青蟹幼蟹(仔1期)遗传性别鉴定的结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
1.引物设计
根据已知的dna序列和雌性特异snp位点，利用引物设计软件primerpremier5.0设计一对对照引物和三对雌性特异性引物，对照引物的核苷酸序列为：
control-f:5’gttctgcttatcatagttattgccttg3’；
control-r:5’ctgccagtgattcagtgacttagc3’；
三对雌性特异性引物中上游引物的核苷酸序列为：
female-specific-f1：5’cttagtatatcacaactacatcaggatgt3’；
female-specific-f2：5’ttagtatatcacaactacatcaggctgt3’；
female-specific-f3：5’ttagtatatcacaactacatcgggaggt3’
加粗和加下划线字母为错配碱基和相应位点。
三对雌性特异性引物共用一条下游引物，其核苷酸序列为
female-specific-r1：5’aagatgcttgctgtctcattggt3’。
2.取样及基因组dna的提取
(1)取已知性别的雌雄拟穴青蟹各两只，取其肌肉组织，液氮速冻后，于-80℃中保存备用。
(2)利用酚氯仿法提取拟穴青蟹基因组dna，步骤如下：取青蟹肌肉组织50mg左右于1.5ml的离心管中，加入300μl组织裂解液，充分匀浆；向离心管中加入10μlrna酶(20mg/ml)，混匀，室温孵育2min，加入300μl的组织裂解液和5μl蛋白酶k(20mg/ml)，充分混匀，于55℃水浴锅中消化至澄清；向上述澄清溶液中加入300μltris-饱和酚和300μl氯仿混匀10min，13000rpm离心10min；吸取上清液约400-500μl至新的离心管中，加入600μl氯仿再次进行混匀10min，13000rpm离心10min；吸取上清液约300-350μl至新的离心管中，加入1ml预冷的无水乙醇，12000rpm离心3min；弃上清，利用预冷的70％乙醇清洗dna沉淀两遍；在37℃烘箱中干燥dna，加入20-50μl无菌双蒸水溶解dna，利用nanodrop2000紫外分光光度仪(美国nanodroptechnologies，inc)检测dna浓度和纯度，然后调节dna浓度为50ng/μl，于-20℃中保存备用。
3.pcr扩增
以拟穴青蟹基因组dna为模板，利用一对对照引物和三对雌性特异性引物分别进行pcr扩增。pcr反应体系为20μl，包括2.0μl10×pcrbuffer、1.6μldntp(2.5mmeach)、pcr上下游引物各0.4μl(10μm)，0.4μltaqdna聚合酶(5u/μl)、dna模板1.0μl，然后用ddh2o补足至20μl；pcrbuffer、dntp和taqdna聚合酶均购自北京全式金生物技术有限公司。pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，特定的退火温度下退火30s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。其中，对照引物的退火温度设为65℃，而三对雌性特异性引物的退火温度均先后设为57℃、58℃和59℃。
4.琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物
(1)琼脂糖凝胶电泳：配制1.5％的琼脂糖凝胶，上样时取
(2)凝胶成像：电泳结束后将琼脂糖凝胶放入凝胶成像仪，设置适当的参数后曝光并拍照。
5.电泳结果判定
根据条带的有无、条数、亮度判断引物的有效性。结果显示，对照引物在雌雄个体中均有一条很亮的条带出现；第一对雌性特异性引物在雌性中有一条较亮的条带，而雄性中出现一条较暗的条带；另外两对雌性特异性引物在雌雄个体中均出现一条较亮的条带。本结果证明，三对特异性引物在57℃到59℃下均不能实现对拟穴青蟹遗传性别的鉴定。
6.引物退火温度优化
将三对雌性特异性引物的退火温度升高均先后设为60℃、61℃、62℃，然后进行pcr扩增，并利用琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。结果显示，第一对雌性特异性引物在雌性个体中有一条较亮条带，而在雄性个体中有一条非常暗的条带；而第二对和第三对雌性特异性引物在雌雄个体中均没有条带出现。本结果证明，第二对和第三对雌性特异性引物均不能用于鉴定拟穴青蟹遗传性别，而第一对引物仍有潜力成为遗传性别鉴定的特异性引物。
然后，分别将第一对雌性特异性引物的退火温度提升至65℃，67℃和69℃。结果显示，在65℃条件下，雌性中有一条较亮条带，雄性中无条带出现；而在67℃和69℃条件下，雌雄个体中均无条带出现。最终，选定65℃为第一对雌性特异性引物的最适退火温度。
7.pcr反应体系和反应程序优化
对第一对雌性特异性引物的反应体系和反应程序进行了优化，主要针对引物浓度和退火温度。pcr反应体系为20μl，包括2.5μl10×pcrbuffer、1.0μldntp(2.5mmeach)、pcr上下游引物各0.25μl(10μm)，0.4μltaqdna聚合酶(5u/μl)、dna模板1.5μl，然后用ddh2o补足至20μl；pcrbuffer、dntp和taqdna聚合酶均购自北京全式金生物技术有限公司。pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。经过pcr扩增，并利用琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。结果显示，第一对雌性特异性引物在雌性个体中有一条较亮条带，而在雄性个体中有无条带出现。结果证明，在本pcr反应体系和65℃退火温度的条件下，第一对雌性特异性引物可以用于拟穴青蟹遗传性别的鉴定。
实施例2
一种基于pcr技术的拟穴青蟹遗传性别快速鉴定方法，如图1所示主要包括以下步骤：
1.引物设计
根据已知的dna序列和雌性特异snp位点，利用引物设计软件primerpremier5.0设计对照引物和雌性特异性引物，对照引物的核苷酸序列为：
control-f:5’gttctgcttatcatagttattgccttg3’；
control-r:5'ctgccagtgattcagtgacttagc3'；
雌性特异性引物的核苷酸序列为：
female-specific-f：5’cttagtatatcacaactacatcaggatgt3’；
female-specific-r：5’aagatgcttgctgtctcattggt3’。
2.取样及基因组dna的提取
(1)从汕头市牛田洋养殖基地采集24只拟穴青蟹成蟹，其中雌蟹12只，雄蟹12只，根据腹部形态特征确定性别，并做好记录。取大螯内的肌肉组织，液氮速冻后，于-80℃中保存备用。
(2)利用酚氯仿法提取拟穴青蟹基因组dna，步骤如下：取青蟹肌肉组织50mg左右于1.5ml的离心管中，加入300μl组织裂解液，充分匀浆；向离心管中加入10μlrna酶(20mg/ml)，混匀，室温孵育2min，加入300μl的组织裂解液和5μl蛋白酶k(20mg/ml)，充分混匀，于55℃水浴锅中消化至澄清；向上述澄清溶液中加入300μltris-饱和酚和300μl氯仿混匀10min，13000rpm离心10min；吸取上清液约400-500μl至新的离心管中，加入600μl氯仿再次进行混匀10min，13000rpm离心10min；吸取上清液约300-350μl至新的离心管中，加入1ml预冷的无水乙醇，12000rpm离心3min；弃上清，利用预冷的70％乙醇清洗dna沉淀两遍；在37℃烘箱中干燥dna，加入20-50μl无菌双蒸水溶解dna，利用nanodrop2000紫外分光光度仪(美国nanodroptechnologies，inc)检测dna浓度和纯度，然后调节dna浓度为50ng/μl，于-20℃中保存备用。
3.pcr扩增
以24只拟穴青蟹基因组dna为模板，利用对照引物和雌性特异性引物分别进行pcr扩增。pcr反应体系为20μl，包括2.5μl10×pcrbuffer、1.0μldntp(2.5mmeach)、pcr上下游引物各0.25μl(10μm)，0.4μltaqdna聚合酶(5u/μl)、dna模板1.5μl，然后用ddh2o补足至20μl；pcrbuffer、dntp和taqdna聚合酶均购自北京全式金生物技术有限公司。pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
4.琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物
(1)琼脂糖凝胶电泳：配制1.5％的琼脂糖凝胶，上样时取
(2)凝胶成像：电泳结束后将琼脂糖凝胶放入凝胶成像仪，设置适当的参数后曝光并拍照。
5.拟穴青蟹性别判定
根据电泳条带判定拟穴青蟹性别，如果对照引物和雌性特异性引物均能扩增出dna片段，且大小分别为282bp和320bp，则判定该个体为雌性；如果只有对照引物可以扩增出大小为282bp的dna片段，而雌性特异性引物不能扩增出大小为320bp的dna片段，则判定该个体为雄性。结果如图2所示，m为
实施例3
60只未知性别的拟穴青蟹幼蟹(仔1期)基因组dna为模板，重复实施例中步骤3-5。结果如图3所示，其中m为