本发明涉及一种基于mgb探针的qpcr法进行狮物种特异性鉴定的方法，涉及分子生物学领域。本发明检测方法特异性好、灵敏度高、重复性好。
背景技术：
狮(pantheraleo)，现存亚洲狮和非洲狮2个亚种。目前亚洲狮被列入cites附录i，非洲狮则被列入附录ii。在中国，狮没有野外分布，但动物园有大量饲养。狮是常用来伪造其他动物制品的造假材料，如狮骨假冒虎骨等。目前，国际禁止狮及相关制品的贸易，但是在经济利益的刺激下，狮制品的非法贸易时有发生。所以，迫切需要一种高效、准确识别狮制品真伪的检测方法。
传统的狮制品分子检测手段，一般是首先提取狮制品中的dna，再利用引物扩增目的片段，最后通过测序比对的方法来鉴定狮制品的真伪。由于大多数狮制品中dna降解和片段化较为严重，经常难以提取出有效的dna、扩增出满足测序分析的长序列。与此同时，随着现代造假技术的发展，传统的形态学鉴定也难以解决。
实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr，qpcr)是一种在dna聚合酶链式反应(pcr)中，以荧光化学物质检测每次扩增循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中特定dna序列进行定性定量分析。该方法通过荧光信号的分析，对pcr进程进行实时检测。探针法是qpcr中一种常见方法，在反应体系中加入化学修饰的寡聚核苷酸探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，无法检测到荧光信号。而当pcr扩增时，taq酶的5’-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物的形成完全同步。mgb探针是在传统taqman水解探针基础上的改进，通过在探针的3’端加入mgb基团，从而提高探针的退火温度，缩短探针的长度，提高探针的特异性和灵敏度。
本发明建立了一种对疑似狮制品的狮物种特异性的实时荧光定量pcr检测方法，利用mgb探针，能够高效、准确和更快速的检测疑似狮制品是否特异地来源于狮。cytb基因是目前国内外广泛认可的用于物种鉴别的dna序列，本发明针对cytb基因设计引物和mgb探针。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是设计针对狮的特异引物和探针。
本发明的第二个目的是为了克服现有分子生物学检测技术的不足之处，建立一种使用方便、快捷、准确的狮制品真伪识别的检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
1、dna的提取体系
样品的dna提取参照axygen动物基因组提取试剂盒说明书进行，取20mg狮肌肉组织以及动物制品的样品，放置于2ml离心管中，加入350μlpbs和0.9μlrnasea，用剪刀温和的剪碎组织30s。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶k，立即涡旋振荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管至于56℃水浴中过夜消化处理。加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将dna制备管至于2ml离心管中，将离心后的混合液上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液后，离心一分钟。将dna制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的tris-hcl洗脱液100μl洗脱制备管中dna，-20℃冷冻备用。
2、引物和探针的设计
选取genbank上已发表的狮(af384818)线粒体cytb序列，利用blast进行比对后，选择物种特异的dna序列，利用abiprimerexpress3.0设计引物与mgb探针，primer6.0分析引物二级结构，将所设计的引物和探针利用blast再次进行比对分析，确保引物与探针的特异性。
引物和探针设计结果：
3、本发明中qpcr检测方法的建立
在taq-hsprobeqpcrpremix的基础上，建立20μl反应体系，其中上下游引物和mgb探针的量从0.3μl到1.5μl，以0.1μl为梯度递加。反应体系中加入模板2μl其余用水补足。根据荧光定量pcr的结果，选择最大的荧光增量和最好的曲线走势作为判定标准，选择引物和探针的最适量。
最佳反应体系：
pcr反应程序如下：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40个循环，循环在退火时收集荧光信号。
判图原则：ct值小于等于30并有明显扩增曲线判为阳性；ct值大于等于35判为阴性；ct值介于30～35之间判为可疑，重复实验，如果实验结果相同且拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。
4、本发明中qpcr特异性实验
利用狮引物和探针，分别加入非洲狮、白狮、东北虎、孟加拉虎、金钱豹、雪豹、猞猁、豹猫、家猫、漠猫、棕熊、黑熊、马来熊、水牛、马鹿、狗、小灵猫、梅花鹿、塔里木兔、家猪、野猪、绵羊、狐狸、羊驼、骆驼的dna模板进行特异性实验，反应体系按照荧光定量pcr检测方法所确定的最佳反应体系建立。
5、本发明中qpcr灵敏度实验
将狮dna提取液原液按照10倍的梯度倍比稀释，得到100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍的dna溶液。用本发明中设计的狮引物和探针进行检测。
6、重复性实验
将狮dna模板按照5倍比例进行倍比稀释。利用相应的引物和探针，针对狮dna原液和稀释液每个浓度点进行重复检测，用于验证各浓度下的重复性。同时计算回判率。
7、盲测实验
随机准备10份样品，其中一份为狮的样品，而另外9份为其它物种样品。对这10份样品进行盲测实验，通过该盲测试验对本方法的有效性进行检验。
附图说明
图1为狮引物探针的特异性实验结果
图2为狮梯度灵敏度实验
图3为狮各浓度点重复性实验结果
图4盲测实验
具体实施方式
实施例1
疑似狮制品的检测
1、dna的提取体系
取疑似狮制品20mg，放置于2ml离心管中，加入350μlpbs和0.9μlrnasea，用剪刀温和的剪碎组织30s。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶k，立即涡旋振荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管至于56℃水浴中过夜消化处理。加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将dna制备管至于2ml离心管中，将离心后的混合液上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液后，离心一分钟。将dna制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的tris-hcl洗脱液100μl洗脱、制备管中dna，-20℃冷冻备用。
2、体系和程序
对于待测样品，用20μl含有狮探针引物的反应体系进行检测分析。
20μl反应体系：
pcr反应程序如下：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40个循环，循环在退火时收集荧光信号。
判图原则：ct值小于等于30并有明显扩增曲线判为阳性；ct值大于等于35判为阴性；ct值介于30～35之间判为可疑，重复实验，如果实验结果相同且拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。
结果表明，疑似狮制品的dna提取液，经过qpcr扩增，出现明显的狮扩增曲线。检测结果显示，本方法对狮制品真伪的检测结果是准确、可靠、有效的。
探针法qpcr进行狮物种特异性鉴定的方法
序列表
1
19
dna
人工序列
1
cccgccaatcctctaagca
2
22
dna
人工序列
2
ggaatagatcggaggattgcat
3
15
dna
人工序列
3
tccccatatcaaacc