本发明涉及一种hla高分辨基因位点的快速扩增诊断试剂盒及扩增方法，属于生物领域，尤其是生物检测领域。
背景技术：
人类白细胞抗原(hla)是人类主要组织相容性抗原复合体(mhc)，是机体内特异性免疫识别和免疫应答的主要成分，是影响造血干细胞移植成功的关键因素之一，可靠的hla基因频率尤其是高分辨基因频率数据，是预计找到hla匹配供者可能性的重要依据，对hla与疾病相关性研究、群体遗传学研究以及法医学研究等方面也具备重要的应用价值。目前有关中国人群hla在不同地区不同种族之间的报道已有很多，但多数是以hla的低分辨基因分型或者以血清分型为依据进行后续研究的，没有通过hla的高分辨基因位点进行研究的一套成熟的方法。hla位于人体第6号染色体，hla的高分辨基因位点有5个：hla-a、-b、-c、-drb1和dqb1，其中hla-drb1是hla-ii类基因中多态性最丰富的基因位点，决定dr抗原多态性。因此hla-drb1基因多态性是免疫抗原多态性的重要组成部分，可能影响多种疾病的发生。
hla-drb1基因均具有单基因多态性，这种基因多态性的诊断对于疾病的发生与预防有着重要的作用。现有的基因诊断主要采用传统测序法或基因芯片检测法，这类型的检测方法均对检测样品需要的量较大，且检测时间长、步骤繁琐，大大增加了被测者的经济负担。因此，发明人基于对焦磷酸测序的多年研究，开发出了一款hla高分辨基因位点drb1的快速扩增诊断试剂盒及扩增方法。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以线性指数pcr技术为基础，获得一种hla高分辨基因位点的快速扩增诊断试剂盒及扩增方法。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的hla高分辨基因位点的快速扩增诊断试剂盒的技术方案如下：
所述扩增试剂盒包括dna聚合酶和扩增引物，hla高分辨基因位点为hla-drb1，其扩增模板序列包含在如序列表seqidno：1所示的序列中，扩增引物用于线性指数pcr扩增，扩增引物上游序列如序列表seqidno：2所示，下游序列如序列表seqidno：3所示。
本发明中的测序引物特异性高、准确性好，可以准确地检测hla-drb1的snp位点，序列用于线性指数pcr(late-pcr)可以大量产生便于焦磷酸测序的单链dna，无需对常规的双链dna进行解螺旋和分离。
引物序列中有一条为过量引物，一条为限制性引物，过量引物和限制性引物与正向引物和反向引物之间并无明确的制定关系，可以根据需要扩增的片段单链来选择扩增量，扩增量大的链对应的扩增引物即为过量引物，另一条链对应的扩增引物为限制性引物。
设计引物时，由于线性指数pcr对于引物的要求较高，要求引物之间的tm值之差≥5℃，扩增产物与过量引物之间的tm值之差≤13～18℃。这样可以保证最佳的延伸效果，但该温度要求不是绝对的，只要能够通过late-pcr扩增出待测的目的产物，就可以采用。
优选的，本发明中如序列表seqidno：2所示的引物为过量引物，如序列表seqidno：3所示的引物为限制性引物。
本发明中过量引物与限制性引物的具体选择可以根据实际需要扩增的单链进行调换，也就是说，如序列表seqidno：2所示的引物为限制性引物，如序列表seqidno：3所示的引物为过量引物。引物的用量可以根据实际需要和本领域常识进行调整，用量多的一条引物为过量引物，用量少的一条引物为限制性引物，本发明的保护范围不应受到引物名称和使用量的限制。
更优选的，过量引物与限制性引物在体系中的添加量为指数倍，最少为10倍。
优选的，扩增试剂还包括扩增缓冲液、dntps和mg2+。
本发明中的扩增产物优选采用焦磷酸测序进行序列检测，焦磷酸测序引物优选如序列表seqidno：4所示。但焦磷酸测序并不是唯一的测序方式，任何的可以检测基因序列的现有技术均可以作为检测方法被本发明采用，因此，焦磷酸测序不应作为是对本发明的限制。
本发明的第二个目的在于提供一种采用上述任一一款试剂盒的扩增方法，所述扩增体系采用25μl体系，具体为：
1×pcrbuffer、3mmol/lmgcl2、100μmol/ldntps、1.5utaqdna聚合酶、0.1μmol/l限制性引物pl、1μmol/l过量引物pe，13％甘油和4％bsa2mmol/l；1μldna模板，加水补充至25μl。
扩增条件为95℃预变性5min，60℃扩增循环，72℃延伸10min，4℃保持，其中每87℃10s、66℃10s和72℃20s组成一个扩增循环。
扩增后优选采用焦磷酸测序，虽然扩增后的产物大部分为单链，但仍有部分区域为双链，为了使焦磷酸检测根据准确和快速，仍对扩增产物进行退火处理，制备为单链模板。
优选的，退火处理时采用两种试剂：试剂a为不含apyrase的其他焦磷酸测序用试剂，包括dtt、aps、pvp、atpsulfurylase、klenow、荧光素和荧光素酶，试剂b为试剂a与apyrase的混合液。
其中，试剂a的一种最优选的配置方案是：0.1mol/ltris-醋酸(ph7.7)，2mmol/ledta，10mmol/l醋酸镁，0.1％bsa，1mmol/l二硫苏糖醇(dtt)，2μmol/laps，0.4g/lpvp，200u/latpsulfurylase，18u/mlklenow，0.8mmol/ld-荧光素，6mg/l荧光素酶。
试剂b最优选的一种配置方案是：试剂a与3.2u/mlapyrase的混合液。
退火时，取1～2μllate-pcr产物和1.2μlaps(1mmol/l)，加入30μl试剂a，混匀后放置10～15min，再加40μl试剂b混匀放置3～5min，然后加入退火引物(终浓度达到0.3μmol/l)，室温退火10～15min。
本发明采用本公司自行研发的焦磷酸测序仪进行测序，测序结果与现有的市售焦磷酸测序仪相比，不仅结果更加准确，且精度高样本用量小，检测出峰准确，无需重复验证试验。
由于特异性引物的发现及扩增体系的建立，本发明还公开了一种hla-dqb1基因的特异性引物及扩增体系在快速扩增诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒采用线性指数pcr与焦磷酸测序结合的方式对hla-dqb1基因进行扩增诊断。
本发明中的快速扩增诊断试剂盒及扩增方法可以用于hla-dqb1基因的临床或药理学诊断，诊断样本来源不限，诊断结果可以作为基因筛查、疾病易感性、用药指导等多方面的诊断依据，采用本发明中的扩增试剂盒、扩增方法或其他常规扩增方法均可以实现对hla-dqb1基因的高效扩增诊断，对于该基因的研究和临床发展具有重要的意义。
与现有技术相比，本发明采用线性指数扩增的目标片段扩增方法，精准设计的扩增引物扩增效率高且错配少，不仅大大增加了扩增效率，且直接扩增出单链dna可直接用于焦磷酸测序，无需对扩增产物进行标记和双链分离，避免了繁冗的实验步骤，也减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤。本试剂盒中的引物及实验方法均是经过精密的设计和测试得出的，适用于各种样本的hla-drb1的snp位点检测，并且检测效率高，检测结果准确。直接使用本发明中的扩增检测试剂盒和检测方法，对实验员的操作要求低，对检测环境的耐受力强，可以随时快速地进行扩增检测工作，方便快捷，检测成本低，结果准确且得出时间短，可以最大程度地减轻被检者的经济和精神负担，具有良好的市场潜在价值。
附图说明
图1是本发明提供的线性指数扩增产品凝胶电泳图；
图2是本发明提供的焦磷酸测序的基因测序图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的hla高分辨基因位点的快速扩增诊断试剂盒及扩增方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
本发明中采用的仪器和试剂如下：
ptc-255pcr扩增仪，美国mjresearch公司；
焦磷酸测序仪，武汉菲思特生物科技有限公司；
taqdna聚合酶、dntps(10mmol/l)、10×buffer和mgcl2(25mmol/l)(大连takara公司)；amplitaqgold聚合酶(appliedbiosystems公司)；klenowfragment(无外切酶活性)、乙烯基吡咯烷酮(pvp)和luciferase(promega公司)，牛血清白蛋白(bsa)、aps和apyrase(sigma公司)，α-硫化脱氧三磷酸腺苷(datpαs)、dgtp、dttp和dctp(amershampharmaciabiotech公司)；atpsulfurylase由本公司实验室表达；其它试剂均为分析纯，所有试剂均用灭菌去离子水稀释。试剂盒中引物由上海invitrogen公司合成，具体引物名称及序列请见序列表。
本发明中的快速扩增诊断试剂盒包括：引物扩增组和焦磷酸测序组，其中引物扩增组包括扩增引物、dna聚合酶、扩增缓冲液、dntps和mg2+，焦磷酸测序组包括退火引物、dna聚合酶(amplitaqgold聚合酶)、atp硫酸化酶(atpsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)、三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)和dntp，以及配置反应液用的klenow酶(klenowfragment)。
试剂盒中配有完整的操作方法，如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品pcr的缓冲液，其中含有100mmol/ltris-hcl，50mmol/lkcl，ph9.3～9.5。
一、扩增引物设计
本发明中采用线性指数pcr对hla-drb1的snp片段进行扩增，扩增出足够的单链dna模板以进行焦磷酸测序。根据ncbi中对hla-drb1的snp位点的记载，hla-drb1的rs号为701831，序列长1101bp，snp位点位于第501位，发生错配时a/t/g/c均可能出现错配，具体序列如序列表seqidno:1所示，n表示hla-drb1的snp位点，seqidno:1序列具体如下下划线部分为特异性引物连接部分：
ttactacactctgtactttccaagatttgtaaacagtttgacaatgcatgccgatttaaa
actatgaagaaacaaacacaatttttcacaacacctctcaaatctaatgggtcctcactg
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ctaatccctgagtgtcaggttcctcctctcccacatcctattttaatttgctccatgttc
tcatctccatcagcacaggtcactgggggtagccctgtaggtgtttctagaaacacctgt
acctcctggagaagcagtctcgcctgccaggcgggagagactgtccctcttttgaacctc
cccatgattttgcaggtcagggtcacccactctcccaggctccaggccctgcctctgggt
ctgagactgagtttctggtgctgttgctctgagttattttttgtgatctgggaagaggag
aagtgtaggggcctacctgacatgaggggagtccaatctcagccctgctttttattagct
ttgtcactctagacaaacta
根据上述基因序列，采用primerprimer5软件设计扩增和退火引物，其中e为过量引物，过量引物序列如序列表seqidno：2所示，l为限制性引物，限制性引物序列如序列表seqidno：3所示，a为扩增产物。tm值的计算采用oligoanalyzer3.1软件计算。引物序列及参数如下表1所示：
表1
二、线性指数pcr扩增
1.取样
本次实施例中选取100例人血样本进行测试，样本来源于武汉市中心血站，样本进行预处理为dna模板，避免血液中的免疫球蛋白g、血红蛋白和乳铁蛋白对pcr反应体系的干扰。
2.线性指数扩增
线性指数扩增的反应体系为25μl体系，体系中具体成分如下：
1×pcrbuffer(50mmolkcl、15mmoltris-hcl、ph8.0)、3mmol/lmgcl2、100μmol/ldntps、1.5utaqdna聚合酶、0.1μmol/l限制性引物pl、1μmol/l过量引物pe，13％甘油和4％bsa2mmol/l；1μldna模板，加水补充至25μl。
扩增条件为：95℃5min，60℃扩增循环(87℃10s，66℃10s，72℃20s)，72℃10min，4℃保持。
三、焦磷酸测序
3.1引物设计
根据扩增产物设计退火引物，退火引物序列如序列表seqidno：4所示：5'-gccaagtggagcacccaagcgt-3'。
3.2反应液的配制
试剂a：0.1mol/ltris-醋酸(ph7.7)，2mmol/ledta，10mmol/l醋酸镁，0.1％bsa，1mmol/l二硫苏糖醇(dtt)，2μmol/laps，0.4g/lpvp，200u/latpsulfurylase，18u/mlklenow，0.8mmol/ld-荧光素，6mg/l荧光素酶；
试剂b：试剂a，3.2u/mlapyrase。
3.3单链模板的制备
取1～2μllate-pcr产物和1.2μlaps(1mmol/l)，加入30μl试剂a，混匀后放置10～15min，再加40μl试剂b混匀放置3～5min，然后加入退火引物(终浓度达到0.3μmol/l)，室温退火10～15min。
3.4焦磷酸测序
将3.3步骤中的反应溶液全部转入焦磷酸测序反应池中，按照设计好的引物顺序加入dntp，采用本公司生产报批的焦磷酸测序仪进行测序，dntp加入顺序及检测结果如图2所示，其中图2所示为hla-drb1的焦磷酸测序图。
3.5统计结果
根据对本实施例中20例样本的检测结果进行统计分析，hla-drb1基因型频率分布情况如下表2所示：
表2hla-drb1基因型频率分布统计表
本实施例中的检测样本较小，加之hla-drb1的位点较多且具有地域分布不均的特点，故本次检测结果不代表该基因型的整体分布情况，仅表示本次实施例检测的统计结果。
四、检测结果验证
4.1琼脂糖凝胶电泳
将经过线性指数扩增的扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果图如图1所示，图中未标号条带为dnamarker，1～5道为随机抽取的扩增产物，6道为阴性对照。图中目的条带位置显示扩增的目的片段大小正确。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
序列表
<110>新开源博畅（武汉）生物科技有限公司
<120>一种hla高分辨基因位点的快速扩增诊断试剂盒及扩增方法
<130>2017
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1001
<212>dna
<213>homosapiens
<220>
<221>gene
<222>(1)..(1001)
<223>hla-drb1基因序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(501)..(501)
<223>nisa,c,g,toru
<400>1
ttactacactctgtactttccaagatttgtaaacagtttgacaatgcatgccgatttaaa60
actatgaagaaacaaacacaatttttcacaacacctctcaaatctaatgggtcctcactg120
tcaagattaaattccaggctgatgacactgtaaggtcacatggccagctgtgctataggc180
ctggtcaaggccagagcctgggtttgcagagaagcagacacacagccaaaccaggagact240
tactctgtcttcctgactcattccctctacgttgtttttctcctagtccaacctaaggtg300
actgtatatccttcaaagacccagcccctgcagcaccacaacctcctggtctgctctgtg360
agtggtttctatccaggcagcattgaagtcaggtggttcctgaacggccaggaagagaag420
gctgggatggtgtccacaggcctgatccagaatggagactggaccttccagaccctggtg480
atgctggaaacagttcctcgnagtggagaggtttacacctgccaagtggagcacccaagc540
gtgacaagccctctcacagtggaatggagtgagcagctttctgacttcctaaatttctca600
cccactaagaaggggaccgtgctaatccctgagtgtcaggttcctcctctcccacatcct660
attttaatttgctccatgttctcatctccatcagcacaggtcactgggggtagccctgta720
ggtgtttctagaaacacctgtacctcctggagaagcagtctcgcctgccaggcgggagag780
actgtccctcttttgaacctccccatgattttgcaggtcagggtcacccactctcccagg840
ctccaggccctgcctctgggtctgagactgagtttctggtgctgttgctctgagttattt900
tttgtgatctgggaagaggagaagtgtaggggcctacctgacatgaggggagtccaatct960
cagccctgctttttattagctttgtcactctagacaaacta1001
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223>hla-drb1基因过量引物序列
<400>2
gagtggtttctatccaggcagc22
<210>3
<211>22
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223>hla-drb1基因限制性引物序列
<400>3
tgagagggcttgtcacgcttgg22
<210>4
<211>22
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223>hla-drb1基因退火引物
<400>4
gccaagtggagcacccaagcgt22