本发明涉及一种脑梗早期诊断标志物的快速扩增试剂盒及扩增方法，属于诊断试剂盒领域。
背景技术：
流行病学调查发现，轻-中度高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，hhcy)是动脉粥样硬化和脑梗死(cerebralinfarction，ci)重要的新的独立危险因素，而且血浆同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)水平与ci患者的病情严重程度呈正相关，hcy是一种含硫氨基酸，体内不能合成，只能从食物中的蛋氨酸(亦称甲硫氨酸)脱甲基后转变而来，hcy在细胞内的代谢主要通过3种途径，主要涉及到的代谢酶有二甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)、蛋氨酸合成酶(ms)、蛋氨酸合成酶还原酶(mtrr)和胱硫醚β－合成酶(cbs)等。目前，关于mthfr和mtrr的研究已较为成熟，临床中作为诊断标志使用的也较多，但cbs的研究一直未受到重视。
cbs是hcy转硫基过程中的重要酶，人类cbs基因为常染色体隐性遗传。目前已发现的突变形式有17种，但其恶性突变如t833c、g919a等在人群中的比重小于1％，研究意义远小于844ins68、c699t、t1080c等良性突变，并且这些良性突变已被证实与hhcy的发病密切相关。因此，对于cbs基因的良性突变进行快速诊断分型，对于医学研究及临床诊断均有十分重要的意义。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以cbs的良性突变为基础，获得一种脑梗早期诊断标志物的快速扩增试剂盒及扩增方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的脑梗早期诊断标志物的快速扩增试剂盒的技术方案如下：
本发明所述的快速扩增试剂盒以人血浆内胱硫醚β－合成酶(cbs)作为脑梗早期诊断标志物，所述试剂盒包括两对扩增引物、taq酶、dntps和扩增体系缓冲液，其中扩增引物用于扩增cbs844ins68位点和cbsc699t位点，cbs844ins68位点的扩增模板选自序列表seqidno:1所示的序列中，cbsc699t位点的扩增模板选自序列表seqidno:2所示的序列中。
本扩增试剂盒主要针对两个对cbs的含量有较为重要影响的单核苷酸多态性(snp)位点进行扩增，且该扩增可以在同一体系中进行，扩增时间、扩增体系及仪器等消耗均减少一半左右，不仅节约了资源，且一次性得到了两个扩增片段，对于后续的测序和实验具有更广泛的用途，同时对这两个位点进行扩增后检测，对于疾病的发病种类、发病率的风险预测、发病后的诊断和治疗均有准确地指导意义。突变位点位于序列中，具体的扩增模板起始位点及长度可以根据具体的扩增方法不同而进行调整，并不限制于本发明中的扩增位点。
本发明中的扩增方法针对性地对上述两个位点设计了特异性引物，该特异性引物可以在多个模板dna共存状态下准确识别并特异性地扩增对应的目标片段，扩增特异性高，非特异性条带少，扩增片段可简单分离后进行后续检测。经申请人多次重复试验后，优选的同时采用两组特异性引物的扩增效果最好，扩增cbs844ins68位点的上游引物序列如序列表seqidno:3所示，下游引物序列如序列表seqidno:4所示，扩增cbsc699t位点的上游引物序列如序列表seqidno:5所示，下游引物序列如序列表seqidno:6所示。
本发明中的方法由于涉及多个片段的同时扩增，建议尽量减少干扰因素对扩增体系的影响，因此，优选采用提取后的人全血dna作为扩增模板进行扩增，如需采用人全血dna不经提取直接作为模板进行扩增，需要将普通缓冲液替换为全血扩增缓冲液。
优选的，试剂盒还包括全血扩增缓冲液，全血扩增缓冲液含有100mmol/ltris-hcl，50mmol/lkcl，ph9.3～9.5。
优选的，试剂盒为了提高pcr扩增的特异性，试剂盒还包括dmso和/或bsa。
本发明的第二个目的在于提供一种采用上述试剂盒的脑梗早期诊断标志物的快速扩增方法，所述方法采用25μl扩增体系同时扩增两个目的片段，目的片段为选自序列表seqidno:1所示的序列中的cbs844ins68位点，和自序列表seqidno:2所示的序列中的cbsc699t位点。
本扩增方法中的扩增体系为为25μl的pcr体系，具体包括：
1×pcrbuffer2μl；
mg2+(25mmol/l)1μl；
dntps(25mmol/l)0.6μl；
taq酶(5u/μl)0.3μl；
模板dna2μl；
cbs844ins68位点上下游引物(10μmol/l)各1μl；
cbsc699t位点上下游引物(10μmol/l)各1μl；
无菌双蒸水补齐至25μl。
本体系为单纯的扩增体系，不含任何染料、探针等，如对扩增产物有后续的实验要求，可根据具体要求在体系中增加相应的试剂。
本方法的扩增条件具体为94℃预变性5.5min；然后94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸1min，30个循环。本条件为本发明的优选条件，在本发明的扩增条件的基础上做的步骤调整，只要是可以得到两条目标扩增产物，均应认为落入本发明的保护范围之内，本发明的扩增方法不局限于上述具体的扩增条件。
由于本发明是在同一个体系中同时扩增多于一个的dna片段，因此为了提高扩增的特异性，减少非特异性产物，本发明的扩增体系中还包括dmso和/或bsa，dmso和/或bsa的用法和用量可以参考现有技术，在此不做赘述。
优选的，所述扩增方法采用提取后的人全血dna作为扩增模板。
由于引物的特异性好扩增效率高，本发明的另一个目的在于提供一种上述脑梗早期诊断标志物的快速扩增引物组快速扩增试剂盒的用途，即所述快速扩增引物组包括扩增cbs844ins68位点的特异性引物和扩增cbsc699t位点的特异性引物在制备脑梗早期诊断试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明采用多重pcr的扩增方法，同时扩增cbs的多个重要snp位点，且可以根据实际需要灵活选择扩增的位点组合，可以起到一盒多用的作用，试剂盒中的引物特异性高，错配率低，引物长度和tm值设计合理，扩增产物便于检测分离。一次扩增多条目的产物，不仅大大提高了扩增效率，降低了扩增成本。这种检测试剂盒可以扩展延伸到其他的snp位点检测中，具有良好的推广价值。
附图说明
图1是本发明提供的扩增产物的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的一种脑梗早期诊断标志物的快速扩增试剂盒作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
本实施例中的快速诊断试剂盒以cbs作为脑梗早期标志物进行快速扩增诊断，cbs作为脑梗早期标志物，最主要的基因多态性位点是cbs844ins68和cbsc699t，因此本试剂盒基于上述多态性位点进行检测。
本实施例中的快速扩增试剂盒为多重pcr快速扩增试剂盒，包括两对snp位点的上下游扩增引物及扩增模板、taqdna聚合酶、dntps和缓冲液。taqdna聚合酶为takara公司的extaqdna聚合酶。本实施例中的两个模板是cbs844ins68和cbsc699t。
本实施例试剂盒中采用的dna模板为处理后的提取的dna模板，对于采集的人全血或组织来说，需要预先进行处理。如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品pcr的缓冲液，其中含有100mmol/ltris-hcl，50mmol/lkcl，ph9.3～9.5。
一、扩增引物设计
cbs844ins68型基因型序列在ncbi中记载的标号为rs1789953，序列如序列表seqidno:1所示，其中“y”代表snp位点，序列长1101bp，snp位点位于第501位，发生错配时可能发生t/c错配，具体序列如序列表seqidno:1所示，序列具体如下，下划线处表示特异性引物的连接位置：
cttgcgcgatcagcatgcgggcaaaggtgaacgcctcctcatcgttgctcttgaaccacttgtccaccacctgagcaggaccccaccacagcccgtcagcgtgggagccgctcccacgtgaccaagagggtgaacagcctcatggtggaccccgtgtctaggcggtaggaccccagaggtctcaccccagcctctccccctgggatcggcacgtctgcagactttccagttccaacacgttttgcagacagcaaaactgcccgccagccccactgagcatccgtgtgacccacaccggcccttcggtctctgctctccctcaggccaaagtcagctttttggctcttaacagacttttccggggccttaattttcacacgttttccctgctccctgcctgtgccacctgggctacatcccttggtgaggtcaggccacgtgtgcggacatcgtcccccagtctactttgtctcgaccttcgagaccagcttctcaccatgy
gtgcggggcttgcccttctgtttcagtggagaagctggttggggcccagggtcagccaggctccccagtgtgagggtgagttacaggctgcaccggcactgtggccgggctctggactcgacctaccgtcctgtccagcaccgtggggatgaagtcgtagccgatcccttccacctcgtaggttgtctgctccgtctggttcagctcctccggctctgcgaggatggacccttcgggatccaccccaatgatctgcagagggcgcggcttcagggctcaaggccagcaaaagccccgcctggacatgcctcgatattctattatgggagtggccaataccgccgttaacaactgcctgttaatgatctgcctgtgggtggtggcctgttcccagcctcagaggcaggatgagaaacccaagaacccaggctccaagtattaaagcggtaatgacctaaatgttcagtgcagggcgctcagaagtaaaggcaggtgcctgg
cbsc699t型基因型序列在ncbi中记载的标号为rs234706，序列如序列表seqidno:2所示，其中“r”代表snp位点，序列长1101bp，snp位点位于第501位，发生错配时可能发生a/c错配，下划线处表示特异性引物的连接位置：
tccctggaaaagggcccaaggagccggcctcatgcttgtaacagagagtgagctcatcgcagatgtcaccagctctgttctgcagatgaatttgatgccgagtcagggcatgatcccaaatgaagtccaagctgtgagcccagcaccagcctgggccctgaacagactcgctgtctgcattatctgcaggaggagcccctgcagacctgcagagattgctgggtaaacaaatacagccatgccctgtgtttgctattacaggtaaaccacaggcggaggccaagagggcacaacggagggaggaaattgttctagagaaatgctctagaaaagcatttcacagagggaacatttgagctgggttctgaagggtgaataggagttcaccaaggagagggcaagagatgtgtacactcccaggcagccagggataaatgcaatcaagatggacagagggacgcaccatcacactgctgcaggatctcatcagcggtggtgtcr
tagtgagccagggggttgctggcgttgcggtactgcatagaaagagagcagagcccgtgagctgacccctgacacctcagtcacccccacatccctgaccgagaccctcctagggaatgcctgtctccaggccccaggtgcctcacctggtctaggatgtgagaattggggatttcgttcttcagccgccaggccacccccacgtgtgactccggggagtcgaacctggcattggtgggcgtcctcacaatctcagcccccagtgcccgcagcacgtccacctgcaggagggaaagcggtggcctgcaccttccgcctggcccaggcaccctcatcccctgccctatgaccccgcccctggccacgcccacccaccttctcggagctcatcttctctggcatcacgatgatgcagcgatagcccctcactgccgcagccagggccagcccgatccctgagggcacacagagggtgagaggggcccagtgaccccccaagc
根据上述序列设计两对扩增引物，引物序列具体如下表1所示：
表1
二、多重pcr
根据上表1中列出的特异性引物序列，制作引物后进行pcr扩增，其中扩增采用多重pcr的扩增方法，即在同一个扩增体系中同时扩增cbs844ins68位点和cbsc699t位点，因此，本实施例选择25μl的pcr体系，体系中具体包括：
1×pcrbuffer2μl；
mg2+(25mmol/l)1μl；
dntps(25mmol/l)0.6μl；
taq酶(5u/μl)0.3μl；
模板dna2μl；
cbs844ins68位点上下游引物(10μmol/l)各1μl；
cbsc699t位点上下游引物(10μmol/l)各1μl；
无菌双蒸水补齐至25μl。
pcr反应条件：94℃预变性5.5min；然后94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸1min，30个循环。
三、pcr产物验证
选择2％琼脂糖凝胶电泳，电泳图如图1所示，条带1为dnamarker，条带2为扩增产物，条带3为cbs844ins68位点的单独扩增产物，条带4为cbsc699t位点的单独扩增产物，电泳结果证明扩增结果无误。
将电泳结果胶回收后送测序，测序结果也与目的产物序列一致。
验证结果说明本发明中的方法可以快速同时扩增两段cbs的单核苷酸多态性位点片段，扩增产物特异性高，非特异性产物少，该扩增产物可用于各类型的测序或检测工作，应用性强。
四、样本结果统计
本实施例对100例早期脑梗患者及100例正常对照采用上述快速扩增试剂盒进行扩增后测序，测序结果如下表2所示：
表2
由上表2可知，cbs844ins68位点和cbsc699t位点的出现频率对于脑梗早期患者和正常对照之间差异不大，说明两个位点都与早期脑梗无直接的关系，不构成独立危险因素，但由于cbs基因多态性位点存在较强的地域性和民族性，且未考虑其他因素，因此本次结论仅针对本实施例中的检测结果。但通过对于脑梗患者的大量其他疾病征兆的检测，发现当cbs844ins68位点和cbsc699t位点均发生变异时，被测者血浆hcy水平有显著提高，说明这两个位点的联合作用对于脑梗患者具有一定的指向作用。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
序列表
<110>广东新开源达乐生物科技有限公司
<120>一种脑梗早期诊断标志物的快速扩增试剂盒及扩增方法
<130>2018
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1001
<212>dna
<213>homosapiens
<220>
<221>gene
<222>（1）..（1001）
<223>cbs844ins68位点基因序列
<400>1
cttgcgcgatcagcatgcgggcaaaggtgaacgcctcctcatcgttgctcttgaaccact60
tgtccaccacctgagcaggaccccaccacagcccgtcagcgtgggagccgctcccacgtg120
accaagagggtgaacagcctcatggtggaccccgtgtctaggcggtaggaccccagaggt180
ctcaccccagcctctccccctgggatcggcacgtctgcagactttccagttccaacacgt240
tttgcagacagcaaaactgcccgccagccccactgagcatccgtgtgacccacaccggcc300
cttcggtctctgctctccctcaggccaaagtcagctttttggctcttaacagacttttcc360
ggggccttaattttcacacgttttccctgctccctgcctgtgccacctgggctacatccc420
ttggtgaggtcaggccacgtgtgcggacatcgtcccccagtctactttgtctcgaccttc480
gagaccagcttctcaccatgygtgcggggcttgcccttctgtttcagtggagaagctggt540
tggggcccagggtcagccaggctccccagtgtgagggtgagttacaggctgcaccggcac600
tgtggccgggctctggactcgacctaccgtcctgtccagcaccgtggggatgaagtcgta660
gccgatcccttccacctcgtaggttgtctgctccgtctggttcagctcctccggctctgc720
gaggatggacccttcgggatccaccccaatgatctgcagagggcgcggcttcagggctca780
aggccagcaaaagccccgcctggacatgcctcgatattctattatgggagtggccaatac840
cgccgttaacaactgcctgttaatgatctgcctgtgggtggtggcctgttcccagcctca900
gaggcaggatgagaaacccaagaacccaggctccaagtattaaagcggtaatgacctaaa960
tgttcagtgcagggcgctcagaagtaaaggcaggtgcctgg1001
<210>2
<211>1001
<212>dna
<213>homosapiens
<220>
<221>gene
<222>（1）..（1001）
<223>cbsc699t位点基因序列
<400>2
tccctggaaaagggcccaaggagccggcctcatgcttgtaacagagagtgagctcatcgc60
agatgtcaccagctctgttctgcagatgaatttgatgccgagtcagggcatgatcccaaa120
tgaagtccaagctgtgagcccagcaccagcctgggccctgaacagactcgctgtctgcat180
tatctgcaggaggagcccctgcagacctgcagagattgctgggtaaacaaatacagccat240
gccctgtgtttgctattacaggtaaaccacaggcggaggccaagagggcacaacggaggg300
aggaaattgttctagagaaatgctctagaaaagcatttcacagagggaacatttgagctg360
ggttctgaagggtgaataggagttcaccaaggagagggcaagagatgtgtacactcccag420
gcagccagggataaatgcaatcaagatggacagagggacgcaccatcacactgctgcagg480
atctcatcagcggtggtgtcrtagtgagccagggggttgctggcgttgcggtactgcata540
gaaagagagcagagcccgtgagctgacccctgacacctcagtcacccccacatccctgac600
cgagaccctcctagggaatgcctgtctccaggccccaggtgcctcacctggtctaggatg660
tgagaattggggatttcgttcttcagccgccaggccacccccacgtgtgactccggggag720
tcgaacctggcattggtgggcgtcctcacaatctcagcccccagtgcccgcagcacgtcc780
acctgcaggagggaaagcggtggcctgcaccttccgcctggcccaggcaccctcatcccc840
tgccctatgaccccgcccctggccacgcccacccaccttctcggagctcatcttctctgg900
catcacgatgatgcagcgatagcccctcactgccgcagccagggccagcccgatccctga960
gggcacacagagggtgagaggggcccagtgaccccccaagc1001
<210>3
<211>18
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<221>misc_feature
<222>（1）..（18）
<223>cbs844ins68基因正向引物序列
<400>3
tgccacctgggctacatc18
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<221>misc_feature
<222>（1）..（21）
<223>cbs844ins68基因反向引物序列
<400>4
acggagcagacaacctacgag21
<210>5
<211>22
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<221>misc_feature
<222>（1）..（22）
<223>cbsc699t基因正向引物
<400>5
caatcaagatggacagagggac22
<210>6
<211>18
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<221>misc_feature
<222>（1）..（18）
<223>cbsc699t基因反向引物
<400>6
ctggcggctgaagaacga18