本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及一种头颈部鳞癌标志物引物组合、检测试剂盒及其定量检测方法。
背景技术：
：头颈部鳞癌(squamouscellcarcinomaofheadandneck，scchn)是世界范围内第6大常见肿瘤。头颈部鳞癌包括喉癌、口腔癌、鼻咽癌、下咽癌等。2010年，美国疾病控制中心的统计结果表明，全球每年约50万人患头颈鳞癌，死亡人数约为12000人。近年来，虽然包括手术、放化疗等各种治疗方法均取得了巨大进展，但由于技术水平等诸多可观因素的限制，很多肿瘤在发现时已发展至中晚期，治疗手段局限，治疗效果及预后较差，生存率一直较低，头颈部鳞癌的5年生存率并没有明显提高，仍在60％左右。而早期肿瘤体积小，较少转移，如适时进行治疗可有效的控制肿瘤发展，治愈率可达83％，因此积极开展肿瘤的早期发现、诊断和早期治疗的研究，对于癌症的预防和控制有着重要的意义。在临床上，外周血及其他体液的检测具有创伤小、可重复、可于同一时间点进行检测多项指标等优点，是疾病早期诊断的理想手段。在肺癌、肝癌等癌症的早期预防和诊断应用中，外周血肿瘤标志物的检测已成为重要的临床依据，如甲胎蛋白、癌抗原125、人癌胚抗原等。与口腔鳞状细胞癌(oscc)相关的血清及唾液肿瘤标志物如cyfra21-1、tps、cea、scc、ca125和ca19-9也有许多研究，然而其在头颈部鳞癌症诊断中，由于缺乏灵敏性及特异性，并没有得到广泛应用。因此，寻找可以作为头颈部鳞癌诊断的肿瘤标志物及其检测方法，可以开拓头颈部鳞癌早期诊断的新方法，具有迫切的临床需求和广阔的应用前景。技术实现要素：基于此，有必要提供一种简便使用的头颈部鳞癌标志物引物组合、检测试剂盒及其定量检测方法。一种用于检测头颈部鳞癌标志物的引物组合，包括用于mir-10b定量检测的正向引物、用于mir-31定量检测的正向引物、用于mir-24定量检测的正向引物中的至少一种。在其中一个实施例中，所述引物组合包括用于mir-10b定量检测的正向引物、所述用于mir-31定量检测的正向引物、所述用于mir-24定量检测的正向引物中的两种或三种的组合。在其中一个实施例中，所述用于mir-10b定量检测的正向引物的序列如seqidno.1所示。在其中一个实施例中，所述用于mir-31定量检测的正向引物的序列如seqidno.2所示。在其中一个实施例中，所述用于mir-24定量检测的正向引物的序列如seqidno.3所示。一种头颈部鳞癌标志物检测试剂盒，包括用于定量检测mir-10b、mir-31、mir-24中的至少一种的定量检测试剂。在其中一个实施例中，所述定量检测试剂包括所述的用于检测头颈部鳞癌标志物的引物组合。在其中一个实施例中，所述定量检测试剂还包括反向引物，所述反向引物的序列如seqidno.4所示。在其中一个实施例中，所述定量检测试剂还包括pcr反应试剂，所述pcr反应试剂包括逆转录pcr反应试剂和实时定量pcr反应试剂。一种头颈部鳞癌标志物的定量检测方法，包括以下步骤：取预定量的待检测样品，提取总rna；将所述总rna与逆转录pcr反应试剂混合，以所述总rna为模板进行逆转录pcr反应，得到cdna；将所述的用于检测头颈部鳞癌标志物的引物组合，以及反向引物、所述cdna和实时定量pcr反应试剂混合，以所述cdna为模板进行定量pcr反应，定量扩增所述mir-10b、mir-31或mir-24；以及对所述定量pcr反应的结果进行分析。在其中一个实施例中，所述待检测样品为血清或者血浆。以mir-10b、mir-31或mir-24作为头颈部鳞癌标志物，以总rna为模板，利用mir-10b定量检测的引物、mir-31定量检测的引物和mir-24定量检测的引物，进行pcr反应，通过对mir-10b、mir-31或mir-24的表达量进行分析，能够作为头颈部鳞癌早期诊断的判断依据，为临床诊疗赢得宝贵的抢救时间。利用所述头颈部鳞癌标志物检测试剂盒作为预测头颈部鳞癌发病性的体外检测方法，具有成本低廉、操作方便、特异性强的优点，甚至能够实现无创性检测。附图说明图1为本发明一实施例的血清中mir-10b的相对表达量示意图；图2为本发明一实施例的血清中mir-31的相对表达量示意图；图3为本发明一实施例的血清中mir-24的相对表达量示意图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明的头颈部鳞癌标志物引物组合、检测试剂盒及其定量检测方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。由于微小核糖核酸(microrna)在基因转录后的表达调控中起着超乎想象的重要作用，因此它与疾病存在以下的关联性：首先，微小核糖核酸的变化可能是病因，当微小核糖核酸本身先发生了紊乱表达，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生。其次，微小核糖核酸的变化也可能是疾病的结果，这是因为当疾病(如癌症)发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增，若微小核糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。因此，理论上微小核糖核酸分子完全可以作为一类新的疾病标记物，它的特异性变化必然与疾病产生发展相关联。为寻找头颈部鳞癌标记物并对其进行准确检测，本发明发明人首先对山东大学附属山东省立医院的364个头颈部鳞癌标本及66个正常组织进行差异基因表达分析，得到差异表达的microrna为mir-10b、mir-31、mir-24。为验证mir-10b、mir-31、mir-24是否可以作为头颈部鳞癌的标志物，对山东大学附属山东省立医院的78例行头颈部鳞癌切除术的患者的肿瘤组织进行病理学分析,评价肿瘤的组织学分级、转移和肿瘤包膜完整性情况，以及对组织对应的血清采用实时定量pcr检测mir-10b、mir-31、mir-24的表达。以80例正常人血清中的microrna水平为对照，经过验证表明头颈部鳞癌患者血清中的mir-10b、mir-31、mir-24的表达量高于正常人，mir-10b、mir-31、mir-24可以作为头颈部鳞癌的标志物。通过上述对血清或血浆微小核糖核酸与头颈部鳞癌的相关性的研究，发明人提出了以血清或血浆中稳定存在的特定微小核糖核酸作为头颈部鳞癌检测标记物，建立一种体外检测血清或血浆中稳定存在的特定微小核糖核酸的方法，通过检测特定微小核糖核酸的特异性变化来进行头颈部鳞癌的早期诊断、疾病鉴定和病程监控、复发及预后、并发症发生的预测，同时可以进一步进行药效判定、用药指南、个体化治疗、中药有效成份筛选和种群分类等研究。本发明实施例首先提出一种头颈部鳞癌标志物，包括在人体血清或者血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体mir-10、mir-31和mir-24中的至少一种。所述头颈部鳞癌标志物在头颈部鳞癌患者样品和正常人体样品的血清或者血浆中表达量不同，通过对被检测样品的所述头颈部鳞癌标志物的表达量进行检测，判断是否存在差异性表达，对受试者是否存在头颈部鳞癌的患病几率进行预估。如果仅对一种所述头颈部鳞癌标志物进行检测，可能会受到偶然性因素，如受试者的个人身体状况、周围环境、其他与所述头颈部鳞癌标志物表达相关因素等因素的干扰，使检测结果的可信度不高。优选的，所述头颈部鳞癌标志物包括mir-10、mir-31和mir-24中的两种或三种的组合。对所述三种头颈部鳞癌标志物的任意两种组合或者三种组合的表达量进行综合分析，对受试者是否存在患有头颈部鳞癌的风险进行评估，提高预测的可靠性。将改进单一的标记物所难以克服的个体差异(即年龄、性别、种族、饮食和环境等)所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高疾病的临床检出率和实现疾病的早期诊疗。本发明实施例提供一种头颈部鳞癌标志物的定量检测方法，包括以下步骤：s100，取预定量的待检测样品，提取总rna；s200，将所述总rna与逆转录pcr反应试剂混合，以所述总rna为模板进行逆转录pcr反应，得到cdna；s300，将用于mir-10b定量检测的正向引物、用于mir-31定量检测的正向引物和用于mir-24定量检测的正向引物中的一种，以及反向引物、所述cdna和实时定量pcr反应试剂混合，以所述cdna为模板进行定量pcr反应，定量扩增所述mir-10b、mir-31或mir-24；以及s400，对所述定量pcr反应的结果进行分析。在步骤s100中，提取的总rna可以为待检测样品中全部种类的rna或者为总microrna，以总microrna作为后续实验的模板能够增加试验结果的准确性，避免除microrna外其他种类的rna的干扰。在步骤s400中，所述pcr扩增的结果分析方法可以包括电泳法和实时荧光定量分析法。所述电泳法为通过对s300后得到的反应液进行电泳，通过电泳条带的分子量或者电泳条带的深浅来分析待扩增的mir-10b、mir-31或mir-24的表达量。所述实时荧光定量分析为通过分析实时定量荧光pcr反应的荧光曲线来分析待扩增的mir-10b、mir-31或mir-24的表达量。所述检测方法中所使用的待检测样品可以为血清或血浆，所述血清或血浆可以来源于山东大学附属山东省立医院受试者活体、组织、器官和/或尸体。在一实施例中，检测微小核糖核酸的方法为逆转录聚合酶链式反应方法(rt-pcr)。在所述rt-pcr方法中，所述s400步骤为对s300得到的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后的凝胶用eb染色后在紫外灯下观察结果并拍照来分析电泳条带的分子量和深浅。在另一实施例中，检测微小核糖核酸的方法为实时定量pcr反应方法(real-timepcr)。在所述real-timepcr方法中，所述步骤s300还包括：加入荧光探针例如evagreen染料进行pcr反应。所述步骤s400为对s300得到的pcr产物的荧光数据进行分析处理数据并比较结果，通过荧光数据分析患者血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化。本发明实施例还提供一种用于检测所述头颈部鳞癌标志物的引物组合，包括用于mir-10b定量检测的正向引物、用于mir-31定量检测的正向引物、用于mir-24定量检测的正向引物中的至少一种。所述引物组合可以应用于所述头颈部鳞癌标志物的定量检测方法中，作为所述头颈部鳞癌标志物定量检测中的pcr引物，特异性表达所述头颈部鳞癌标志物。通过对pcr后所述头颈部鳞癌标志物的扩增量进行分析，来判断受试者的头颈部鳞癌患病相关性。优选地，所述引物组合包括用于mir-10b定量检测的正向引物、用于mir-31定量检测的正向引物、用于mir-24定量检测的的正向引物中的中的任意两种的组合或者三种的组合。通过对所述三种头颈部鳞癌标志物的任意两种组合或者三种组合的表达量进行综合分析，对受试者是否存在患有头颈部鳞癌的风险进行评估，提高预测的可靠性。优选的，所述引物组合包括用于mir-10b定量检测的正向引物、用于mir-31定量检测的正向引物和用于mir-24定量检测的正向引物的三种的组合。在一实施例中，所述用于mir-10b定量检测的正向引物的序列如seqidno.1所示，所述用于mir-31定量检测的的正向引物的序列如seqidno.2所示，所述用于mir-24定量检测的正向引物的序列如seqidno.3所示。在实际应用中，所述引物序列可以存在1-3个碱基的偏差，不会影响扩增的结果。本发明实施例还提供了一种用于检测头颈部鳞癌标记物的试剂盒，也即预测、诊断、鉴别和/或评价头颈部鳞癌的试剂盒，所述试剂盒包括用于定量检测mir-10b、mir-31、mir-24中的至少一种的定量检测试剂。优选地，所述定量检测试剂包括上述用于检测头颈部鳞癌标记物的引物组合，所述引物组合可以对mir-10b、mir-31或mir-24进行定量的特异性检测。由于对头颈部鳞癌患者及正常人的mir-10b、mir-31或mir-24的表达量进行的统计学分析，判断是否存在患有头颈部鳞癌疾病存在一个临界值(cut-off值)，将所述试剂盒的检测结果与所述临界值进行比较即可对患病风险进行预估。优选的，所述试剂盒还包括反向引物和pcr反应试剂。所述反向引物为通用引物，用于与特异性的mir-10b定量检测的正向引物、mir-31定量检测的正向引物或mir-24定量检测的的正向引物进行配合，通过pcr反应定量检测mir-10b、mir-31或mir-24的表达量。在一实施例中，所述反向引物的序列如seqidno.4所示。在实际应用中，所述引物序列可以存在1-3个碱基的偏差，不会影响扩增的结果。具体地，所述用于mir-10b定量检测的正向引物、所述用于mir-31定量检测的正向引物、所述用于mir-24定量检测的正向引物、所述反向引物的序列如表1所示。表1引物序列mirna对应的引物序列(5’-3’)序列编号mir-10bacactccagctgggtaccctgtagaaccgaaseqidno.1mir-31acactccagctgggatggcaatatgttggcseqidno.2mir-24acactccagctgggtggctcagttcagcagseqidno.3反向引物tggtgtcgtggagtcgseqidno.4优选地，对microrna的定量检测可以包括逆转录pcr反应步骤和定量pcr反应步骤，通过逆转录pcr反应步骤得到cdna，通过所述引物组合和反向引物配合对cdna进行特异性定量pcr反应来特异性表达microrna。所述pcr反应试剂包括逆转录pcr反应试剂和实时定量pcr反应试剂，所述逆转录pcr反应试剂和实时定量pcr反应试剂包括聚合酶、dntp、atp等。更优选的，将筛选出来的与头颈部鳞癌相关的特异性变化的所述引物组合、反向引物和pcr反应试剂组合起来，共同组成检测头颈部鳞癌标记物的试剂盒。所述头颈部鳞癌标志物检测试剂盒以mir-10b、mir-31或mir-24作为头颈部鳞癌标志物，以总rna为模板，利用mir-10b定量检测的引物、mir-31定量检测的引物和mir-24定量检测的引物，进行特异性pcr反应，通过对mir-10b、mir-31或mir-24的表达量进行分析，能够作为头颈部鳞癌早期诊断的判断依据，不仅为临床诊疗赢得宝贵的抢救时间，而且具有成本低廉、操作方便、特异性强的优点。所述头颈部鳞癌标志物检测试剂盒的检测样品能够较易获得，优选的，所述检测样品为常规体检中就可以收集到的血液。由于微小核糖核酸分子由19-23个核苷酸单元组成，具有结构上的特殊性和相对稳性，存在于血清或血浆中，作为全身组织器官的多种信号分子。血液会循环至全身所有组织，并向细胞输送营养并清除废物，因此血液能够反映出整个机体的生理病理状况，其检测结果对人体健康具有指导意义。实施例1步骤s100，血液中总microrna的提取和浓度测定采用microrna提取试剂盒(宝生物工程有限公司，)提取组织标本中总microrna。提取过程为：用0.1％质量浓度的depc(焦碳酸二乙酯)水溶液浸泡所有用到的塑料制品和玻璃制品过夜，然后进行如下实验操作：(1)分别收集78例头颈部鳞癌患者和80例正常人的血液样品于冻存管中，放入液氮运输，于-80摄氏度冰箱保存，6个月之内使用有效；(2)向5ml步骤(1)的血液样品中加入2mlmicrorna提取试剂(micrornaisoplus)，反复抽吸，混匀，吸取转移到去rna酶的1.5ml离心管中，室温静置15min；(3)向步骤(2)得到的液体中加入0.2ml氯仿，剧烈混匀45s，或仪器震荡30s，室温下静置30min；(4)4摄氏度，12000rpm离心15min，小心取上清至另一干净去rna酶的1.5ml离心管中；(5)向装有上清的离心管中加入0.5ml异丙醇，缓缓的上下颠倒混匀(避免剧烈震荡使rna断裂)，室温下静置15～30min；(6)4摄氏度，12000rpm离心10min弃上清；(7)加入lml75％酒精，于旋涡混匀器上震荡混匀；(8)4摄氏度，12000rpm离心5分钟；(9)去上清液，用滤纸吸除残余沉淀物及离心管上的上清液，将离心管放置超净工作台中5～10min；(10)在离心管的沉淀物中加入0.1％质量浓度的depc水溶液20～50μl，得到总microrna溶液；(11)取2μl步骤(10)得到的总microrna溶液溶于0.1ml水中，分别测波长230nm、260nm和280nm下总microrna溶液的吸光度od230，od260和od280；(12)提取的总microrna溶液样品于80摄氏度保存。步骤s200，poly(a)加尾法修饰microrna和逆转录pcr(1)取300-500ugs100步提取的总microrna样品，利用逆转录试剂盒(宝生物工程有限公司，sybrprimescripttmmirnart-pcr试剂盒)，在pcr仪(thermoscientific公司，型号aappliedbiosystems7900htfastrealtimepcrsystem)上进行逆转录pcr反应，得到cdna；(2)向第一步处理得到的cdna反应液中添加去rna酶的水，补足至液体总量100μl，形成cdna稀释液。步骤s300，实时荧光定量pcr(1)实时定量pcr按照sybrprimescripttmmirnart-pcr试剂盒的说明书进行操作，加入1μl所述mir-10b定量检测的正向引物、所述mir-31定量检测的正向引物和所述mir-24定量检测的正向引物中的一种，并加入1μl所述反向引物、2μl第二步得到的cdna稀释液，按组分在冰上配置反应液体；(2)在pcr仪(thermoscientific公司，型号aappliedbiosystems7900htfastrealtimepcrsystem)上，进行实时荧光定量pcr反应；步骤s400，实验结果分析采集s300步荧光定量pcr反应得到的荧光数据，经pcr控制分析软件(thermo公司，型号aappliedbiosystems7900htfastrealtimepcrsystem)得到循环阈值(ct值)，制作pcr定量的标准曲线，计算得到microrna的表达量。请参阅图1-3和表2，分别以78例头颈部鳞癌患者和80例正常人的microrna为模板，以u6作为对照(u6是分子量为100bp的snrna，作为微小核糖核酸实验的内参照分子)，得到特异性mir-10b、mir-31或mir-24的相对表达量结果。表2microrna的平均表达量结果确定各个mirna的cut-off值(临界值)按照敏感性及特异性最大化原则，对上述pcr反应结果的数据进行分析，对比头颈部鳞癌患者和正常人的实验数据，制作mirna表达下的roc曲线(ibmspssstatistic16.0软件)，根据敏感性与特异性确定血清中mirna表达的cut-off值。血清中的cut-off值：mir-10b3.0×10-3mir-312.7×10-4mir-249.2×10-3使用头颈部鳞癌标志物检测试剂盒进行受试者检测取5ml受试者的血液样品，利用mir-10b定量检测的正向引物、所述mir-31定量检测的正向引物和所述mir-24定量检测的正向引物，按照实施例1的实验步骤进行定量pcr反应。定量pcr反应得到的结果与mir-10b、mir-31及mir-24的cut-off值进行对比，如果受试者的mir-10b、mir-31或mir-24的表达值大于cut-off值，则判断该受试者存在患有头颈部鳞癌疾病的风险。进一步，如果受试者的mir-10b、mir-31和mir-24的表达值均大于cut-off值，则判断该受试者患有头颈部鳞癌疾病的几率很大。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>山东省立医院<120>头颈部鳞癌标志物引物组合、检测试剂盒及其定量检测方法<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1acactccagctgggtaccctgtagaaccgaa31<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2acactccagctgggatggcaatatgttggc30<210>3<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3acactccagctgggtggctcagttcagcag30<210>4<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tggtgtcgtggagtcg16当前第1页12