用于检测人乳头瘤病毒并提供头颈部鳞状细胞癌预后的方法
【专利摘要】本发明描述了用于头颈部鳞状细胞癌的诊断及确定其预后的方法和试剂盒。一种用于诊断受试者中的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的示例性方法可包括测定得自所述受试者的唾液样品的总蛋白、solCD44和HPV的存在性，以及在多变量分析中使用总蛋白、HPV和CD44水平的组合以确定综合分数，分数增加到截止点以上因而将患有HNSCC、或其将来复发风险升高的受试者与没有HNSCC或其将来复发风险较低的受试者区分开来。
【专利说明】用于检测人乳头瘤病毒并提供头颈部鱗状细胞癌预后的方 法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2011年11月15日提交的美国临时专利申请第61/559, 974号以 及2012年6月1日提交的美国临时专利申请第61/654,595号的优先权权益，它们各自整 体以引用方式并入本文。
[0003] 政府支持确认
[0004] 本发明根据国立卫生研究院的第R01CA118584-NIH号资助在政府支持下完成。政 府享有本发明的某些权利。
【技术领域】
[0005] 本文所公开的主题一般涉及用于头颈部鳞状细胞癌的检测、治疗和预后的方法和 试剂盒。
[0006] 发明背景
[0007] 头颈部鳞状细胞癌（HNSCC)每年在美国影响着50,000人并在全世界影响着 600, 000人。主要风险因素包括吸烟和饮酒以及人乳头瘤病毒（HPV)感染。
[0008] 迄今为止，尚无得到广泛接受的HNSCC筛查方案或检验（参见例如Vokes等 人，N Engl J Med, 328:184-94 (1993) ;Lingen 等人，Curr Opin Oncol, 13:176-82 (2001); Forastiere 等人，N Engl J Med345:1890-1900 (2001) ；Patton, Orol 0ncol,39:708-723(2003) ;0, Hara 等人，Clin 0tolaryngol,27:133-4(2002); Smart，Cancer72:1061-5(1993) ;Sankaranarayanan 等人，Cancer,88:664-73(2000); Sankaranarayanan 等人，Lancet365:1927-33(2005))，原因是金标准（通过体检 筛查然后进行活组织检查）具有有限的灵敏性和特异性（分别为64 %和74 % ) (Brocklehurst 等人，Cochrane Database Syst Rev, 11:CD004150(2010))并且分子 诊断测试仍在开发中（Nagler, Oral Oncol.，45:1006-10 (2009) ;Mahfouz 等人，Eur Arch Otorhinolaryngol，267:851-60 (2010))。使用染料、自体荧光或脱落细胞学 的检测口腔癌的辅助技术是可用的，但是最近的评论提出了它们是否改善早期检出 率的疑问（Patton 等人，J Am Dent Assoc, 139:896-905(2008) ;Lingen 等人，Oral 0ncol44:10-22(2008))。因此，努力已集中于分子诊断工具。测试唾液的RNA表达谱 的多项研究（Li 等人，Clin Cancer Res, 10:8442-8450(2004))、微 RNA 发现（Park 等 人，Clin Cancer Res, 15:5473-5477 (2009))和蛋白质组学分析（Hu 等人，Clin Cancer Res, 14:6246-6252 (2008))显示出前景，但是有些复杂并且未得到验证（Nagler, Oral Oncol.，45:1006-10 (2009) ;Mahfouz 等人，Eur Arch Otorhinolaryngol，267:851-60 (2010 ))。因此，大部分患者在晚期才被诊断，此时治愈率为40%或更低。因此，需要早期检测测 试。 发明概要
[0009] 根据在本文具体体现并广泛描述的所公开的材料、化合物、组合物和方法的目的， 所公开的主题在一个方面涉及用于头颈部鳞状细胞癌检测、治疗及提供其预后的方法和试 剂盒。
[0010] 另外的优点将在下文的描述中部分地示出，并部分地将通过该描述显而易见，或 可通过实践下述方面得以了解。下述优点将通过在所附权利要求书中具体指出的要素和组 合而实现和得到。应当理解，前文一般性描述和下文详细描述均仅仅为示例性和阐释性的， 而非限制性的。
[0011] 附图简述
[0012] 图1A至1B是示出了研究中的患者的无进展生存率（PFS)(图1A)和总生存率（0S) (图1B)的图。图1C是示出了在12、24和36个月的中位PFS、PFS率和0S的表格。图1D 是示出了总、中位、最小、最大、平均0S和PFS以及标准偏差的表格。
[0013] 图2A至2RR是示出了如下表征的受试者中的PFS(图2A、2C、2E、2G、2I、2K、2M、 20、2Q、2S、2U、2W、2Y、2AA、2CC、2EE、2GG、2II、2KK、2MM、200、2QQ)和 0S(图 2B、2D、2F、2H、 2J、2L、2N、2P、2R、2T、2V、2X、2Z、2BB、2DD、2FF、2HH、2JJ、2LL、2NN、2PP、2RR)的图：pl6 细胞 核对细胞质/无染色（图2A-2B)、pl6+对pl6_染色（图2C-2D)、solCD44彡10ng/ml对 solCD44〈10ng/ml (图 2E-2F)、总蛋白〈lmg/ml 对彡总蛋白 lmg/ml (图 2G-2H)、CD44 染色 对⑶44无染色（图21-2J)、⑶44仅细胞膜/普遍染色对⑶44无染色/其他（图2K-2L)、 EGFR细胞膜和细胞质染色对EGFR细胞膜和细胞质无染色/其他（图2M-2N)、EGFR细胞膜 和细胞质对其他对无染色（图20-2P)、EGFR细胞膜对细胞质/无染色（图2Q-2R)、EGFR细 胞膜对仅细胞质对无染色（图2S-2T)、角质化对非角质化（图2U-2V)、现时吸烟者对未/ 曾吸烟者（图2W-2X)、无酒精对轻度/中度酒精对重度酒精暴露（图2Y-2Z)、重度对轻度 /无酒精暴露（图2AA-2BB)、唇和口腔癌对口咽癌（图2CC-2DD)、I/II期对III/IV期癌 (图 2EE-2FF)、I/II/III 期对 IV 期癌（图 2GG-2HH)、T1-T3 对 T4 癌（图 2II-2JJ)、N0 对 Nl-N3、Nx (图2KK-2LL)、女性对男性（图2MM-2NN)、白人对黑人（图200-2PP)或西班牙对 非西班牙人（图2QQ-2RR)。
[0014] 图3A-3C是示出了⑶44过表达增加了增殖（图3A)、迁移（图3B)和顺钼耐药性 (图3C)的图。
[0015] 图4A是⑶44下调的稳定克隆的Western印迹。图4B是示出了与乱序或野生型 CAL27相比对于两个⑶44siRNA克隆而言在裸小鼠中的肿瘤生长抑制。
[0016] 图5包括组织学载玻片，其示出了在用⑶44siRNA或乱序序列处理后在CAL27异 种移植物中的CD44、EGFR和pEGFR(Y1068)染色。CD44下调抑制CAL27异种移植物中的 EGFR表达及其磷酸化（Y1068)。
[0017] 图6示出了 pl6_癌症中pl6、⑶44和EGFR的免疫组织化学（IHC)染色，其中pl6 染色为细胞质和扩散的。在此情况下，CD44在细胞膜以及在整个肿瘤中普遍染色。CD44和 EGFR在细胞膜上共定位，并且也存在一定的EGFR细胞质染色。
[0018] 图7示出了 pl6+肿瘤中pl6、CD44和EGFR的IHC染色，其中对于pl6而言细胞核 强烈染色，并且也存在一定的细胞质染色。然而，CD44细胞膜染色丧失，仅入侵淋巴细胞保 持⑶44表达。EGFR表达完全未观察到。 具体实施万式
[0019] 本文所述的材料、化合物、组合物和方法可通过参考所公开主题的具体方面的以 下详细描述以及其中所含的实施例而容易地理解。
[0020] 在公开和描述本发明的材料、化合物、组合物和方法之前，应当理解下述方面不限 于具体的合成方法或具体的试剂，因为它们当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语只 是为了描述特定的方面，并非旨在进行限制。
[0021] 另外，在此整个说明书中，参考了各种出版物。这些出版物的公开内容整体据此以 引用方式并入本申请，以便更全面地描述所公开的主题所属的现有技术。所公开的参考文 献对于在该参考文献所处的句子中讨论的其所含内容也单独地且具体地以引用方式并入 本文。
[0022] 定义
[0023] 在本说明书及其之后的权利要求书中，将提及许多术语，它们应被定义为具有以 下含义：
[0024] 在整个说明书和权利要求书中，词语"包括"及该词语的其他形式（诸如"包含"和 "含有"）意指包括但不限于，而并非意图将其他添加剂、组分、整数或步骤排除在外。
[0025] 如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式"一"、"一个/种"和"该/所述" 包括多个指代物，除非上下文另有明确指出。
[0026] "任选的"或"任选地"意指随后描述的事件或情况会发生或不会发生，并且该描述 包括其中所述事件或情况发生的情形以及不发生的情形。
[0027] 范围可在本文表示为从"约" 一个特定值和/或至"约"另一个特定值。"约"可意 指指定值的5%以内。当表达这样的范围时，另一个方面包括从所述一个特定值和/或至另 一个特定值。相似地，当通过使用先行词"约"将值表示为近似值时，应当理解，所述特定值 形成另一个方面。还应当理解，范围每一个的端点在与另一个端点的关系中均是重要的并 独立于另一个端点。也应当理解，存在本文所公开的许多值，并且每个值也在本文公开为除 了该值本身外还包括"约"该特定值。例如，如果公开了值"2000"，则也公开了"约2000"。 也应当理解，当公开一个值时，则也公开了"小于或等于该值"、"大于或等于该值"以及值之 间的可能范围，如技术人员适当地理解。例如，如果公开了值"2000"，则也公开了"小于或等 于2000"以及"大于或等于2000"。也应当理解，在整个申请中，以许多不同的格式提供了 数据，并且该数据代表端点和起点以及数据点任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据 点"10"和特定数据点"15"，则应当理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10 和15以及10和15之间也应被视为进行了公开。也应当理解，还公开了两个特定单位之间 的每个单位。例如，如果公开了 1〇和15,则也公开了 11、12、13和14。
[0028] 在说明书和最后的权利要求书中提及组合物中特定要素或组分的重量份是指组 合物或制品中该要素或组分与任何其他要素或组分之间以重量份表示的重量关系。因此， 在包含2重量份组分X和5重量份组分Y的配混物中，X和Y以2:5的重量比存在，并且无 论组合物中是否包含另外的组分均以该比率存在。
[0029] 除非具体指出有相反含义，否则组分的重量百分比（重量％ )基于包含该组分的 制剂或组合物的总重量。
[0030] 术语"个体"、"宿主"、"受试者"和"患者"可互换使用以指代为诊断、预后、施用或 治疗目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如，哺乳动物。因此，受试者可以是人类 或兽医患者。
[0031] "生物标志物"是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达 水平相比发生改变的任何基因或蛋白。
[0032] 术语"预后"是本领域中公认的并包括关于疾病的可能过程或疾病进展的预测， 特别是关于疾病缓解、疾病再现、肿瘤复发、转移和死亡的可能性。"良好预后"是指受癌症 (诸如头颈部鳞状细胞癌）影响的患者将保持无疾病（即，无癌症）的可能性。"不良预后" 意在表示潜在癌症或肿瘤的再现或复发、转移或死亡的可能性。被归类为具有"良好转归" 的癌症患者保持无潜在癌症或肿瘤。相比之下，"不良转归"的癌症患者经历疾病再现、肿 瘤复发、转移或死亡。在特定的实施方案中，用于评估预后和转归的时间范围为例如短于一 年、一年、两年、三年、四年、五年、六年、七年、八年、九年、十年、十五年、二十年或更多年。如 本文所用，用于评估预后或无疾病生存时间的相关时间从手术摘除肿瘤或肿瘤生长得到控 制、减轻或抑制开始。因此，例如，在特定的实施方案中，"良好预后"是指头颈部鳞状细胞癌 患者将保持无潜在癌症或肿瘤至少五年的一段时间，更特别是至少十年的一段时间的可能 性。在本发明的另外方面，"不良预后"是指头颈部鳞状细胞癌患者在短于五年，更特别是短 于十年内经历疾病再现，肿瘤复发、转移或死亡的可能性。上面提供的用于评价预后和转归 的时间范围是例证性的，并非意图进行限制。
[0033] 术语"治疗"是指以治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症为目的对患者进 行的医学管理。该术语包括积极疗法，即专门以改善疾病、病理状态或病症为目的的治疗， 并且还包括病因治疗，即以除去相关疾病、病理状态或病症的病因为目的的治疗。此外，该 术语还包括姑息治疗，即设计用于缓解症状而非治愈疾病、病理状态或病症的治疗；预防性 治疗，即以最大程度降低或者部分或完全抑制相关疾病、病理状态或病症的发展为目的的 治疗；以及支持性治疗，即用于补充另一种以改善相关疾病、病理状态或病症为目的的特定 疗法的治疗。
[0034] 术语"抗体"是指选择性结合目标抗原的天然或合成抗体。该术语包括多克隆和 单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子外，那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物以及选 择性结合目标抗原的免疫球蛋白分子的人类或人源化形式也包括在术语"抗体"的范围内。
[0035] 另外，本文公开的是可用于所公开的方法和组合物的产品、可与所公开的方法和 组合物的产品联合使用、可用于制备所公开的方法和组合物的产品或为所公开的方法和组 合物的产品的材料、化合物、组合物和组分。这些及其他材料在本文予以公开，并且应当理 解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、群组等时，虽然可能不会明确地具体提及这些 化合物的每一个和集体组合以及排列，但是在本文具体设想和描述每一个。例如，如果公开 了一种组合物并且讨论了可对该组合物的许多组分进行的许多修改，则除非具体地相反指 出，否则具体设想了可能的每一种组合和排列。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不 限于组合物以及在制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行 的多个另外的步骤，则应当理解，这些另外的步骤的每一个可通过所公开的方法的任一具 体的方面或多个方面的组合而执行，并且具体设想了每一个这样的组合，它们应被视为都 予以了公开。
[0036] 现在将详细参考所公开的材料、化合物、组合物、组分、装置、制品和方法的具体方 面，其实例在以下的描述和实施例中以及在附图及其之前和以下的描述中不出。
[0037] 生物标志物测定法
[0038] 描述了用于头颈部鳞状细胞癌（HNSCC)的诊断及确定其预后的有效、低成本、非 侵入性测定法。所公开的测定法涉及检测得自受试者的样品中的一种或多种生物标志物， 诸如CD44(例如可溶性CD44(solCD44))。Franzmann等人的美国专利第8, 088, 591号对于 其可用于诊断和监测受试者中的HNSCC的生物标志物的描述整体以引用方式并入。这些生 物标志物的水平升高能够以高准确度和特异性将癌症患者与对照区分开来。然而，这些生 物标志物在某些受试者群体中降低，尽管存在HNSCC。
[0039] 因此，本发明公开可用于提高HNSCC测定法的准确度和特异性的另外的生物标志 物和风险因素。例如，已表明，相结合的solCD44和总蛋白水平在区分HNSCC与对照方面比 任一单独的标志物更有效。然而， S〇lCD44水平在具有人乳头瘤病毒（HPV)感染的受试者 中可能较低。事实上，使用s〇lCD44和总蛋白水平的双变量分析在黑人中最有效，在黑人中 HPV感染不太常见。因此，在多变量分析中包括HPV状态可提高测定法的灵敏性和准确度并 使得能够检测HPV+HNSCC。
[0040] 其他与HNSCC检测或预后相关的生物标志物可与总蛋白、sol⑶44和HPV检测结合 使用以提高所公开的方法的灵敏性和/或准确度。例如，s 〇lCD44水平可根据年龄和吸烟 状况而变化。可用于多变量分析的HNSCC风险因素和人口因素的实例包括烟草暴露、酒精 暴露、种族、民族、牙齿健康、性别、教育水平、年龄、一般健康状况、癌症家族史、性经验和社 会经济状况，以及在多变量分析中使用一个或多个风险因素或人口因素以确定综合分数。
[0041] 因此，公开了涉及所公开的生物标志物和风险因素的多变量分析以确定各个受试 者的综合分数的测定法以及将所述测定法用于诊断和预后的方法。然后可将综合分数用于 确定受试者中HNSCC的存在性或HNSCC复发的风险。具体地讲，可通过比较阳性和阴性对 照值从经验上确定综合分数截止值。
[0042] 本文所述的生物标志物包括基因和蛋白。此类生物标志物包括含有编码生物标志 物的核酸序列或此序列的互补序列的完整或部分序列的DNA。生物标志物核酸还包括含有 所关注的任何核酸序列的完整或部分序列的RNA。生物标志物蛋白是由本发明的DNA生物 标志物编码的或对应于本发明的DNA生物标志物的蛋白。生物标志物蛋白包含任何生物标 志物蛋白或多肽的完整或部分氨基酸序列。生物标志物基因和蛋白的片段和变体也包括在 本发明的范围内。所谓"片段"是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列并因而编码的蛋白的 一部分。为生物标志物核苷酸序列的片段的多核苷酸通常包含至少10、15、20、50、75、100、 150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1，000、1，100、1，200、 1，300或1，400个连续的核苷酸，或最多存在于本文所公开的全长生物标志物多核苷酸中 的核苷酸个数。生物标志物多核苷酸的片段将通常编码至少15、25、30、50、100、150、200或 250个连续氨基酸，或存在于本发明的全长生物标志物蛋白中的氨基酸的总数。"变体"旨在 表示基本上相似的序列。一般来讲，本发明的特定生物标志物的变体将具有通过序列比对 程序测定的与所述生物标志物至少约40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性。
[0043] 本文所述的生物标志物是其过表达与癌症（尤其是HNSCC)预后相关的基因和蛋 白。在特定的实施方案中，在患者样品中所关注的生物标志物或生物标志物组合的选择性 过表达表明不良癌症预后。所谓"表明不良预后"是指特定生物标志物或生物标志物组合 的过表达与潜在癌症或肿瘤的再现或复发、转移或死亡的可能性增加相关，如上文所定义。 例如，"表明不良预后"可表示潜在癌症或肿瘤的再现或复发、转移或五年内（更特别是十 年内）死亡的可能性增加。表明不良预后的生物标志物可在本文称为"不良转归生物标志 物"。在其他实施方案中，不存在所关注的生物标志物或生物标志物组合的过表达表明良好 预后。如本文所用，"表明良好预后"是指患者将保持无癌症的可能性增加，如上文所定义。 在一些实施方案中，"表明良好预后"是指患者将保持无癌症至少五年，更特别是至少十年 的可能性增加。此类生物标志物可称为"良好转归生物标志物"。
[0044] 所公开的生物标志物包括其过表达（与对照相比）与HNSCC预后相关的基因和/ 或蛋白。基因或蛋白与对照相比可过表达10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90 %、100 %、200 %、300 %、400 %、500 %或更多。生物标志物包括表明不良HNSCC预后的基 因和蛋白（即，不良转归生物标志物）以及表明良好预后的那些基因和蛋白（即，良好转归 生物标志物）。尤其关注的生物标志物包括在细胞生长和增殖的调控、细胞周期控制、DNA 复制和转录、细胞凋亡、信号转导、血管生成/淋巴生成或转移中涉及到的基因和蛋白。在 一些实施方案中，生物标志物调控组织重塑、细胞外基质降解和相邻组织浸润中涉及到的 蛋白酶系统。其他生物标志物包括基因表达（诸如高甲基化）的调控子或微RNA。虽然其 表达模式表明HNSCC预后的任何生物标志物均可用于实践本发明所公开的方法和测定法， 但是在特定的实施方案中，生物标志物选自HPV、总蛋白和CD44。在一个实施方案中，CD44 生物标志物为sol⑶44。
[0045] HPV感染可通过直接或间接测量HPV而测定。三类分子测定法目前可用于检测组 织和脱落细胞样品中的HPV感染。它们全部都基于检测HPV DNA并包括：（1)非扩增杂交测 定法（Southern转移杂交（STH)、斑点印迹杂交（DB)和原位杂交（ISH)) ; (2)信号扩增杂交 测定法，诸如杂交捕获测定法；以及（3)靶标扩增测定法，诸如PCR和原位PCR。Southern 印迹杂交需要大量DNA、费力并且无法重现，而原位杂交对于HPV仅具有中度的灵敏性。基 于PCR的HPV检测及其灵敏而又具有特异性。使用该方法，通过DNA聚合酶在体外扩增病 毒DNA以生成足量的靶标，然后直接在凝胶上可视化，或（更特异性的方法）使用传统杂交 方法通过特异性探针进行检测。在实践中，基于PCR的方法的灵敏性在100ng细胞DNA的 背景下为约10-100个HPV病毒基因组。由于PCR可以非常小量的DNA(10-100ng)进行，因 此理想的是用于具有低DNA含量的标本。
[0046] 目前，唯一可用的经FDA批准的HPV检测方法是第二代杂交捕获测定法（Hybrid capture II assay) (Qiagen, Valencia, CA)。在该测定法中，将 HPV DNA 杂交到 RNA 探针，然 后捕获并通过化学发光系统检测RNA-DNA杂交体。该测定法的灵敏性类似于基于PCR的测 定法，其中高灵敏性通过信号而实现，而非靶标扩增。当前的第二代杂交捕获（HC II)测定 法具有检测每毫升样品中的lpg HPV(约50, 000个拷贝）的灵敏性。正确的样品采集对于 实现最高的灵敏性必不可少，并且已表明刷子采样装置是最佳的。HC II测定法包含与13 种高风险（类型 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)和5种低风险（6、11、42、 43、44) HPV类型的基因组序列互补的合成的RNA探针。
[0047] 作为另外一种选择，HPV感染可通过检测病毒mRNA转录物或通过检测细胞蛋白 P16而测定。HPV要导致癌症，允许病毒致癌基因 E6和E7 (最初在基底细胞层中，然后在整 个上皮中）高水平表达的持续性感染和细胞环境必不可少。因此，检测E6/E7mRNA可比DNA 方法鉴定临床上更显著的感染。
[0048] 周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A、pl6Ink4A、pl6)是致癌E6/E7mRNA的表达增 加的细胞关联物。HPV致癌基因的主要作用是通过E6下调p53,并因而取消细胞凋亡并从 pRb释放E2F，其导致细胞周期的连续激活。在生理上，E2F激活由Rb蛋白的磷酸化介导。 该通路受到一系列阻断酶磷酸化PRB(周期蛋白依赖性激酶）的周期蛋白依赖性激酶抑制 剂（尤其是P16)的严格调控。在具有转化HPV感染的细胞中，Rb-E2F通路的调控受到E7 的干扰，并且P16的激活无下游效应。因此，pl6强烈过表达并在细胞中蓄积。已在宫颈癌 前期和宫颈癌的绝大部分中证实了 P16过表达，而在正常组织中，只在极少数情况下发现 了 pl6表达。
[0049] HPV感染的表观遗传效应也可用于检测HPV。HPV+与HPVT1NSCC细胞系之间的差 异甲基化基因座在Sartor MA等人，Epigenetics6 (6) :777-87(2011)中有所描述，其对于这 些表观遗传谱以引用方式并入。
[0050] 因此，可使用特异性结合pl6INK4a的抗体检测HPV感染。作为另外一种选择，HPV感 染可通过检测HPVDNA、RNA或蛋白而确定。同样，HPV感染可通过检测病毒致癌基因（例如 E6/E7)或表观遗传改变而确定。
[0051] 方法
[0052] 本发明公开了用于诊断受试者中的HNSCC、对受试者中的HNSCC肿瘤分期、监测 HNSCC治疗的效果、或确定经诊断患有HNSCC的受试者的预后、或预测HNSCC在受试者中的 复发的方法。这些方法各自包括对得自受试者的身体样品测定总蛋白、sol⑶44和HPV的存 在性。总蛋白、HPV和CD44水平的组合可用于多变量分析以确定综合分数。该方法还可以 包括测定身体样品的透明质酸（HA)、透明质酸酶（HAase)、IL-8或其组合的存在性。HNSCC 风险因素和/或人口因素也可与总蛋白、S〇lCD44和HPV检测结合使用以提高所公开的方 法的灵敏性和/或准确性。
[0053] 多变量分析基于多变量统计学的统计原理，其涉及一次观察并分析多于一个统计 转归变量。例如，存在若干可与多变量分析一起使用的回归方法，包括但不限于广义线性和 非线性回归、逻辑和泊松回归、监督机器学习算法、神经网络、支持向量机、响应面建模和多 元自适应回归样条。在一些实施方案中，使用逻辑回归。
[0054] 例如，多变量分析可首先涉及确定总蛋白、sol⑶44和pl6水平基于诸如种族、性 另IJ、吸烟和饮酒的风险变量而变化的方式。然后可开发数学模型，其术语包括生物标志物水 平和风险变量以预测癌症的概率。与术语相关的统计显著性反映其对预测的重要性。然后 可将数学模型用于估计预测分数，其允许建立癌症的总体概率分数。例如，在研究标志物水 平和风险变量（例如种族、性别、吸烟和饮酒）与转归的关联方式（包括相互作用）后，可 得到涉及生物标志物和协变量的对数优势的拟合模型。基于该模型，可在模型所包括的所 有变量的指定值下估计患癌症的分数或预测概率。
[0055] 在一些实施方案中，综合（预测）分数增加到截止点以上可区分患有HNSCC的受 试者与没有HNSCC或其将来复发风险较低的那些受试者。在一些实施方案中，综合分数增 加到截止点以上可确定HNSCC肿瘤分期、预测HNSCC治疗的有效性、预测经诊断患有HNSCC 的受试者的预后或预测HNSCC复发的风险。例如，分数增加到截止点以上可与不良预后或 复发可能性相关。
[0056] 所公开的测定法和方法可用于指导患有HNSCC的受试者或处于发生HNSCC风险的 受试者的治疗性治疗。例如，可向具有低综合分数的受试者给予单模式治疗，诸如单独的手 术或放疗而非联合疗法。这将导致与治疗相关的发病率降低。相比之下，可向具有高综合 分数的受试者提供更积极的治疗，诸如手术、放疗和化疗，因为鉴于疾病的较高死亡风险， 将会发生较高的治疗相关发病率。因此，所公开的方法还可以包括通过手术、放疗、化疗、光 动力疗法、靶向疗法或其任何组合对经诊断患有HNSCC或经确定具有不良HNSCC预后的受 试者进行治疗。
[0057] 所公开的生物标志物的每一者可使用身体样品在受试者中进行检测。所谓"身体 样品"是指对可在其中检测生物标志物的表达的细胞、组织或体液的任何取样。此类身体样 品的实例包括但不限于血液、淋巴、尿液、妇科体液、活组织检查样品和涂片。可用于本发明 的体液包括但不限于血液、尿液、唾液、乳头抽吸液、灌洗液或任何其他身体分泌物或其衍 生物。血液可包括全血、血浆、血清或血液的任何衍生物。在优选的实施方案中，身体样品 包括口腔含漱液。采集各种身体样品的方法是本领域中熟知的。
[0058] 所述方法可用于检测存在头颈癌风险的个体，例如吸烟者、酗酒者和暴露于HPV 病毒的受试者。本文所述的方法还允许与其他已知预后指标的分析相比增强对HNSCC预后 的评估。在特定的方面，灵敏性和特异性等于或大于已知癌症预后评价方法的灵敏性和特 异性。用于评估特异性和灵敏性的终点是将使用本发明的方法预测的预后或转归（即，在 诊断时或附近）与实际的临床转归（即，患者是保持无癌症还是在规定的时间周期内出现 复发）进行比较。如本文所用，"特异性"是指本发明的方法可准确鉴定真阴性所处的水平。 在临床研究中，通过将真阴性的数量除以真阴性和假阳性的总和而计算特异性。所谓"灵敏 性"是指本发明的方法可准确鉴定真阳性样品所处的水平。在临床研究中，通过将真阳性的 数量除以真阳性和假阴性的总和而计算灵敏性。在一些实施方案中，用于评价HNSCC的本 发明所公开的方法的灵敏性为至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高。此外，本发明的 方法的特异性优选地为至少约 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高。在另外的实施方案中，对 本发明的预后方法的灵敏性和特异性综合值进行评估。所谓"灵敏性和特异性综合值"是 指如上文所定义的各个特异性和灵敏性值的总和。本发明的方法的灵敏性和特异性综合值 优选地为至少约 105%、110%、115%、120%、130%、140%、150%、160%或更高。
[0059] 如本文所用，"真"和"假"阳性和阴性的定义将取决于所考虑的生物标志物或生物 标志物组合是良好转归还是不良转归生物标志物。也就是说，就良好转归生物标志物（即， 表明良好预后的那些生物标志物）而言，"真阳性"是指表现出所关注的生物标志物的过表 达的那些样品（如通过体检然后通过活组织检查所确定）。病理学阳性活组织检查表明样 品是阳性还是阴性。
[0060] 如上所述，在一些实施方案中，使用两个或更多个生物标志物，更优选地，两个或 更多个互补生物标志物。所谓"互补"是指检测身体样品中生物标志物的组合导致与仅使 用一种生物标志物时所鉴定的相比在更大百分比的情况下准确确定癌症预后。因此，在一 些情况下，可通过使用所公开的生物标志物中的至少两种更准确地确定癌症预后。
[0061] 在本领域中可用于检测生物标志物表达的任何方法均包括在本文中。本发明的生 物标志物的表达可在核酸水平或蛋白水平上检测。所谓"检测表达"是指确定生物标志物 基因或蛋白的量或存在性。因此，"检测表达"涵盖以下情况：确定生物标志物未表达、未以 可检测的程度表达、以低水平表达、以正常水平表达或过表达。为了确定过表达，可将待检 验的身体样品与相应的样品进行比较。例如，相应的身体样品源于健康人。也就是说，"正 常的"表达水平是生物标志物在例如得自未患有HNSCC的人类受试者或患者的样品中的表 达水平。还可以将身体样品与得自进行HNSCC治疗的受试者的相应身体样品进行比较。这 样的样品可以标准形式存在。在一些实施方案中，确定生物标志物过表达不需要身体样品 与源自健康人的相应身体样品之间的比较。例如，检测肿瘤样品中表明不良预后的生物标 志物的过表达可无需与源自健康人的相应样品进行比较。此外，在本发明的一些方面，所关 注的生物标志物或生物标志物组合无表达、低表达或正常表达（即，不存在过表达）提供关 于患者预后的有用信息。
[0062] 用于检测本发明的生物标志物的表达的方法包括在核酸或蛋白水平上确定生物 标志物的量或存在性的任何方法。此类方法在本领域中是熟知的，并包括但不限于横向流 "试纸"、Western印迹、Northern印迹、Southern印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫突光、流式细 胞术、免疫组织化学、核酸杂交技术、核酸逆转录方法以及核酸扩增方法，例如PCR。在特定 的实施方案中，使用例如抗特异性生物标志物蛋白的抗体在蛋白水平上检测生物标志物的 表达。这些抗体可用于各种方法中，诸如Western印迹、ELISA、免疫沉淀或免疫组织化学技 术。同样，可将组织的免疫染色与本领域已知的临床信息评估、常规预后方法和分子标志物 (例如？16°"^和solCD44)的表达相结合。以此方式，本发明所公开的方法可允许更准确地 确定HNSCC预后。
[0063] 试剂盒
[0064] 本文还提供用于诊断受试者患有HNSCC或确定患有HNSCC的受试者的预后的试剂 盒。该试剂盒可包含用于测定pl6 INK4a、sol⑶44和/或总蛋白的装置。例如，该试剂盒可包 含特异性结合pl6INK4a的多种抗体。在一些实施方案中，抗体包括E6H4抗体克隆的个体基因 型。该试剂盒还可以包含用于检测所包含的抗体的检测剂（例如二抗和/或比色剂）。该 试剂盒还可以包含特异性结合⑶44(例如sol⑶44)的多种抗体。该试剂盒还可以包含用 于确定样品中的总蛋白浓度的试剂。该试剂盒也可以包含pl6 Iffi4a和/或sol⑶44的参比 样品。该试剂盒还可以包含试剂盒的使用说明（例如，诊断受试者的说明）、容器和/或托 架。具体地讲，该试剂盒可包含计算机可读介质或超链接，其使用算法和参考表将检测值转 化成综合分数。在一些实施方案中，该试剂盒为横向流免疫测定试剂盒。作为另外一种选 择，该试剂盒可包含多孔板，其任选地包被有特异性结合pl6 INK4a的抗体、特异性结合CD44 的抗体或其组合。
[0065] 以下实施例旨在进一步阐述本文所述的方法和组合物的某些方面，而非意图限制 权利要求书的范围。
[0066] 实施例
[0067] 在下文示出以下实施例以阐述根据所公开的主题的方法和结果。这些实施例并非 意图包括本文所公开的主题的所有方面，而是阐述代表性方法和结果。这些实施例并非意 图排除对本领域的技术人员显而易见的本发明的等同形式和变型形式。
[0068] 已作出了努力以确保关于数值（例如量、温度等）的准确性，但是应当考虑一些误 差和偏差。除非另外指明，否则份数均为重量份，温度均以1：表示或处于环境温度下，并且 压力为大气压或接近大气压。存在反应条件（例如组分浓度、温度、压力和其他反应范围） 以及可用于优化通过所述工艺得到的产物纯度和收率的条件的多种变型形式和组合。将只 需要合理的常规实验来优化此类工艺条件。
[0069] 实施例1 :
[0070] 通过考察本文所述的标志物在其肿瘤为pl6INK4a阳性的患者中改善的方式而研究 了本文所述的测试与HPV相关HNSCC之间的关系。对十四名口咽癌受试者进行了评价。对 于各受试者，获得了得自其肿瘤组织的Pl6 lffi4a免疫组织化学结果以及得自其口腔含漱液的 solCD44和蛋白结果。solCD44和蛋白水平的平均水平在HPV+病例（CD44 :3. 17对4. 2, p =0.55 ;蛋白：0.83对1.07,p = 0.49)中较低，但差异未达到统计显著性。将使用得自口 腔含漱液的上清液进行的s〇lCD44和蛋白测试与使用得自相同口腔含漱液的沉淀检测的 P16INK4a水平相结合。
[0071] 进行了体外测定以定量测定得自口腔含漱液沉淀的裂解样品中的人Pl6lffi4a蛋 白。将相同的沉淀置于200 μ L含有蛋白酶抑制剂（Thermo Scientific)的细胞裂解缓冲液 (SIGMA)中，以使溶解的pl6INK4a稳定化。然后将样品在95°C加热10分钟，其有利于细胞完 全裂解以更好地检测pl6 Iffi4a。使用比色ELISA夹心技术对pl6Iffi4a蛋白进行了定量，其中使 用包被有pl6 INK4a特异性单克隆抗体E6H4?(Roche mtm laboratories AG)和第二种用HRP标 记的pl6INK4a特异性单克隆抗体的微量滴定板。通过生成基于pl6 INK4a水平（标准品1-6)的 标准曲线进行了定量。测试样品中的水平通过基于标准曲线的内推法而确定。将酶标仪用 于在450nm的波长下（参考波长：620nm)测量各孔中的吸光度。将基于4参数方法的计算 程序用于获得最终pl6 INK4a样品浓度。结果以U/mL陈述，并且对研究样品一式两份地进行 测量，各自的体积为1〇〇μ L。经确认15U/mL的截止值为适当的阈值，以通过多中心临床研 究（方案号 9502-06-REG-DE-001)将各个临床标本分类为 Cervatec?pl6INK4a ELISA(Roche mtm laboratories AG)结果阳性。
[0072] 使用该组合方法，在14名HNSCC患者中测试了与⑶44和蛋白相结合的pl6INK4a，这 些患者包括患有口腔或口咽鳞状细胞癌（CA)或未知原发癌（UK1CA)的患者。还测试了三 名健康自愿者（HV)(参见表1)。具有低水平⑶44(截止值设定为2. 7ng/ml)和蛋白（截止 值设定为1. 〇mg/ml)的两名患者具有高于15U/ml的截止值的pl6Iffi4a水平。⑶44和蛋白还 各自鉴定出了未被其他测试法检出的肿瘤。因此，向检查中增加 Pl6lffi4a提高了灵敏性。所 测试的3名健康自愿者均具有低于截止值的各标志物水平。
[0073] 表 1
[0074]
【权利要求】
1. 一种用于诊断受试者中的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC)的方法，包括测定得自所述受 试者的唾液样品的总蛋白、s 〇lCD44和HPV的存在性，以及在多变量分析中使用总蛋白、HPV 和CD44水平的组合以确定综合分数，分数增加到截止点以上因而将患有HNSCC、或其将来 复发风险升高的受试者与没有HNSCC或其将来复发风险较低的受试者区分开来。
2. -种用于确定经诊断患有（HNSCC)的受试者的预后的方法，包括测定得自所述受试 者的唾液样品的总蛋白、sol⑶44和HPV的存在性，在多变量分析中使用总蛋白、HPV和⑶44 水平的组合以确定综合分数，分数增加到截止点以上因而与较差的预后相关。
3. 根据权利要求1至2中任一项所述的方法，还包括通过手术、放疗、化疗、光动力疗 法、靶向疗法或其任何组合对经诊断患有HNSCC的或经确定具有不良预后的受试者进行治 疗。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过检测pl6INK4a来检测HPV。
5. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过检测HPV DNA或RNA、HPV蛋白 或表观遗传改变来检测HPV。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，还包括对所述受试者评估选自由烟草暴 露、酒精暴露、种族、民族、口腔健康、性别、教育水平和年龄组成的组的一个或多个风险因 素或人口统计因素，以及在所述多变量分析中使用所述一个或多个风险因素或人口统计因 素以确定所述综合分数。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述唾液样品为口腔含漱液。
8. -种试剂盒，包括： 特异性结合pl6INK4a的至少一种抗体； 特异性结合⑶44的至少一种抗体；以及 用于确定样品中的总蛋白浓度的试剂。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其中特异性结合pl6Iffi4a的所述至少一种抗体包括 E6H4抗体克隆的个体基因型。
10. 根据权利要求8或9所述的试剂盒，还包含⑶44参比样品、pl6参比样品或其组 合。
11. 根据权利要求8至10中任一项所述的试剂盒，还包含用于检测特异性结合pl6INK4a 的所述抗体、特异性结合CD44的所述抗体或其组合的一种或多种比色剂。
12. 根据权利要求8至11中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒为横向流免疫测定 试剂盒。
13. 根据权利要求8至11中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括任选包被有特 异性结合pl6Iffi4a的所述抗体、特异性结合CD44的所述抗体或其组合的多孔板。
【文档编号】G01N33/574GK104067126SQ201280067010
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年11月15日 优先权日:2011年11月15日
【发明者】E·弗兰兹曼, L·佩雷拉, I·M·赖斯, R·C·邓肯 申请人:迈阿密大学