本发明涉及生物显微操作技术领域，特别是涉及一种基于卵母细胞弹性模量的压电超声显微注射方法。
背景技术：
卵母细胞是生命孕育过程中最重要的细胞，对卵母细胞的显微操作技术在生命科学研究与相关医学技术中一直占据着最重要的位置。针对卵母细胞的不同发育阶段的不同卵母细胞显微操作技术如转基因注射技术、体细胞核移植技术等层出不穷。随着生物医学技术研究的不断深入，生物显微操作技术流程越来越复杂与精密，操作对象越来越高端，也对当今的显微操作技术提出了越来越高的要求。
由于卵母细胞具有生物各异性，就算是同一种类的甚至同一生物个体所产生的卵母细胞都具有很大差异，同时，随着卵母细胞的发育，其细胞力学特性也会发生很大波动。而目前的卵母细胞显微操作技术如压电显微注射技术，其超声振动能量参数(如振幅，频率)的选择，基本上是先取一批卵母细胞样品，然后测量其力学特性参数，取平均值后根据其平均值选取参数。细胞的较大各异性和操作参数的同一性成为了制约显微操作技术的主要矛盾，使得操作成功率和操作效果难以提升。因此，为了提高显微操作成功率，有必要在测量细胞特性参数的基础上，根据实时测量的细胞特性参数去操作细胞。
当前显微操作技术中，测量细胞特性参数和细胞显微操作基本上是割裂的，各种细胞特性参数测量技术如平板挤压法、微力传感器测量法、剌入法、微管吸持法、原子力显微镜法、光镊法、光阱拉伸法，磁场法和微流道法等等。其基本原理都是对细胞施加一定的微力并获得细胞的相应变形；通过受力与形变的关系对细胞的力学参数进行估计，但是大部分的细胞特性参数测量技术测量过的细胞将失去活性。而目前的细胞显微操作技术，依然停留在简单的将同类细胞看成是特性一致的“目标”，采用同样的操作参数去进行操作特性各异的细胞，其结果必然差强人意，而由于卵母细胞显微操作的特殊性，任何极小的操作差异都有可能导致细胞的死亡，最终导致实验失败。
因此，针对上述技术问题，有必要提供一种基于卵母细胞弹性模量的压电超声显微注射方法。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于卵母细胞弹性模量的压电超声显微注射方法，本发明从显微操作技术提升的需求出发，将测量细胞特性参数和细胞显微操作结合起来，真正达到卵母细胞个性化显微操作目标。
为了实现上述目的，本发明一实施例提供的技术方案如下：
一种基于卵母细胞弹性模量的压电超声显微注射方法，所述注射方法包括：
s1、利用毛细效应平衡压模型测量卵母细胞的弹性模量；
s2、根据弹性模量计算压电显微注射参数；
s3、在靶向辅助吸持针的辅助支撑下，控制压电超声显微注射针的压电显微注射参数对卵母细胞的进行显微注射。
作为本发明的进一步改进，所述步骤s1具体为：
将靶向辅助吸持针放入培养液中，吸持针产生毛细效应，在吸持针内部产生气液交互界面；
对靶向辅助吸持针内施加平衡压并逐渐增大，直至气液交互界面移动至吸持针的针口处，此时的平衡压为第一吸持压；
吸持针与卵母细胞的透明带接触，并形成密封；
逐渐减小平衡压，直至卵母细胞的部分透明带吸入吸持针内且液位停止，此时的平衡压为第二吸持压；
获取卵母细胞的透明带在吸持针内的伸长量；
根据第一吸持压、第二吸持压及伸长量获取卵母细胞的弹性模量。
作为本发明的进一步改进，所述卵母细胞的弹性模量为：
其中，e为卵母细胞的弹性模量，δl为卵母细胞的透明带在吸持针内的伸长量，δp为第一吸持压与第二吸持压的变化量，φ为依赖于吸持针壁厚与吸持针半径的比值的常数，rp为吸持针半径。
作为本发明的进一步改进，所述φ的取值为2～2.2。
作为本发明的进一步改进，所述压电显微注射参数包括振动频率及振动幅值，振动频率为20khz-30khz，振动幅值为0-2μm。
作为本发明的进一步改进，所述压电显微注射参数的计算公式为：
其中，f为振动频率，a为振动幅值，e为弹性模量，δl为卵母细胞的透明带在吸持针内的伸长量，ρ为透明带密度，d为透明带厚度，l为卵母细胞的直径。
作为本发明的进一步改进，所述注射方法还包括：
将卵母细胞放置于真空吸附式悬浮细胞夹持装置中的操作区域上，并通过真空泵进行真空吸附。
作为本发明的进一步改进，所述注射方法还包括：
根据卵母细胞的弹性模量设置真空泵的吸附压参数。
作为本发明的进一步改进，所述注射方法还包括：
通过旋转平台和螺旋电极进行卵母细胞的位姿调节。
作为本发明的进一步改进，所述注射方法中，靶向辅助吸持针的进给方向和压电超声显微注射针的进给方向之间的夹角为30°。
本发明的有益效果是：
利用毛细效应平衡压模型能够实现卵母细胞弹性模量的在线实时测量，测量过后卵母细胞依然能保持活性，不影响后续卵母细胞个性化显微操作；
吸持针既是弹性模量测量工具，又可以用于辅助支撑，在测量完卵母细胞弹性模量以后，无须移动装置和卵母细胞，即可以进行下一步微形变卵母细胞显微操作，实现卵母细胞原位操作，减少对细胞损伤；
通过研究卵母细胞弹性模量参数与卵母细胞压电超声显微注射参数之间的关系，利用实时测量的卵母细胞弹性模量实时设置压电超声显微注射参数，真正实现卵母细胞个性化参数显微注射。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中压电超声显微注射方法的流程示意图；
图2为本发明中卵母细胞弹性模量测量方法的流程示意图；
图3a～3d为本发明一具体实施例中卵母细胞弹性模量的各步骤示意图；
图4为本发明一具体实施例中用于压电超声显微注射的系统示意图；
图5为图4中的局部结构放大图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
参图1所示，本发明公开了一种压电超声显微注射方法，包括以下步骤：
s1、利用毛细效应平衡压模型测量卵母细胞的弹性模量；
s2、根据弹性模量计算压电显微注射参数；
s3、在靶向辅助吸持针的辅助支撑下，控制压电超声显微注射针的压电显微注射参数对卵母细胞的进行显微注射。
其中，压电显微注射参数包括振动频率及振动幅值，振动频率为20khz-30khz，振动幅值为0-2μm。
优选地，压电显微注射参数的计算公式为：
其中，f为振动频率，a为振动幅值，e为弹性模量，δl为卵母细胞的透明带在吸持针内的伸长量，ρ为透明带密度，d为透明带厚度，l为卵母细胞的直径。
其中，参图2所示，步骤s1具体为：
将靶向辅助吸持针放入培养液中，吸持针产生毛细效应，在吸持针内部产生气液交互界面；
对靶向辅助吸持针内施加平衡压并逐渐增大，直至气液交互界面移动至吸持针的针口处，此时的平衡压为第一吸持压；
吸持针与卵母细胞的透明带接触，并形成密封；
逐渐减小平衡压，直至卵母细胞的部分透明带吸入吸持针内且液位停止，此时的平衡压为第二吸持压；
获取卵母细胞的透明带在吸持针内的伸长量；
根据第一吸持压、第二吸持压及伸长量获取卵母细胞的弹性模量。
优选地，卵母细胞的弹性模量为：
其中，e为卵母细胞的弹性模量，δl为卵母细胞的透明带在吸持针内的伸长量，δp为第一吸持压与第二吸持压的变化量，φ为依赖于吸持针壁厚与吸持针半径的比值的常数，rp为吸持针半径。
以下结合说明书附图对本发明具体实施例进行详细说明。
参图3a～3d并结合图1所示，本发明一具体实施例中卵母细胞弹性模量的测量方法，包括以下步骤：
将靶向辅助吸持针放入培养液中，吸持针产生毛细效应，在吸持针内部产生气液交互界面，参图3a所示；
对靶向辅助吸持针内施加平衡压并逐渐增大，直至气液交互界面移动至吸持针的针口处，此时的平衡压为第一吸持压，参图3b所示；
吸持针与卵母细胞的透明带接触，减小平衡压，将卵母细胞的部分透明带吸入针管内用以固定细胞，并形成密封，参图3c所示。
逐渐减小平衡压，直至卵母细胞的部分透明带吸入吸持针内且液位停止，参图3d所示，此时的平衡压为第二吸持压；
利用图像处理技术获取卵母细胞的透明带在吸持针内的伸长量；
根据第一吸持压、第二吸持压及伸长量获取卵母细胞的弹性模量。
本实施例中卵母细胞的弹性模量为：
其中，e为卵母细胞的弹性模量，δl为卵母细胞的透明带在吸持针内的伸长量，δp为第一吸持压与第二吸持压的变化量，φ为依赖于吸持针壁厚与吸持针半径的比值的常数，其和吸持针壁厚与吸持针半径的比值成正比，rp为吸持针半径，本实施例中φ的取值按照经验取值为2.1。
本发明中不同卵母细胞的第一吸持压与第二吸持压的变化量δp也不一样，例如猪的卵母细胞在几百pa左右，小鼠的神经元细胞在几千pa左右。
本发明中利用毛细效应平衡压模型的吸持针吸持方法，实现了卵母细胞弹性模量的在线测量。
当吸持针浸入培养液时，在毛细力的作用下会有少量液体进入吸持针中，所以当用吸持针吸持卵母细胞时，吸持针口会在入口处产生一个额外的吸持压，称为毛细压。毛细压对吸持针针口处的吸持压影响很大，且会随着注射器的输出压强的改变而改变，从而影响后续细胞弹性模量的求解。因此本发明使用一种平衡压模型来求取毛细压的大小，利用公式确定吸持针针口的吸持压强；同时，利用图像处理技术获取细胞在吸持针内的伸长量。最后利用吸持压和细胞伸长量的关系确定细胞的弹性模量，实现卵母细胞弹性模量的在线实时测量时。
利用毛细效应平衡压模型测量得到卵母细胞的弹性模量后，即可根据弹性模量计算压电显微注射参数，并在靶向辅助吸持针的辅助支撑下，控制压电超声显微注射针的压电显微注射参数对卵母细胞的进行显微注射。
其中，压电显微注射参数包括振动频率及振动幅值，振动频率为20khz-30khz，振动幅值为0-2μm。
本发明中压电显微注射参数的计算公式为：
其中，f为振动频率，a为振动幅值，e为弹性模量，δl为卵母细胞的透明带在吸持针内的伸长量，ρ为透明带密度，d为透明带厚度，l为卵母细胞的直径。
通过已经算出来的卵母细胞弹性模量，输出给压电陶瓷，压电陶瓷根据实时测量的弹性模量，给出相应的振动频率。然后，注射针在压电陶瓷的驱动下对卵母细胞进行注射，这时，靶向辅助吸持针起到了另一种作用——辅助支撑。
参图4、图5所示，本实施例中的压电超声显微注射方法通过压电超声显微注射系统进行，压电超声显微注射系统包括真空吸附式悬浮细胞夹持装置10、靶向辅助吸持针20及压电超声显微注射针30实现。
其中，真空吸附式悬浮细胞夹持装置10，包括旋转平台11、设于旋转平台11上的螺旋电极12、以及设于旋转平台11上的真空泵13，螺旋电极12中心设有用于对卵母细胞进行真空吸附的操作区域14(细胞夹持室)，真空泵13控制操作区域14对卵母细胞40进行真空吸附。
靶向辅助吸持针20，靶向辅助吸持针20前端装有吸持微管，可实现细胞弹性模量实时在线测量与细胞靶向位置辅助支撑双重功能。
压电超声显微注射针30，用于对卵母细胞40进行辅助支撑后对卵母细胞的具体显微注射。
具体地，旋转平台11包括基板111及位于基板下方的细胞位姿调节芯片112，基板111和细胞位姿调节芯片112之间形成有一真空腔113，真空泵13通过真空腔113与操作区域14相连通。
另外，螺旋电极12在旋转平台阵列分布，本实施例中的旋转平台11上设有四个阵列分布的螺旋电极12，每个螺旋电极12包括四个电极引脚121与电极引脚一一相连的电极122，电极122自电极引脚121向操作区域螺旋设置。当在四个电极上施加幅值、频率均相同，相位角相差90°的交流信号时，位于电极上方的细胞会向着电极中心区域移动，使细胞快速达到预定的吸附区域，实现细胞平面姿态的调节。
本实施例中首先需将卵母细胞放置于真空吸附式悬浮细胞夹持装置中的操作区域上，通过旋转平台和螺旋电极进行卵母细胞的位姿调节，并通过真空泵进行真空吸附。
通过行波电路、真空吸附和旋转平台的配合，可以使细胞快速到达预定吸附区域以及实现细胞三维位姿的粗调，随后利用基于细胞弹性的细胞拨动方法来实现细胞三维姿态的精细调节。
在进行细胞显微注射时，吸持针和真空泵根据测量的卵母细胞弹性模量设置吸附压参数，共同吸附固定卵母细胞，辅助卵母细胞注射操作。
进行显微注射操作时，已经测量得到的卵母细胞弹性模量参数同时反馈给压电超声显微注射针，用以设定合适的压电输出频率，达到最好的注射效果及最小的细胞损伤。
具体的在线测量卵母细胞弹性模量并在线设定显微参数的微形变压电超声显微注射方法的操作流程如下：
将需要进行注射的卵母细胞滴定在已装有培养液的真空吸附式悬浮细胞夹持装置上阵列排布的操作区域内，向四路螺旋电极施加幅值、频率相同、相位角相差90°的额定交流电，使卵母细胞向着电极中心区域移动，当卵母细胞到达中心区域后，由于所受到的介电泳力减弱，卵母细胞在重力作用向下沉降。当位姿达到要求时，停止位姿调节，完成细胞位姿初步调节。
当卵母细胞固定好以后，结合显微镜和成像系统进行卵母细胞图像融合，通过卵母细胞显隐性结构成像技术，确立显微操作靶向区域。
将靶向辅助吸持针前端的微管浸没在培养液中的，并在微管内施加一定的正压将气液界面移动到微管口处；随后减少平衡压将部分细胞表面吸入吸持针，形成密封；进一步的，逐步减小平衡压，确定吸持针的吸持压强；同时，利用图像处理技术获取卵母细胞在吸持针内的伸长量。最后利用吸持压和细胞伸长量的关系确定细胞的弹性模量，完成卵母细胞弹性模量的在线实时测量。
使用压电超声显微注射针拨动细胞，对细胞位姿进行微细调节，使卵母细胞达到最佳注射位姿状态。
随后，吸持针和真空泵根据测量的卵母细胞的弹性模量设置吸附压参数，共同吸附固定细胞，注射针也同时根据测量的卵母细胞弹性模量设置适合的注射参数，完成卵母细胞注射操作。
优选地，本实施例中靶向辅助吸持针的进给方向和压电超声显微注射针的进给方向之间的夹角为30°。
由以上技术方案可以看出，本发明具有如下有益效果：
利用毛细效应平衡压模型能够实现卵母细胞弹性模量的在线实时测量，测量过后卵母细胞依然能保持活性，不影响后续卵母细胞个性化显微操作；
吸持针既是弹性模量测量工具，又可以用于辅助支撑，在测量完卵母细胞弹性模量以后，无须移动装置和卵母细胞，即可以进行下一步微形变卵母细胞显微操作，实现卵母细胞原位操作，减少对细胞损伤；
通过研究卵母细胞弹性模量参数与卵母细胞压电超声显微注射参数之间的关系，利用实时测量的卵母细胞弹性模量实时设置压电超声显微注射参数，真正实现卵母细胞个性化参数显微注射。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。