女性食管癌细胞系及其应用的制作方法

本发明是关于人食管癌细胞系领域，特别是关于女性食管癌细胞系及其应用。

背景技术：

食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤，中国是世界上食管癌高发病率和死亡率的国家。2012年GLOBOCAN数据显示，全球食管癌新发45.6万例，中国发生22.3万例，占48.9％；全球食管癌死亡40万例，中国死亡19.7万例，占49.3％，防治形势严峻。我国食管癌有两种主要亚型，鳞癌和腺癌，其中鳞癌约占90％。

目前，食管鳞癌发病机制尚未完全阐明，为了深入了解食管鳞癌的发病机理、转移及预后方面的研究，需要建立合适的细胞系模型。目前全球知名的食管癌细胞株有来源于日本的TE-1、TE-2、TE-8、TE-13、KYSE-30、KYSE-150等，以及来源于中国河南临县的Eca-109，已知的上述食管癌细胞株长期在体外传代，部分已经丧失了原始肿瘤组织的特性，细胞株分子生物学实验结果与临床个体结果的差异很大。国内已建立的食管鳞癌细胞株较少，并易受污染，使得食管癌的研究不能深入开展，而且，上述食管癌细胞株均未报道具有表达肿瘤相关抗原CA125、细胞角蛋白(CK)及上皮膜抗原(EMA)特点。

目前一般认为原代细胞实验结果较细胞株实验结果更可靠，且更接近临床个体实验结果，因此，建立中国人来源的食管癌原代细胞株，为食管鳞癌的发病机制及治疗提供新的研究模型，具有重要的理论和实际应用价值。由于蒙古人种主要分布于中国、朝鲜、日本、西伯利亚、中南半岛、美洲和北极地区，是四大人种中分布范围最广、人数最多的人种，因此，蒙古人种(黄种人)食管癌原代细胞的建立将对研究人食管癌的发病和治疗具有重要意义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种女性食管癌细胞系及其应用，该女性食管癌细胞系能够完成各类分子生物学实验，并且由于原代细胞实验结果较细胞株实验结果更可靠，且更接近临床个体实验结果，因此该女性食管癌细胞系的建立，对研究蒙古人种(黄种人)食管癌的发病和治疗具有重要意义。

为实现上述目的，本发明提供了一种女性食管癌细胞系，所述女性食管癌细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2017203，其是以患者食管中的肿瘤组织块为起始材料，将其进行原代培养以及传代培养获得，该女性食管癌细胞系是鳞癌来源的。

上述女性食管癌细胞系是在国家级课题(2014DFA311150)支持下培养成功，采用化学发光法检测所述女性食管癌细胞系中肿瘤相关抗原CA125含量，结果得出该女性食管癌细胞系具有表达肿瘤相关抗原CA125的特点，采用免疫组化方法检测所述女性食管癌细胞系涂片中细胞角蛋白(CK)及细胞角蛋白5/6(CK5/6)的表达情况，结果得出该女性食管癌细胞系胞浆中出现棕黄色颗粒，具有表达CK及CK5/6的特点，CK(Cytokeratin)及CK5/6(Cytokeratin5/6)是角质细胞中的主要骨架蛋白，主要存在于鳞状上皮的棘层细胞、基底细胞中。与国际上其他食管癌细胞株相比，该女性食管癌细胞系在寻找新肿瘤标志物等方面更有应用价值，有利于食管鳞癌的发病机制及诊治研究。

本发明还提供了所述女性食管癌细胞系的子代细胞。

在一优选的实施方式中，所述女性食管癌细胞系的肿瘤相关抗原CA125的表达量为6.5-7.5U/10⁶细胞/10天。

在一优选的实施方式中，所述女性食管癌细胞系的肿瘤相关抗原CA125的表达量为7U/10⁶细胞/10天。

在一优选的实施方式中，所述女性食管癌细胞系的肿瘤相关抗原CA199的表达量低于58U/10⁶细胞/10天。

在一优选的实施方式中，所述女性食管癌细胞系的肿瘤相关抗原CA199的表达量低于57U/10⁶细胞/10天。

在一优选的实施方式中，所述女性食管癌细胞系的倍增时间为142-147小时，优选的，所述女性食管癌细胞系的倍增时间为145小时。

在一优选的实施方式中，所述女性食管癌细胞系表达细胞角蛋白及细胞角蛋白5/6。

在一优选的实施方式中，所述女性食管癌细胞系不表达癌胚抗原。

本发明还提供了所述女性食管癌细胞系在制备抗肿瘤药物中的应用。

与现有技术相比，所述女性食管癌细胞系是蒙古人种(黄种人)由来的原代细胞，具有表达肿瘤标志物CA125、CA199、CK以及CK5/6的特点，其能在5％CO2的培养条件下生长，使用培养基为常见基础培养基RPMI-1640，能够完成各类分子生物学实验，该女性食管癌细胞系的实验结果也更接近临床个体实验结果，因此所述女性食管癌细胞系的建立，对研究黄种人食管癌的发病和治疗具有重要意义，为食管鳞癌的发病机制及治疗提供新的研究模型，具有重要的理论和实际应用价值。

保藏信息

本发明所涉及的女性食管癌细胞系已于2017年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：C2017203，培养物名称为人食管癌细胞EC-1703。

附图说明

图1是根据本发明一实施方式的女性食管癌细胞系培养状态下在倒置显微镜下放大400倍的照片；

图2是根据本发明一实施方式的女性食管癌细胞系的HE染色后在倒置显微镜下放大400倍的照片；

图3是根据本发明一实施方式的女性食管癌细胞系在倒置显微镜下放大400倍的CK染色结果；

图4是根据本发明一实施方式的女性食管癌细胞系在倒置显微镜下放大400倍的CK5/6染色结果；

图5是根据本发明一实施方式的女性食管癌细胞系的STR鉴定结果。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。

实施例1细胞培养

(1)原代培养：从一例食管癌患者(蒙古人种，女，75岁，肿瘤位于食管下段，病理示食道鳞状细胞癌，该患者为签署知情同意书的河北医科大学第一医院就诊患者)获得新鲜的临床食管癌内镜活检标本3-5块，每块约0.2×0.2×0.2cm³大小，用PBS缓冲液(含1000U/ml青霉素G、1000μg/ml链霉素)冲洗肿瘤组织块3次，去除结缔组织和坏死组织，浸泡5-10min；将肿瘤组织块浸泡在含10％胎牛血清1640培养基的培养皿中，用无菌手术刀将培养皿中组织块切碎，吸尽培养皿中的培养基，将切碎的肿瘤组织块放入盛有2ml血清的25cm²培养瓶中。将培养瓶放入37℃孵箱5％CO2条件下静置培养至细胞长满培养瓶底80％以上；原代培养每3～4天换液一次。

当由肿瘤组织块中长出的细胞布满培养瓶底部后，进行细胞传代。

(2)传代培养：吸弃进行原代培养的培养瓶中的培养液，向培养瓶中加入胰蛋白酶-EDTA消化液(含0.25％胰蛋白酶、0.53mMEDTA)，待细胞脱落后，终止消化，加入新鲜的RPMI1640培养液[含10％胎牛血清、1％青链霉素]，细胞生长良好，形态较为均一。传代至25代以上。得到女性食管癌细胞系。

本发明的RPMI-1640培养基为本领域常见的培养基。

实施例2形态学观察

将实施例1培养的女性食管癌细胞系置于倒置显微镜下，在明视野下进行拍照，可以看到细胞生长旺盛，背景清晰，细胞呈不规则多边形(详见图1)，符合上皮样细胞的特点，命名为人食管癌细胞EC-1703，并已于2017年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2017203，该人食管癌细胞EC-1703倍增时间大约为145小时。

将消化后的人食管癌细胞EC-1703悬液进行细胞涂片，95％酒精固定1小时，水洗，苏木素15秒，水洗，盐酸酒精酸化，水洗，氨水返蓝，水洗，伊红2分钟，水洗，梯度酒精脱水，中性树胶封片后显微镜下观察，人食管癌细胞EC-1703的HE染色如图2所示，细胞大小不一，细胞核大深染，部分呈核分裂，符合恶性肿瘤特征。

实施例3肿瘤标志物检测

采用化学发光法检测人食管癌细胞EC-1703中肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)、CA-199及CA-125的表达量，结果显示CA125表达量是7U/10⁶细胞/10天；细胞CA199表达量测定：CA199表达量是<57U/10⁶细胞/10天；癌胚抗原(CEA)表达量为0。

实施例4肿瘤细胞免疫组化：

待人食管癌细胞EC-1703消化离心，将离心后细胞悬液制成细胞涂片，95％酒精固定1小时，浸泡于PBS缓冲液中备用。柠檬酸修复液煮沸修复20min后放置室温，PBS冲洗5min×2次；滴加一抗约50μl(CK及CK5/6)，4℃冰箱过夜，第二天放置室温后PBS缓冲液5min×2次，滴加生物素化二抗工作液，室温孵育30min，PBS冲洗，5min×2次；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育30min，PBS冲洗，5min×2次；配制新鲜DAB溶液，显色5min，镜下观察，清水终止显色，苏木素复染，常规脱水、封片。结果CK及CK5/6在细胞浆阳性表达，见图3及图4，说明人食管癌细胞EC-1703是鳞癌来源的。

实施例5STR鉴定

中国典型培养物保藏中心对人食管癌细胞EC-1703进行STR鉴定，见图5，得出结论：人食管癌细胞EC-1703无人源细胞系的交叉污染。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。