大黄素糖基转移酶蛋白FtUGT75R2及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及大黄素糖基转移酶蛋白ftugt75r2及其编码基因与应用。

背景技术

大黄素(emodin)化学名为1,3,8-三羟基-6甲基蒽醌(1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone)。分子式为c15h10o5，几乎不溶于乙醇及碱溶液。大黄素是蓼科植物中比较特异的一种化合物，存在于大黄、何首乌和苦荞中，资源丰富，来源十分广泛，并且提取方法和纯化工艺相对简单。药理实验研究表明，大黄素具有抑菌、泻下、利尿、解痉、抗炎、止咳、抗肿瘤的作用，同时，临床上还有利于治疗ⅱ型糖尿病，在减肥等保健品上应用广泛。但由于大黄素水溶性差，极大地制约了大黄素的推广和应用。大黄素经过糖基化修饰后，不仅可以极大地提高其可溶性，还可以增强其药效。大黄素6-o-葡萄糖苷被lee等报道能够下调内皮细胞蛋白c受体脱落和抑制高糖诱导的实验研究血管炎症，因此它可以被用作治疗血管性炎症的治疗疾病候选药物，同时，对糖尿病并发症和动脉粥样硬化有显著的治疗益处。大黄素8-o-葡萄糖苷可用于制备预防或治疗老年痴呆症的药物或食品，对脑内真正的乙酰水解酶有良好的可逆抑制作用，对β淀粉样蛋白引起的神经损伤有一定的保护作用，还可以改善东莨菪碱所致记忆功能紊乱的能力。以大黄素为基本结构，进行结构修饰以增强大黄素活性，扩大应用范围是一项重要的研究工作。

对大黄素进行结构修饰，国内外已有许多研究报道。目前大黄的结构修饰主要采用化学方法，得到多个衍生物。谭嘉恒等人以大黄素为母体，在其侧链上设计合成了一类新型含氮的大黄素衍生物，包括叠氮化合物、甲基氨化合物和季铵盐化合物，实验发现，这类衍生物具有良好的抗肿瘤活性。larsteich等人以大黄素作为原料，结构修饰后，获得了8个衍生物，研究发现1，3，8三羟基-6-甲基蒽醌具有很强的抗肿瘤活性。demirezer等人发现大黄素及其衍生物，对多种肿瘤细胞有抑制作用。张弘等人在实验室内以天然存在的大黄素为原料合成了甲基化衍生物大黄素甲醚和三甲氧基大黄素，并进行了杀菌和杀虫活性研究，发现3个蒽醌类化合物对黄瓜白粉的活性有明显差异。应用化学方法进行结构修饰存在选择性不强，副产物多，后期分离困难，设备投资大，技术要求高，大量使用有机溶剂，存在环境污染的隐患。现在也有利用微生物法来获得大黄素修饰物的报道。

早在2004，研究人员利用兰色犁头霉对大黄素进行糖基化修饰，最终获得大黄素-糖苷混合物，其中包括大黄素6-葡萄糖苷和大黄素8-葡萄糖苷。ghimire等利用地衣芽孢杆菌dsm13中的glycosyltransferase(yjic)对大黄素进行体外酶促修饰，结果表明，yjic具有催化大黄素等芳香族化合物糖基化，形成大黄素糖苷混合物的能力。综上，大黄素糖苷的修饰，化学法污染大，成本高，而现有的微生物法或酶法，产物不纯，分离成本高。虽然现在已有大黄素糖苷生物或化学合成的报道，但这些方式存在或者环境非友好型的问题，或者目标产物多样性的问题。因此，亟待一种特异性高的酶，来特异合成单一的大黄素糖苷。

技术实现要素：

为了弥补以上领域的不足，本发明基于苦荞(fagopyrumtataricum)基因组数据，用反向遗传学的方法找到并鉴定大黄素6-o-葡萄糖苷合成的特异糖基化修饰酶ftugt75r2，为生物合成大黄素6-o-葡萄糖苷提供了大黄素6-o-葡萄糖苷糖基转移酶蛋白及其编码序列和转基因实验基础。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有大黄素6-o-葡萄糖苷糖基转移酶活性的由a)衍生的蛋白质。

所述大黄素6-o-葡萄糖苷糖基转移酶活性是催化大黄素生成大黄素6-o-葡萄糖苷的活性。

所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示dna分子；

2)在严格条件下与1)限定的dna分子杂交的dna分子；

3)与1)或2)限定的dna分子具有90％以上的同源性的dna分子。

将该基因命名为ftugt75r2，将其编码的蛋白命名为ftugt75r2。具体信息如下：ftugt75r2基因序列如序列表中序列1所示，序列表中序列1自5’末端第1位到第1476位为开放阅读框，开放阅读框部分为1476bp，其编码序列表中序列2所示的蛋白，序列2由491个氨基酸组成。

含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

扩增所述编码基因全长或其任一片段的引物也属于本发明的保护范围，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

所述的蛋白在作为大黄素6-o-葡萄糖苷糖基转移酶中的应用也属于本发明的保护范围。

所述大黄素6-o-葡萄糖苷糖基转移酶是催化大黄素生成大黄素6-o-葡萄糖苷的酶。

所述的蛋白、所述编码基因在催化大黄素生成大黄素6-o-葡萄糖苷中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明主要是基于苦荞基因组，获得大黄素糖基转移酶序列，并通过原核表达重组蛋白，确认ftugt75r2可以催化大黄素生成大黄素6-o-葡萄糖苷。

附图说明

图1为重组载体pmal-c2x-ftugt75r2的鉴定结果；其中，pmal为pmalc2x。

图2为表达菌株novablue中重组载体转化子鉴定结果；其中，pmal为pmalc2x。

图3为ftugt75r2重组蛋白sds-page胶图；其中，75r2为ftugt75r2，m代表maker。

图4为ftugt75r2对大黄素催化活性鉴定uplc图；e表示大黄素；product代表大黄素糖苷。

图5为ftugt75r2对大黄素催化产物ms鉴定图；大黄素1-o-g、大黄素8-o-g和产物分别代表大黄素1-o-葡萄糖苷、大黄素8-o-葡萄糖苷和ftugt75r2催化产物。

具体实施方式

实施例1、克隆大黄素糖基转移酶的编码基因

一、基因克隆的方法和步骤

收集苦荞(晋荞2号，为贵州师范大学陈庆富教授提供，记载过晋荞2号的非专利文献是：黎瑞源，石桃雄，陈其皎，潘凡，陈庆富(2017)中国35个苦荞审定品种est-ssr指纹图谱构建和遗传多样性分析，植物科学学报，35,267-275.)的叶和种子，提取rna，反转录为cdna，设计引物序列(如表1)，以叶和种子的混合cdna为模板，利用kod高保真酶克隆到ftugts基因片段(kod高保真酶pcr体系总体积为50μl：5μl10ⅹbuffer，3μlmgso4，5μldntp(2mm)，5μl引物(10mm)，1μl模板和8μl水，程序如表2)。借助peasy-blunt载体(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为cb111-01(20rxns))，成功将ftugts片段连入载体上(连接体系总体积为3μl：0.5μlmixbufferwithenzyme和2.5μl模板，25℃反应30min)。连接体系直接转化transt1感受态(购自北京全式金生物技术有限公司)，挑选阳性克隆测序(菌落pcr体系总体积为20μl：10μlmixbuffer，1μl模板，1μl引物和8μl水，程序如表3)，与rnaseq序列比对，发现，核苷酸序列与原数据99％相似度，以实际测序结果为准。

表1克隆基因所用引物序列

表2kod高保真酶pcr反应程序

表3菌落pcr反应程序

二、获得基因序列以及其编码的蛋白序列

测序结果表明，利用表1中的引物扩增得到的基因含有1476个核苷酸，编码491个氨基酸的蛋白，将该基因命名为ftugt75r2，将其编码的蛋白命名为ftugt75r2。具体信息如下：ftugt75r2基因序列如序列表中序列1所示，序列表中序列1自5’末端第1位到第1476位为开放阅读框，开放阅读框部分为1476bp，其编码序列表中序列2所示的蛋白，序列2由491个氨基酸组成。

三、基因功能的验证

借助原核系统对基因功能进行了验证，构建pmal-c2x-ftugt75r2载体，测序确认序列正确后，将载体成功转入原核表达菌株novablue做体外验证。

1.体外酶活鉴定ftugt75r2功能

首先，给ftugt75r2基因片段加上酶切位点接头(体系和程序跟上述基因克隆方法一致，引物信息如表4)；ftugt75r2基因片段(带有酶切位点)酶切后，利用t4-dna连接酶，将其构建到表达载体pmal-c2x(购自newenglandbiolabs.，产品目录号为e8200s)上(连接体系总体为7μl：3.5μlmixbuffer，2.75μlftugt75r2基因片段和0.75μlpmal-c2x；16℃反应过夜)，得到重组载体pmal-c2x-ftugt75r2。

其次，连接体系转化transt1(购买peasy-blunt载体时赠送)后，挑选阳性克隆；利用表3的pcr程序对单克隆pcr，获得阳性克隆如图1。阳性克隆转接到5mllb抗性培养基中，37℃，200rpm摇床过夜后，提取质粒，将质粒转化到表达菌株novablue(购自merckmillipore，德国达姆施塔特默克集团(merckkgaa)的生命科学业务公司，产品目录号为69284-3)，利用菌落pcr程序(表3)，鉴定阳性克隆如图2。

表4.构建原核表达载体所用引物序列

表注：序列中小写字母为保护碱基和酶切位点。

重组蛋白的诱导、纯化、酶活分析和产物鉴定如下：

1)重组蛋白的诱导

分别挑取pmal-c2x-ftugt75r2与pmal-c2x单克隆菌落于2mllb(含carb100mg/l)液体培养基中37℃中振荡(200rpm)过夜培养。

取1ml过夜培养的菌液加入100ml新鲜的lb培养液(含carb100mg/l，0.2％过膜灭菌的葡萄糖)中，37℃摇床培养至600nmod值为0.5-0.6时，取1ml菌液，收集菌体作为对照。

在100ml菌液中加入30μliptg(1m，异丙基-β-d-硫代半乳苷)，终浓度为0.3mm，于16℃培养24h。

4℃，8,000×g离心3mins，收集菌体。

2)重组蛋白的纯化

根据pmal融合蛋白和纯化系统(newenglandbiolabinc.)手册对重组ftugt75r2蛋白进行纯化。简而言之，柱缓冲液重悬上面收集的菌液沉淀，并-20℃过夜。次日样品融化后，利用超声破碎仪对细胞破碎，释放蛋白，高速9,000×g离心30mins后，待上样；利用柱缓冲液(8倍柱体积)活化亲和柱填料(流速为1ml/min)，将样品5倍稀释后上样，待样品都流过亲和柱填料后，用12倍柱体积的柱缓冲液冲洗杂蛋白，最后利用5倍柱体积柱缓冲液(10mm麦芽糖)洗脱目标蛋白。利用millpore(30kda)浓缩并置换成酶活反应缓冲液。sds-page电泳后，考马斯亮蓝染色，确认重组蛋白(如图3)，大小在70-100kda之间，表明为目标蛋白(目标蛋白+mbp标签蛋白约为90kda)。

3)酶活性的测定

一般酶活反应体系为50μl，如表5。37℃，反应1h后，用等体积甲醇中止反应，13,000rpm离心10mins。取20μl上样。

表5.重组蛋白酶活反应体系

4)酶活产物分析与鉴定

酶活反应的供体包括udp-葡萄糖，受体为大黄素。分析酶活产物uplc图谱(图4)，发现ftugt75r2对大黄素具有糖基化活性。

hplc条件：

hplc型号：agilent1100infinity

流动相：a相：0.1％甲酸水溶液；b相：乙腈。

洗脱梯度：0-30min，5％-70％b；30-35min，100％b；35-40min，100％b；

dad检测波长：254nm。

利用质谱鉴定酶活产物(图4)，发现ftugt75r2对于受体为大黄素的酶活反应产物峰只有一个，其质荷比均比底物质荷比多出162(一个葡萄糖和底物羟基脱去一分子水后，产物增加的分子量)，表明其产物为大黄素的单葡萄糖苷。将产物峰与标准品大黄素1-o-葡萄糖苷和大黄素8-o-葡萄糖苷的保留时间和质谱数据进行比对(图5)，发现产物峰保留时间与两个标准品不同，但大黄素只在1位、3位和8位上有羟基，即o位糖基化位点，结合其质谱数据，表明酶活产物为大黄素6-o-葡萄糖苷。综上所述，体外酶活证据显示ftugt75r2编码了催化糖基化大黄素生成大黄素6-o-葡萄糖苷的糖基转移酶。

质谱条件：

质谱前的样品准备，2.5倍体积乙酸乙酯抽提酶活反应液中的tris-hcl，n2吹干乙酸乙酯后，50μl甲醇溶解，1μl上样。

利用uplcms/ms对样品进行分离，柱子为，eclipseplusc18rrhd(1.8μm，2.1×50mmi.d.；agilent)，流动相与uplc相同，洗脱梯度为0min，95％a；5mins，5％a，最后95％a平衡(5-7mins)，流速为0.20ml/min，检测波长同上。

uplcms/ms质谱条件，电喷雾离子化，全离子扫描，负离子模式negative-ion(ei)质谱分析。气体温度(heathgastemperature)：300℃；气体流量(gasflow)，5.0l/min，毛细管电压(capillaryvoltage)，3500v；喷嘴电压(nozzlevoltage)，500v；deltaemv，200v。mstof(expt)：fragmentor，120v；skimmer，65v；采集质谱范围m/z：100-1000。收集数据并利用masshunter(versionb.07.00)分析毛状根中大黄素糖苷的含量。大黄素在负离子模式下的特征离子为269、225和210；大黄素6-o-葡萄糖苷的特征离子为，431.09、311.2和269。

5)ftugt75r2的催化活性

为进一步了解ftugt75r2重组蛋白的催化特性，我们检测了它对于大黄素的催化活性。酶活反应体系，总体积为50μl，其中包括：10μgftugt75r2重组蛋白与200μmudp-葡萄糖和0-400μm大黄素(分别为10、50、100、200、400μm)。37℃反应30min后，等体积甲醇终止反应后，14000rpm高速离心后，过0.22μm膜后，取2μluplc检测。实验发现，ftugt75r2重组蛋白对于大黄素的km为208.5μm，kcat/km为0.02min^-1μm^-1(如表6)。

表6.ftugt75r2重组蛋白酶催化活性

序列表

<110>中国中医科学院中药研究所

<120>大黄素糖基转移酶蛋白ftugt75r2及其编码基因与应用

<130>p180341-zyy

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1476

<212>dna

<213>苦荞（晋荞2号）

atggatgctatttcaaagaccgacgataaaccaccgcacattgtgctagtggcgtatcca60

atccaaagccacctaaacccagctctccaattcgtcggacacctcctcaactccggtgcc120

cacgtcaccttaaccaccaccgtcgccggagctaaacgcatgaacatgtccggtggcacc180

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atctcctcttccgacaagcaggccagcgatgtttatatggagaccttcaagcggcgcggc300

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aatccaatcgttttagtcaacacgtttgactcactcgaacatgaaatcattgaatccctt720

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gacggtgggtcgtcggatgtgaatatcagggagttcgtcaacgaggtttggaagacgtcg1440

aaaacccggtttgatgctggacaagaggaattgtga1476

<210>2

<211>491

<212>prt

<213>苦荞（晋荞2号）

<400>2

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151015

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195200205

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260265270

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420425430

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435440445

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450455460

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465470475480

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<210>3

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