本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种乙醇脱氢酶突变体及其编码基因和应用。
背景技术
生物催化技术是一种以微生物细胞或酶作为催化剂进行物质转化的技术。它具有条件温和、副反应少、选择性强、能耗低以及对环境友好等优点，已经取得了显著的成就。尤其是在绿色化学和医药领域引起了广泛的关注。其中酶作为一种常见的生物催化剂，在生物催化过程中具有具足轻重的作用。
氧化还原反应是重要的一类化学反应。氧化还原酶是这类催化反应的重要的生物催化剂，但是通常需要辅酶来完成酶催化反应中的电子转移，而辅酶价格昂贵。因此辅酶的有效再生成为氧化还原酶工业应用的关键。构建经济高效的辅酶再生体系来实现辅酶的再生，既可解决工业中辅酶价格昂贵的难题，也为氧化还原酶的工业应用打下良好的基础，符合当前国民经济要求绿色低碳的趋势。
乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，简称adh)的系统名为:乙醇:辅酶i氧化还原酶(alcohol:nad+oxidoreductase)，大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中，是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异性。乙醇脱氢酶够以nad(p)+为辅酶,催化伯醇和醛之间的可逆反应:ch3ch2oh+nad(p)+→ch3cho+nad(p)h+h+。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种催化活性高乙醇脱氢酶突变体，制备方法和应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
本发明提供一种乙醇脱氢酶突变体基因，其来源为乳酸菌lactobacillus野生型基因seqidno.1。“野生型”是指在自然界发现的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中的序列，能够从自然界来源中分离并且没有被人为操作有意修饰。
本发明提供一种乙醇脱氢酶突变体，其脱氢酶活性是野生型乙醇脱氢酶活性2-2000倍。
上述乙醇脱氢酶突变体，根据密码子优化、重叠延伸pcr、重组pcr、大引物pcr和环状质粒pcr等方法对其进行突变，从而获得该乙醇脱氢酶突变体目的基因，其核苷酸序列为seqidno.2。
一种乙醇脱氢酶突变体，氨基酸序列如seqidno.3所示。
本发明提供一种乙醇脱氢酶突变体基因的重组质粒，其可通过本领域常规方法将本发明的乙醇脱氢酶基因的核苷酸序列连接于各种原核表达载体上构建而成。如pgex，pmal，pet系列等原核表达载体，更优选地选自pet系列。本发明的一个实施例中所使用的质粒为pet-30a(seqidno.6)。
本发明提供一种生产所述的乙醇脱氢酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌中包含本发明所述的乙醇脱氢酶突变体基因或本发明所述的重组载体。
上述基因工程菌的宿主细胞优选为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)bl21(de3)。
本发明提供一种制备所述的乙醇脱氢酶突变体的方法，包括发酵培养该基因工程菌，以及收集和制备重组乙醇脱氢酶。
上述方法包括在一定生产罐发酵条件下，进行工业化制备所述重组乙醇脱氢酶的步骤；所述的生产罐发酵条件优选：do35％以上，空气流量1:1.5vvm。
所述的方法，优选包括在发酵条件下，制备所述乙醇脱氢酶的步骤。
本发明所述的乙醇脱氢酶突变体在氧化还原反应中辅酶nadh以及nadph的再生中的应用。
有益效果：
本本发明提供一种催化活性高、ph及热稳定性、耐受性较好的乙醇脱氢酶突变体，可用于辅酶nadh以及nadph的再生。
本发明所涉及的酶具有优良的催化活力，其所催化的反应简单温和，无废物排放，反应转化率高，具有较好的应用前景。
具体实施方式
实施例1：野生型乙醇脱氢酶基因工程菌的建立
根据ncbi收录的乳酸菌lactobacillus乙醇脱氢酶野生型基因序列(genbank:ay267012.1)进行序列优化后人工合成全基因片段，通过pcr扩增扩展该片段(片段两侧加bamhⅰ和hindiii内切酶基因片段)，其核苷酸序列如seqidno.1所示。并利用bamhⅰ和hindiii内切酶位点将基因插入pet30a质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌bl21(de3)中建立乙醇脱氢酶基因工程菌。所用pcr扩增乙醇脱氢酶基因的引物为：
f’：cgcggatccatgactgatcgtttaaaagg(seqidno.4)
r’：cccaagcttttattgagcagtgtatccac(seqidno.5)
实施例2乙醇脱氢酶突变体基因的获得
本研究利用易错pcr随机突变的方法，对乙醇脱氢酶进行了蛋白质工程改造。易错pcr是在采用dna聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dntp浓度或运用低保真度dna聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。
本研究采用较低的taq聚合酶在特定措施下很容易向扩增产物中掺入随机突变的原理，同时利用mn2+替代天然辅助因子mg2+增加易错概率。
50μlpcr体系如下:5×pcrbuffer10μl，datp(2.5mmol/l)1μl，dgtp(2.5mmol/l)1μl，dctp(2.5mmol/l)1μl，dttp(2.5mmol/l)1μl，mgcl2(5mmol/l)1μl，mncl2(5mmol/l)1μl，乙醇脱氢酶模板基因3μl，taqdna聚合酶0.5μl(5u/μl)，再加入灭菌双蒸水到50μl。其中扩增乙醇脱氢酶突变体基因为：
正向引物f’：cgcggatccatgactgatcgtttaaaagg(seqidno.4)，
反向引物r’：cccaagcttttattgagcagtgtatccac(seqidno.5)
pcr反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s及72℃延伸40s进行35个循环；于72℃下继续延伸10min，冷却至4℃。
实验流程：
按照实施例1的方法pcr扩增乙醇脱氢酶基因并利用bamhⅰ和hindiii内切酶位点将基因插入至pet30a质粒中，作为基因突变模板；
易错pcr扩增乙醇脱氢酶的基因，扩增后基因片段链接至pet30a载体，将连接后载体转入之大肠杆菌bl21(de3)中建立乙醇脱氢酶基因突变文库；
利用大肠杆菌bl21(de3)为宿主，pet30a质粒为载体，表达扩展乙醇脱氢酶，高通量筛选高活性突变株；
突变后高活性乙醇脱氢酶基因进行鉴定。筛选出的高活性乙醇脱氢酶突变体基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。
乙醇脱氢酶基因引物为：正向引物f’：cgcggatccatgactgatcgtttaaaagg(seqidno.4)反向引物r’：cccaagcttttattgagcagtgtatccac(seqidno.5)
按实施例1所述方法构建表达该乙醇脱氢酶突变体的基因工程菌，并将其命名为bl21(de3)adh-h。
实施例3：乙醇脱氢酶的产生-摇瓶方案
将包含编码目标乙醇脱氢酶的质粒的大肠杆菌的单个微生物菌落接种到含卡那霉素(50μg/ml)的100mllb培养基中(蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，ph7.2)。大肠杆菌在摇床中在37℃生长，伴随以250rpm摇动，培养4小时。转接按比例1：200，将1ml菌体培养液于200ml含卡那霉素的lb培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值以监测菌体生长密度。当培养物的od600是0.6至0.8时，通过加入异丙基βd-硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度0.4mm来诱导乙醇脱氢酶基因的表达，然后培养持续过夜(至少16小时)。通过离心(5000rpm、15min、4℃)收集细胞，丢弃上清液。将细胞沉淀重悬在等体积的冷的(4℃)含100μm吡哆醛5’-磷酸(plp)的100mm三乙醇胺(氯化物)缓冲液、ph7.5中，如上述通过离心收集。超声破碎后。通过离心(13000rpm、30min.、4℃)去除细胞碎片。收集澄清的裂解物上清液制得粗酶液，储存在-20℃。可选地，对冷冻的澄清裂解物的冷冻干燥提供了粗制乙醇脱氢酶干粉。可选地，细胞沉淀(洗涤前或洗涤后)可储存在4℃或80℃。
实施例4：乙醇脱氢酶的产生-发酵方案
将包含带有目标乙醇脱氢酶基因的质粒的大肠杆菌的单个微生物菌落接种含卡那霉素(50μg/ml)的200mllb培养基中(蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，甘油10g/l，1.0g/l氯化铵、6.0g/l磷酸氢二钠、3.0g/l磷酸二氢钾，ph7.2)中。大肠杆菌在摇床中在37℃生长(至少5小时)，伴随以250rpm摇动。将种子液按8％的接种量加入含有8l发酵培养基的15l发酵罐中，发酵液通过加入氨水维持ph7.0-7.2，罐温37℃，搅拌转速400rpm，发酵过程中控制溶氧(do)40％-45％左右，空气流量1:1.5vvm，培养8小时后加入终浓度为0.4mmol/l的iptg以诱导乙醇脱氢酶的表达，此后继续发酵12-16小时，罐温26℃。发酵过程中通过加入含蛋白胨70g/l，nacl35g/l，酵母提取物35g/l，mgso44.5g/l，6.0g/l磷酸氢二钠、3.0g/l磷酸二氢钾，ph7.2的补料液维持培养物的生长。发酵结束后将培养物冷却至4℃保存。
将保存的发酵液经离心、细胞破碎、离心除细胞碎片，冷冻等常规处理，制备得到乙醇脱氢酶粗酶液并于-20℃保存。
实施例5乙醇脱氢酶活力的测定
将含有甘氨酸/naoh(ph10.0)，2.5mmol/lnad(p)+和100mol/l乙醇的总体积为3000μl的反应体系于25℃温浴5min后，加入适量粗酶液，测定340nm处的吸光值。
酶活力定义：在上述条件下，每分钟催化生成1μmol的nad(p)h所需的酶量定义为一个酶活单位。
重组乙醇脱氢酶突变体的比活为1340u/mg，比突变之前提高了67.5％。
实施例6温度对酶稳定性的影响
将50μl乙醇脱氢酶粗酶液分别加入不同温度(20～45℃，温度间隔5℃)的ph10.0甘氨酸/naoh缓冲液中，保温30min后于冰浴中冷却，测定残余酶活。残余酶活为原始酶活的85％以上为稳定，从而确定重组乙醇脱氢酶的温度稳定性。重组乙醇脱氢酶突变体的最适温度为35～40℃，超过40℃后酶活逐渐降低。
实施例7ph对酶稳定性的影响
将50μl重组乙醇脱氢酶突变体粗酶液分别加入不同ph梯度(ph3.0-11，ph间隔1)的缓冲液中，37℃保温60min后于冰浴中冷却，测定残余酶活。残余酶活为原始酶活的85％以上为稳定，从而确定重组乙醇脱氢酶的ph稳定性。
重组乙醇脱氢酶突变体的最适ph为8.5。ph8-10范围内，37℃保温60min后残余酶活85％以上。
实施例8在乙醇中的稳定性
将重组乙醇脱氢酶突变体粗酶液与不同浓度的乙醇(0、400、800、1200、1600、2000mmol/l)等体积混合，于40℃温浴60min，测定残余酶活性。从而确定乙醇脱氢酶对乙醇的耐受性。
重组乙醇脱氢酶突变体在0、400、800、1200mmol/l乙醇中酶活仍保持85％以上。在1600、2000mmol/l乙醇中的残留酶活力都在55％以上。说明该酶对乙醇具有一定的耐受性。
序列表
<110>宿迁阿尔法科技有限公司
<120>一种乙醇脱氢酶突变体及其编码基因和应用
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