本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以草甘膦为筛选剂的胡萝卜遗传转化的方法。
背景技术
胡萝卜(daucuscarotal.)为伞形科植物，是重要的蔬菜作物之一。胡萝卜块根营养丰富，富含维生素a前体类胡萝卜素和植物纤维，在欠发达国家，胡萝卜已经成为维生素a的主要来源。关于胡萝卜的研究，在营养成分的鉴定、遗传工程改良新品种、基因组结构方面取得了非常瞩目的成就，胡萝卜全基因组测序的完成(iorizzo,m.,ellison,s.,senalik,d.,zeng,p.,satapoomin,p.,huang,j.,bowman,m.,iovene,m.,sanseverino,w.,cavagnaro,p.,etal.ahigh-qualitycarrotgenomeassemblyprovidesnewinsightsintocarotenoidaccumulationandasteridgenomeevolution.natgenet(2016)48:657-666)，是胡萝卜研究领域里程碑式的成就。然而胡萝卜遗传材料的获得主要依靠自然突变体，这严重限制了胡萝卜功能基因组学的研究。遗传转化的研究不仅能够促进胡萝卜基础研究的发展，而且为胡萝卜遗传性状的分子改良奠定了基础。
目前，胡萝卜的遗传转化技术虽然比较成熟，但是过程比较繁琐，耗时较长，应用的筛选条件假阳性比较高。建立一种高效省时的胡萝卜遗传转化方法具有重要价值。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新的胡萝卜遗传转化方法，旨在缩短获得再生胡萝卜植株的时间和/或提高转化阳性率。
本发明首先提供了一种胡萝卜遗传转化方法，是以草甘膦为筛选剂，对胡萝卜的外植体进行遗传转化。
所述“以草甘膦为筛选剂，对胡萝卜的外植体进行遗传转化”可包括如下步骤：
(1)将含有目的基因的重组表达载体导入农杆菌，得到重组农杆菌；
(2)取步骤(1)得到的重组农杆菌，对胡萝卜的外植体进行侵染；
(3)完成步骤(2)后，将所述外植体置于共培养培养基，进行共培养；
(4)完成步骤(3)后，将所述外植体置于诱导培养基，培养，获得愈伤组织；
(5)完成步骤(4)后，将所述愈伤组织依次置于初筛培养基和筛选培养基进行培养，获得胚性愈伤组织；
(6)完成步骤(5)后，将所述胚性愈伤组织置于分化培养基进行培养，获得出芽的胚性愈伤组织；
(7)完成步骤(6)后，将所述出芽的胚性愈伤组织置于生根培养基进行培养，获得胡萝卜转化苗。
所述步骤(3)中，所述共培养培养基中可含有0.3～0.8mg/l2，4-d(如0.3～0.5mg/l2，4-d、0.5～0.8mg/l2，4-d、0.3mg/l2，4-d、0.5mg/l2，4-d或0.8mg/l2，4-d)、3～7mg/lagno3(如3～5mg/lagno3、5～7mg/lagno3、3mg/lagno3、5mg/lagno3或7mg/lagno3)和200～400mg/ltimentin(如200～300mg/ltimentin、300～400mg/ltimentin、200mg/ltimentin、300mg/ltimentin或400mg/ltimentin)。所述共培养培养基中具体可含有0.5mg/l2，4-d、5mg/lagno3和300mg/ltimentin。所述共培养培养基具体可为含0.5mg/l2，4-d、5mg/lagno3和300mg/l特美汀(timentin)的ms固体培养基。
所述步骤(4)中，所述诱导培养基中可含有0.3～0.8mg/l2，4-d(如0.3～0.5mg/l2，4-d、0.5～0.8mg/l2，4-d、0.3mg/l2，4-d、0.5mg/l2，4-d或0.8mg/l2，4-d)、0.3～0.8mg/l6-ba(如0.3～0.5mg/l6-ba、0.5～0.8mg/l6-ba、0.3mg/l6-ba、0.5mg/l6-ba或0.8mg/l6-ba)、0.5～1.5mg/l草甘膦(如0.5～1.0mg/l草甘膦、1.0～1.5mg/l草甘膦、0.5mg/l草甘膦、1.0mg/l草甘膦或1.5mg/l草甘膦)、3～7mg/lagno3(如3～5mg/lagno3、5～7mg/lagno3、3mg/lagno3、5mg/lagno3或7mg/lagno3)和200～400mg/ltimentin(如200～300mg/ltimentin、300～400mg/ltimentin、200mg/ltimentin、300mg/ltimentin或400mg/ltimentin)。所述诱导培养基中可含有0.5mg/l2，4-d、0.5mg/l6-ba、1.0mg/l草甘膦、5mg/lagno3和300mg/ltimentin。所述诱导培养基具体可为含0.5mg/l2，4-d、0.5mg/l6-ba、1mg/l草甘膦、5mg/lagno3和300mg/ltimentin的ms固体培养基。
所述步骤(5)中，所述初筛培养基中可含有0.3～0.8mg/l2，4-d(如0.3～0.5mg/l2，4-d、0.5～0.8mg/l2，4-d、0.3mg/l2，4-d、0.5mg/l2，4-d或0.8mg/l2，4-d)、0.3～0.8mg/l6-ba(如0.3～0.5mg/l6-ba、0.5～0.8mg/l6-ba、0.3mg/l6-ba、0.5mg/l6-ba或0.8mg/l6-ba)、4～6mg/l草甘膦(如4～5mg/l草甘膦、5～6mg/l草甘膦、4mg/l草甘膦、5mg/l草甘膦或6mg/l草甘膦)、3～7mg/lagno3(如3～5mg/lagno3、5～7mg/lagno3、3mg/lagno3、5mg/lagno3或7mg/lagno3)和200～400mg/ltimentin(如200～300mg/ltimentin、300～400mg/ltimentin、200mg/ltimentin、300mg/ltimentin或400mg/ltimentin)。所述初筛培养基中具体可含有0.5mg/l2，4-d、0.5mg/l6-ba、5mg/l草甘膦、5mg/lagno3和300mg/ltimentin。所述初筛培养基具体可为含0.5mg/l2，4-d、0.5mg/l6-ba、5mg/l草甘膦、5mg/lagno3和300mg/ltimentin的ms固体培养基。
所述步骤(5)中，所述筛选培养基中可含有0.3～0.8mg/l2，4-d(如0.3～0.5mg/l2，4-d、0.5～0.8mg/l2，4-d、0.3mg/l2，4-d、0.5mg/l2，4-d或0.8mg/l2，4-d)、0.3～0.8mg/l6-ba(如0.3～0.5mg/l6-ba、0.5～0.8mg/l6-ba、0.3mg/l6-ba、0.5mg/l6-ba或0.8mg/l6-ba)、7～9mg/l草甘膦(如7～8mg/l草甘膦、8～9mg/l草甘膦、7mg/l草甘膦、8mg/l草甘膦或9mg/l草甘膦)、3～7mg/lagno3(如3～5mg/lagno3、5～7mg/lagno3、3mg/lagno3、5mg/lagno3或7mg/lagno3)和200～400mg/ltimentin(如200～300mg/ltimentin、300～400mg/ltimentin、200mg/ltimentin、300mg/ltimentin或400mg/ltimentin)。所述筛选培养基中具体可含有0.5mg/l2，4-d、0.5mg/l6-ba、8mg/l草甘膦、5mg/lagno3和300mg/ltimentin。所述筛选培养基具体可为含0.5mg/l2，4-d、0.5mg/l6-ba、8mg/l草甘膦、5mg/lagno3和300mg/ltimentin的ms固体培养基。
所述步骤(6)中，所述分化培养基中可含有4～6mg/l草甘膦(如4～5mg/l草甘膦、5～6mg/l草甘膦、4mg/l草甘膦、5mg/l草甘膦或6mg/l草甘膦)、3～7mg/lagno3(如3～5mg/lagno3、5～7mg/lagno3、3mg/lagno3、5mg/lagno3或7mg/lagno3)和200～400mg/ltimentin(如200～300mg/ltimentin、300～400mg/ltimentin、200mg/ltimentin、300mg/ltimentin或400mg/ltimentin)。所述分化培养基中具体可含有5mg/l草甘膦、5mg/lagno3和300mg/ltimentin。所述分化培养基具体可为含5mg/l草甘膦、5mg/lagno3和300mg/ltimentin的ms固体培养基。
所述步骤(7)中，所述生根培养基具体可为1/2ms固体培养基。
所述步骤(2)中，所述“侵染”的方法如下：将所述胡萝卜的外植体置于农杆菌侵染液中15～25min(轻柔震荡)；所述农杆菌侵染液可为将所述重组农杆菌悬浮于1/2ms液体培养基得到的。
所述农杆菌侵染液的od600nm值可为0.5～0.7(以1/2ms液体培养基为参照，如0.5～0.6、0.6～0.7、0.5、0.6或0.7)。所述农杆菌侵染液的od600nm值具体可为0.6(以1/2ms液体培养基为参照)。
上述任一所述的方法中，所述胡萝卜的外植体可为胡萝卜的下胚轴或用所述下胚轴截成的节段。所述下胚轴截成的节段的长度可为0.5mm±0.1mm。在本发明的实施例中，所述下胚轴截成的节段的长度具体为0.5mm。获得所述胡萝卜的下胚轴的方法可为：将无菌的胡萝卜种子置于1/2ms固体培养基，23-28℃(如23-25℃、25-28℃、23℃、25℃或28℃)暗培养6-8d(如6-7d、7-8d、6d、7d或8d)；然后取下胚轴。
所述步骤(3)中，所述共培养的条件可为23～26℃(如23-25℃、25-26℃、23℃、24℃或25℃或26℃)、暗培养64～80h(如64～72h、72～80h、64h、72h或80h)。
所述步骤(4)中，所述培养的条件可为23-28℃(如23-25℃、25-28℃、23℃、25℃或28℃)、光暗交替培养7-10d(如7-8d、8-10d、7d、8d或10d)。
所述步骤(5)中，所述培养的条件可为23-28℃(如23-25℃、25-28℃、23℃、25℃或28℃)、光暗交替培养7-10d(如7-8d、8-10d、7d、8d或10d)。
所述步骤(6)中，所述培养的条件可为23-28℃(如23-25℃、25-28℃、23℃、25℃或28℃)、光暗交替培养10-30d(如10-20d、20-30d、10d、20d或30d)。
所述步骤(7)中，所述培养的条件可为23-28℃(如23-25℃、25-28℃、23℃、25℃或28℃)、光暗交替培养2-4周(如2-3周、3-4周、2周、3周或4周)。
所述光暗交替培养的周期具体可为16h光照培养/8h黑暗培养。
所述光暗交替培养时的光照强度可为1500～2500lx。
本发明还保护用于胡萝卜遗传转化的试剂盒；所述试剂盒含有所述初筛培养基和/或筛选培养基和/或共培养培养基和/或诱导培养基和/或分化培养基和/或生根培养基。
每1lms固体培养基可由如下组分组成：4.43gms粉末、30g蔗糖和3g植物凝胶，其余为水。所述ms固体培养基的ph值可为5.8-6.0(如5.8、5.9或6.0)。
每1l1/2ms固体培养基可由如下组分组成：2.22gms粉末、30g蔗糖和3g植物凝胶，其余为水。所述1/2ms固体培养基的ph值可为5.8-6.0(如5.8、5.9或6.0)。
每1l1/2ms液体培养基可由如下组分组成：2.22gms粉末和30g蔗糖，其余为水。所述1/2ms液体培养基的ph值可为5.8-6.0(如5.8、5.9或6.0)。
所述ms粉末可为phytotech公司的产品，产品目录号为m519。
所述植物凝胶可为sigma公司的产品，产品目录号为p8169。
上文中，所述胡萝卜具体可为胡萝卜品种黑田五寸。
实验证明，本发明建立的以草甘膦为筛选剂的胡萝卜遗传转化方法，不仅大大缩短了获得再生植株的时间(60-70d)，而且具有较高的转化阳性率(91％)。与传统的以卡那霉素为筛选剂的胡萝卜遗传转化方法相比，获得再生植株的时间缩短两周左右，转化阳性率提高了6％。由此可见，本发明建立的胡萝卜遗传转化方法是一种高效可行的遗传转化方法，可大大减少转基因鉴定的工作量，具有重大的应用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
光暗交替培养即光照培养和暗培养交替。光照培养时的光照强度为2000lx。光暗交替培养的周期具体为：16h光照培养/8h黑暗培养。
胡萝卜品种黑田五寸为北京京研益农种业有限责任公司的产品；胡萝卜品种黑田五寸在下文中简称黑田五寸。ms粉末为phytotech公司的产品，产品目录号为m519。植物凝胶为sigma公司的产品，产品目录号为p8169。
本发明涉及的培养基如下：
ms固体培养基：将4.43gms粉末和30g蔗糖溶于1l蒸馏水，调节ph值至5.8-6.0，然后加入3g植物凝胶，121℃高压灭菌20min。
1/2ms固体培养基：将2.22gms粉末和30g蔗糖溶于1l蒸馏水，调节ph值至5.8-6.0，然后加入3g植物凝胶，121℃高压灭菌20min。
1/2ms液体培养基：将2.22gms粉末和30g蔗糖溶于1l蒸馏水，调节ph值至5.8-6.0，121℃高压灭菌20min。
yeb液体培养基：将牛肉浸膏5g、酵母提取物1g、蛋白胨5g、蔗糖5g和mgso4·h2o0.5g溶于1l蒸馏水，调节ph值至7.0，121℃高压灭菌20min。
诱导培养基：含0.5mg/l2，4-d、0.5mg/l6-ba、1mg/l草甘膦、5mg/lagno3和300mg/ltimentin的ms固体培养基。
共培养培养基：含0.5mg/l2，4-d、5mg/lagno3和300mg/l特美汀(timentin)的ms固体培养基。
初筛培养基：含0.5mg/l2，4-d、0.5mg/l6-ba、5mg/l草甘膦、5mg/lagno3和300mg/ltimentin的ms固体培养基。
筛选培养基：含0.5mg/l2，4-d、0.5mg/l6-ba、8mg/l草甘膦、5mg/lagno3和300mg/ltimentin的ms固体培养基。
分化培养基：含5mg/l草甘膦、5mg/lagno3和300mg/ltimentin的ms固体培养基。
实施例1、以草甘膦为筛选剂的胡萝卜遗传转化方法的建立
本发明的发明人经过大量实验，建立了以草甘膦为筛选剂的胡萝卜遗传转化方法。该方法获得再生植株的时间为60-70d。具体步骤如下：
一、种子的消毒和培养
1、取黑田五寸种子，置于30℃的温水中浸泡4h。
2、完成步骤1后，取所述黑田五寸种子，先加入75％(v/v)乙醇水溶液表面消毒2min，在超净台中用灭菌水冲洗3遍；然后加入15％(m/v)的次氯酸钠水溶液消毒15min，在超净台中用灭菌水冲洗5遍。
3、完成步骤2后，取所述黑田五寸种子，先用无菌滤纸吸干种子表面的水分，再置于1/2ms固体培养基，25℃暗培养7d。
二、农杆菌侵染液的制备
1、将pcambia3301载体(记载与如下文献中：zhu,j.,song,n.,sun,s.,yang,w.,zhao,h.,song,w.,andlai,j.efficiencyandinheritanceoftargetedmutagenesisinmaizeusingcrispr-cas9.jgenetgenomics(2016)43:25-36.)转化根癌农杆菌lba4404，经鉴定，得到阳性重组农杆菌。
pcambia3301载体中含有β-葡萄糖苷酸酶的编码基因(即gus基因)，可用于转基因胡萝卜的鉴定。
2、完成步骤1后，将所述阳性重组农杆菌接种到yeb液体培养基，28℃振荡培养，直至菌液的od600nm值达到0.6左右。
3、取步骤2得到的菌液，6000rpm离心2min，收集沉淀。
4、取步骤3收集的沉淀，加入1/2ms液体培养基重悬，得到农杆菌侵染液。以1/2ms液体培养基为参照，调整农杆菌侵染液的od600nm值达到0.6左右。
三、农杆菌侵染黑田五寸下胚轴
1、取步骤一获得的黑田五寸下胚轴，切成0.5mm左右的小段，得到下胚轴节段。
2、取全部下胚轴节段(作为外植体)，放入盛有步骤二制备的农杆菌侵染液离心管中，轻柔震荡侵染20min。。
3、完成步骤2后，取侵染后的全部下胚轴节段，先在无菌滤纸上吸去多余农杆菌侵染液，再置于共培养培养基上，共培养3d。
共培养条件：25℃，暗培养。
四、初次诱导
取步骤三获得的全部下胚轴节段，先用无菌水冲洗三遍，吸干水分，再转移至诱导培养基上，25℃、光暗交替培养7-10d，得到愈伤组织。
统计愈伤诱导率。愈伤诱导率＝愈伤组织数/下胚轴节段总数×100％。
结果表明，愈伤诱导率达到75％。
五、筛选培养
1、取步骤四获得的愈伤组织，全部转移至初筛培养基上，25℃、光暗交替培养7-10d，得到蓬松的愈伤组织。
2、完成步骤1后，取蓬松的愈伤组织，全部转移至筛选培养基上，25℃、光暗交替培养7-10d，得到膨大的胚性愈伤组织。
六、分化培养
取步骤五获得的胚性愈伤组织，全部转移至分化培养基，25℃、光暗交替培养10-14d，得到出芽的胚性愈伤组织和未出芽的胚性愈伤组织。
将未出芽的胚性愈伤组织转移至分化培养基上，25℃、光暗交替培养10-14d，获得出芽的胚性愈伤组织。
七、生根培养
取步骤六获得的全部出芽的胚性愈伤组织，全部转移至1/2ms固体培养基上，25℃、光暗交替培养，得到再生植株。待再生植株的根生长至两周，移至温室，常规培养。
随机选择20株再生植株进行后续鉴定实验，依次命名为l1-l20。
八、再生植株的分子检测
1、分别提取步骤七获得的l1-l20叶片基因组dna并以其作为模板，以扩增gus基因的特异引物对(由5’-atgcccgtcacctgctta-3’和5’-acttgtggcgttccttcc…-3’组成)进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
用等体积超纯水代替再生植株叶片的基因组dna，作为空白对照。
用pcambia3301载体代替再生植株叶片的基因组dna，作为阳性对照。
用未转基因的黑田五寸叶片的基因组dna代替再生植株叶片的基因组dna，作为阴性对照。
反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸10min，4℃保持。
2、完成步骤1后，取10μlpcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
实验结果表明，如果以再生植株叶片的基因组dna为模板，能够扩增出约500bp的条带，则该再生植株即为再生阳性植株；空白对照和阴性对照均不能获得500bp的条带；阳性对照可以获得500bp的条带。
九、转化阳性率
按照步骤一至八的方法进行三次实验。每次实验中重复处理300个下胚轴节段。
统计三次实验的转化阳性率，然后取平均值。转化阳性率＝再生阳性植株数/侵染的下胚轴节段总数×100％。
结果表明，平均转化阳性率为91％。
按照上述方法，将共培养培养基、诱导培养基、初筛培养基、筛选培养基和分化培养基中的草甘膦均替换为卡那霉素，其它步骤均不变。实验结果如下：愈伤诱导率仅67％，获得再生植株的时间为75-85d，平均转化阳性率为85％。
上述结果表明，本发明建立的以草甘膦为筛选剂的胡萝卜遗传转化方法，不仅大大缩短了获得再生植株的时间，而且具有较高的转化阳性率。与传统的以卡那霉素为筛选剂的胡萝卜遗传转化方法相比，获得再生植株的时间缩短两周左右，转化阳性率提高了6％。由此可见，本发明建立的胡萝卜遗传转化方法是一种高效可行的遗传转化方法，可大大减少转基因鉴定的工作量，具有重大的应用价值。