表达系统的制作方法

本发明涉及适用于重组多肽的微生物表达的表达系统。
背景技术：
从美国专利us6537779知道了基于t7的以完全回文操纵基因序列为基础的蛋白质表达系统。基于t7的系统存在缺点，因为t7系统的操作需要噬菌体聚合酶，它通常是通过将表达所需噬菌体聚合酶的λde3原噬菌体插入到大肠杆菌宿主株中产生溶原宿主株而提供的。也可通过用特异性λ转导噬菌体进行侵染而将噬菌体聚合酶传递到细胞中，该特异性λ转导噬菌体携带了噬菌体聚合酶(例如t7rna聚合酶)的基因。λde3原噬菌体缺少了用于切除原噬菌体以形成裂解噬菌体颗粒所需的遗传元件。然而，已经证明λde3溶原宿主株释放了噬菌体颗粒从而引起了发酵装置中不合需要的侵染。实际上，某些发酵装置操纵基因是不允许使用λde3菌株的。不希望在诱导之前就表达异源蛋白质，因为一些异源蛋白质对宿主细胞生长和质粒稳定性具有有害影响，这就降低了总产量。为避免这一点，基于t7的表达系统通常在两种水平上控制异源蛋白质表达。首先，驱动从t7启动子的表达需要诱导t7rna聚合酶基因的表达以产生t7rna聚合酶。第二，t7启动子本身也需要被诱导。这就增加了操作基于t7的表达系统的复杂性。有着大量的具有不同控制和诱导模式的异源蛋白质表达系统，这使得对感兴趣的蛋白质进行表达系统/发酵过程的选择和优化很大程度上成为了完全根据经验的过程。这是费时间的以及不合需要的。因此，就需要这样的系统，它们能够提供改善的表达控制和改善的蛋白质表达水平，它们不使用噬菌体聚合酶和溶原宿主株。也需要这样的系统，它们能够提供原核细胞以及真核细胞诸如哺乳动物和酵母细胞中的可诱导异源表达。技术实现要素：根据本发明，提供了基于完全回文操纵基因序列的蛋白质表达系统，包括：a)启动子；以及b)完全回文操纵基因序列；特征在于启动子不是t7。本发明的表达系统中可采用的启动子通常是基于宿主rna聚合酶的启动子系统，优选基于大肠杆菌rna聚合酶的启动子系统。可采用的启动子的例子包括t7a1、t7a2、t7a3、λpl、λpr、lac、lacuv5、trp、tac、trc、phoa和rrnb。在根据本发明的表达系统中可采用的操纵基因序列包括lac、gal、deo和gln。可采用一种或多种完全回文操纵基因序列。在许多优选的实施方案中，采用了两种完全回文操纵基因序列，最有利的是一种操纵基因序列位于启动子的下游，并且一种操纵基因序列位于启动子的上游。当采用两种操纵基因系统时，操纵基因序列优选被间隔开，从而最大程度控制启动子。在许多实施方案中，间隔85到150个碱基对，优选间隔90到126个碱基对，最优选间隔91或92个碱基对。在某些实施方案中，操纵基因序列与转录起始点重叠。将考虑到的是，操纵基因系统通常会采用合适的阻抑物序列。阻抑物序列产生阻抑蛋白，例如当使用lac操纵基因时的laci基因序列。也可使用其它lac阻抑物序列，例如laciq序列可用来增加lac阻抑蛋白的水平。也可由宿主细胞基因组提供阻抑物序列或者通过使用另外的相容性质粒来提供。可将表达系统整合到宿主细胞基因组中，但是优选将其包含在染色体外元件诸如质粒之中。备选地，可将表达系统掺入到噬菌体或病毒载体中，使用这些载体将表达系统传递到宿主细胞系统中。可通过现有技术中的已知方法装配质粒或表达载体。典型地，质粒也包括如下之一或更多：选择标记，例如赋予抗生素抗性的序列，cer稳定性序列和表达盒。如果需要所期望的蛋白质分泌，表达系统也可掺入信号序列。表达的诱导可通过加入诱导物诸如异丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)，iptg类似物诸如异丁基-c-吡喃半乳糖苷(ibcg)，乳糖或者蜜二糖。可以使用其它诱导物，在其它地方更充分地描述了所述其它诱导物(例如参见《操纵基因》(theoperon)，miller和renznikoff编辑(1978))。诱导物可单独使用或者组合使用。合适质粒或表达载体的构建对于普通技术的科学家来说将是显而易见的。可采用本发明的表达系统在宿主细胞特别是微生物中表达蛋白。如本文使用的，“蛋白质”一般是指具有超过大约10个氨基酸的肽或蛋白质。宿主细胞可以是原核的或真核的。原核细胞的例子包括细菌细胞，例如革兰氏阴性细菌细胞，包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、铜绿假单胞菌以及革兰氏阳性细菌，包括枯草芽孢杆菌。真核细胞的例子包括酵母，诸如巴斯德毕赤酵母、啤酒糖酵母、多形汉逊酵母、乳克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母。可采用的哺乳动物宿主细胞包括人类细胞系，诸如人胚肾和perc.6细胞；鼠细胞系，诸如nso细胞；以及特别是仓鼠细胞系，诸如幼仓鼠肾细胞和特别是中国仓鼠卵巢细胞。也可以采用其它真核宿主细胞，诸如丝状真菌、植物、昆虫、两栖动物细胞或卵巢物质。优选的宿主细胞是细菌，特别是肠细菌科，优选大肠杆菌，特别是其b或k12株。本发明的表达载体通常采用质粒形式，包括启动子和完全回文操纵基因序列的质粒形成了本发明的另一方面，其中启动子不是t7。质粒可以是自主复制质粒或者整合型质粒。对于通过培养重组细胞生产蛋白质特别是重组蛋白质来说，采用本发明的表达系统是有利的。对于蛋白质的表达来说，将考虑到的是将启动子和操纵基因序列可操作地连接到编码待表达蛋白质的dna上。因此，本发明也提供了生产蛋白质的方法，其包括使表达系统表达，该表达系统包括：a)启动子；b)完全回文操纵基因序列；以及c)蛋白质的表达盒；其特征在于启动子不是t7。如果需要的话，也可以存在一种或多种启动子、操纵基因序列和表达盒，它们可以是相同的或不同的。通过现有技术中公知的用于所采用细胞的方法来使表达系统表达。优选的表达方法包括在生长培养基中培养重组细胞，特别是通过发酵，然后回收所表达的蛋白质。术语“生长培养基”是指用于生长重组细胞的营养培养基。在许多实施方案中，采用营养液。用于特定重组细胞的合适的生长培养基是现有技术中公知的。附图说明图1显示蛋白d1.3的基因序列。图2显示实施例7的htnfα蛋白积累结果。(*)＝基础表达，未入诱导物(iptg)；(**)＝％tcp，％细胞总蛋白质。图3显示实施例9的菌株cld038的蛋白质印迹分析。箭头指示htnfα带。泳道6：cld038：2小时温育(诱导前)泳道5：cld038：4小时温育(诱导前)泳道4：cld038：iptg诱导后1小时泳道3：cld038：iptg诱导后2小时泳道2：cld038：iptg诱导后3小时泳道1：cld038：iptg诱导后4小时泳道7：分子量标准参照物图4显示实施例11的菌株cld030的htnfα生产率分布图。图5显示实施例15使用的d1.3-a5b7双特异性单链四价双抗体(bsctdb)基因序列(seqidno22)。图6显示实施例16使用的谷胱甘肽-s-转移酶-3c蛋白酶融合基因序列(seqidno23)。图7显示实施例16使用的人干扰素α2(ifnα2)基因序列(seqidno24)。图8显示实施例16使用的人促红细胞生成素(epo)基因序列(seqidno25)。图9显示实施例17使用的l-2-卤代链烷酸脱卤素酶(hadl)基因序列(seqidno26)。图10显示实施例17的l-2-卤代链烷酸脱卤素酶蛋白质的表达和累积。箭头指示hadl蛋白质的位置。泳道1：分子量标准参照物泳道2：瓶1-cld075诱导前泳道3：瓶2-clc075诱导前泳道4：瓶1-cld075，6小时培养物，0.5mmiptg诱导后3小时泳道5：瓶2-cld075，6小时培养物，未诱导泳道6：瓶1-cld075，23小时培养物，0.5mmiptg诱导后20小时泳道7：瓶2-cld075，23小时培养物，未诱导泳道8：分子量标志物图11显示实施例18的诱导后，l-2-卤代链烷酸脱卤素酶蛋白质的表达/累积。图12显示实施例21使用的hcmv启动子和双重的完全回文lac操纵基因的dna序列(seqidno33)。图13显示实施例21使用的iggfc序列(seqidno34)。图14显示实施例21的iggfc蛋白累积水平。对于诱导的和未诱导的两者都是n＝4。提供的数据为带有代表1个标准差的误差棒的平均值。图15显示实施例20使用的克隆序列1的序列(seqidno35)。图16显示实施例20使用的克隆序列2的序列(seqidno36)。图17显示实施例9的htnfα的累积水平。泳道1：cld077诱导后20小时泳道2：cld077诱导后3小时泳道3：cld077诱导前泳道4：分子量标志物图18显示载体pave013的质粒图。具体实施方式通过下面的实施例但并不限制地说明本发明。1.pave系列载体的产生载体pave011、pave012和pave013产生pave011的起始载体是pzt7#2.0，根据us6537779的描述进行制备。pzt7#2.0具有pat153载体骨架、cer稳定性序列、teta/r、感兴趣基因上游的单一天然lac操纵基因序列以及上游t4转录终止子。使用合成的寡核苷酸接头通过ncol、ecori和xba1限制酶位点将t7a3启动子和双完全回文lac操纵基因克隆到该质粒中。通过退火寡核苷酸1和2.1，制备接头12.1：寡核苷酸1(seqidno1)5＇catgtgggaattgtgagcgctcacaattccaagaacaatcctgcacg寡核苷酸2.1(seqidno2)5′aattcgtgcaggattgttcttggaattgtgagcgctcacaattccca然后将接头作为ncol/ecori片段连接到质粒pzt7#2.0中，转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。通过使用ncoi限制酶切消化初步筛选转化体。通过测序确认序列。将所得质粒命名为pave012。然后通过退火寡核苷酸3和4，将t7a3启动子盒克隆到pave012中：寡核苷酸3(seqidno3)5′aattcaaacaaaacggttgacaacatgaagtaaacacggtacgatgtaccggaattgtgagcgctcacaattcccca寡核苷酸4(seqidno4)5′ctggtggggggttgtgggcgctcgcggttccggtgcgtcgtgccgtgtttgcttcgtgttgtcggccgttttgtttg将退火的寡核苷酸作为xbal/ecori片段连接到质粒pave012中，转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。通过质粒dna的限制酶切消化进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为pave011。将人tnfα基因作为ndei/xhoi片段克隆到该质粒中以产生pave013。pave013的质粒图谱示于图18中。这显示了操纵基因和启动子以及构建中使用的限制酶位点的排列。两个操纵基因都是完全回文lac操纵基因。rbs是核糖体识别位点。载体包括pat153载体骨架、cer稳定性序列、诱导型四环素抗性基因(teta/r)以及上游t4转录终止子。载体pave038和pave041产生pave038的起始载体是pzt7#2.0，根据us6537779的描述进行制备。使用合成的寡核苷酸接头通过ecori和xbal限制酶位点将tac启动子和单一天然lac操纵基因克隆到该质粒中。通过退火寡核苷酸11和12，制备接头1112：寡核苷酸11(seqidno5)5′aattttctgaaatgagctgttgacaattaatcatcggctcggatactgtgtggaattgtgagcggataacaattcccca寡核苷酸12(seqidno6)5′ctagtggggaattgttatccgctcacaattccacacagtatccgagccgatgattaattgtcaacagctcatttcagaa然后将接头作为xbal/ecori片段连接到质粒pzt7#2.0中，转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。通过使用ncoi限制酶切消化初步筛选转化体。通过测序确认序列。将所得质粒命名为pave038。将人tnfα基因作为ndei/xhoi片段克隆到该质粒中以产生质粒pave041。载体pave037和pave040产生pave037的起始载体是pzt7#2.0，根据us6537779的描述进行制备。使用合成的寡核苷酸接头通过ecori和xbal限制酶位点将tac启动子和单一完全回文lac操纵基因克隆到该质粒中。通过退火寡核苷酸13和14，制备接头1314：寡核苷酸13(seqidno7)5′aattttctgaaatgagctgttgacaattaatcatcggctcggatactgtgtggaattgtgagcgctcacaattcccca寡核苷酸14(seqidno8)5′ctagtggggaattgtgagcgctcacaattccacacagtatccgagccgatgattaattgtcaacagctcatttcagaa然后将接头作为xbal/ecori片段连接到质粒pzt7#2.0中，转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。通过使用ncoi限制酶切消化初步筛选转化体。通过测序确认序列。将所得质粒命名为pave037。将人tnfα基因作为ndei/xhoi片段克隆到该质粒中以产生pave040。载体pave028和pave030产生pave028的起始载体是pave012。通过退火寡核苷酸5和6，将t7a3启动子盒克隆到pave012中：寡核苷酸5(seqidno9)5′aattcgaaacaaaacggttgacaacatgaagtaaacacggtacgatgtaccggaattgtgagcgctcacaattcccca寡核苷酸6(seqidno10)5′ctggtggggggttgtgggcgctcgcggttccggtgcgtcgtgccgtgtttgcttcgtgttgtcggccgttttgtttcg将退火的寡核苷酸作为xbal/ecori片段连接到质粒pave012中，转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。通过限制酶切消化质粒dna进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为pave028。将人tnfα基因作为ndei/xhoi片段克隆到该质粒中以产生pave030。载体pave007和pave031产生pave007的起始载体是pzt7#2.0，根据us6537779的描述进行制备。使用合成的寡核苷酸接头通过ecori和xbal限制酶位点将t7a3启动子和单一完全回文lac操纵基因克隆到该质粒中。含有t7a3启动子的接头由寡核苷酸3和4组成。寡核苷酸3(seqidno3)5′aattcaaacaaaacggttgacaacatgaagtaaacacggtacgatgtaccggaattgtgagcgctcacaattcccca寡核苷酸4(seqidno4)5′ctggtggggggttgtgggcgctcgcggttccggtgcgtcgtgccgtgtttgcttcgtgttgtcggccgttttgtttg退火寡核苷酸3和4，然后将形成的接头作为xbal/ecori片段连接到质粒pzt7#2.0中，转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。通过限制酶切消化质粒dna进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为pave007。将人tnfα基因作为ndei/xhoi片段克隆到该质粒中以产生pave031。载体pave029和pave027产生pave029的起始载体是pzt7#2.0，根据us6537779的充分描述进行制备。使用合成的寡核苷酸接头通过ecori和xbai限制酶位点将λpl启动子和单一完全回文lac操纵基因克隆到该质粒中。通过退火寡核苷酸7和8，制备接头78：寡核苷酸7(seqidno11)5′aattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcggaattgtgagcgctcacaattcccca寡核苷酸8(seqidno12)5′ctagtggggaattgtgagcgctcacaattccgctcagtatcaccgccagtggtatttatgtcaacaccgccagagat然后将接头作为xbal/ecori片段连接到质粒pzt7#2.0中，转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。通过使用ncoi限制酶切消化初步筛选转化体。通过测序确认序列。将所得质粒命名为pave029。将人tnfα基因作为ndei/xhoi片段克隆到该质粒中以产生pave027。载体pave043和pave044产生pave043的起始载体是pave012。通过退火寡核苷酸17和18，将tac启动子盒克隆到pave012中：寡核苷酸17(seqidno37)5′aattttctgaaatgagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcgctcacaattcccca寡核苷酸18(seqidno38)5′ctagtggggaattgtgagcgctcacaattccacacattatacgagccgatgattaattgtcaacagctcatttcagaa将退火的寡核苷酸作为xbal/ecori片段连接到质粒pave012中，转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。通过限制酶切消化质粒dna进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为pave043。将人tnfα基因作为ndei/xhoi片段克隆到该质粒中以产生pave044。载体pave034和pave035产生pave034的起始载体是pave012。通过退火寡核苷酸9和10，将λpl启动子盒克隆到pave012中：寡核苷酸9(seqidno39)5′aattcatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcggaattgtgagcgctcacaattcccca寡核苷酸10(seqidno40)5′ctagtggggaattgtgagcgctcacaattccgctcagtatcaccgccagtggtatttatgtcaacaccgccagagatg将退火的寡核苷酸作为xbal/ecori片段连接到质粒pave012中，转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。通过限制酶切消化质粒dna进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为pave034。将人tnfα基因作为ndei/xhoi片段克隆到该质粒中以产生pave035。载体ve020和ave021产生pave020的起始载体是pave012。通过退火寡核苷酸7和8，将λpl启动子盒克隆到pave012中：寡核苷酸7(seqidno11)5′aattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcggaattgtgagcgctcacaattcccca寡核苷酸8(seqidno12)5′ctagtggggaattgtgagcgctcacaattccgctcagtatcaccgccagtggtatttatgtcaacaccgccagagat将退火的寡核苷酸作为xbal/ecori片段连接到质粒pave012中，转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。通过限制酶切消化质粒dna进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为pave020。将人tnfα基因作为ndei/xhoi片段克隆到该质粒中以产生pave021。载体pave016和pave017产生pave016的起始载体是pave012。通过退火寡核苷酸15和16，将tac启动子盒克隆到pave012中：寡核苷酸15(seqidno13)5′aattcctgaaatgagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcgctcacaattcccca寡核苷酸16(seqidno14)5′ctagtggggaattgtgagcgctcacaattccacacattatacgagccgatgattaattgtcaacagctcatttcagg将退火的寡核苷酸作为xbal/ecori片段连接到质粒pave012中，转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。通过限制酶切消化质粒dna进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为pave016。将人tnfα基因作为ndei/xhoi片段克隆到该质粒中以产生pave017。载体pave049产生pave049的起始载体是pave017。不改变tac启动子盒。为增加两个操纵基因之间91到124个碱基对的间隔，克隆进了ecori接头。这是由寡核苷酸19和20组成的。寡核苷酸19(seqidno15)5′aattcaccggtgtacagtcatgtacaaccggtg寡核苷酸20(seqidno16)5′aattcaccggttgtacatgactgtacaccggtg通过限制酶切消化质粒dna进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为pave049。载体pave046产生分泌载体pave046的起始载体是pave027。将ad1.3fab表达盒(图1，seqidno17)作为ndei-bamhi片段进行克隆。通过限制酶切消化质粒dna进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为pave046。表1：pave载体汇总2.重组菌株的产生通过用下面表2中描述的质粒电穿孔，转化大肠杆菌w3110(获自美国典型培养物保藏中心菌株atcc27325)和bl21(获自emd生物科学公司(emdbiosciencesinc)，圣地亚哥，美国)。纯化所得重组菌株，保持在-80℃的甘油原液中。表2：所构建的重组菌株比较例1用于产生带有t7a3启动子而不带任何操纵基因的质粒的起始载体是pzt7#2.0。使用合成的寡核苷酸接头通过ecori和xbai限制酶位点将t7a3启动子克隆到该质粒中。通过退火寡核苷酸21和22，制备接头2122：寡核苷酸21(seqidno18)5′aattcgaaacaaaacggttgacaacatgaagtaaacacggtacgatgtaccacatgaaacgacagtgagtca寡核苷酸22(seqidno19)5′ctagtgactcactgtcgtttcatgtggtacctcgtaccgtgtttacttcatgttgtcaaccgttttgtttcg然后将接头作为xbal/ecori片段连接到质粒pzt7#2.0中，转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。通过限制酶切消化质粒dna进行初步筛选。然后通过测序确认序列。通过限制酶切消化和测序筛选到了82个克隆。用正确的t7a3启动子序列没有鉴定到克隆(所有序列中都含有突变)。这表明含有这种强力组成型启动子的质粒的构建是存在问题的。比较例2用于产生带有受单一天然lac操纵基因序列控制的t7a3启动子的质粒的起始载体是pzt7#2.0。使用合成的寡核苷酸接头通过ecori和xbai限制酶位点将t7a3启动子和天然lac操纵基因(laco)序列克隆到该质粒中。通过退火寡核苷酸23和24，制备接头2324：寡核苷酸23(seqidno20)5′aattcgaaacaaaacggttgacaacatgaagtaaacacggtacgatgtaccggaattgtgagcggataacaattcccca寡核苷酸24(seqidno21)5′ctagtggggaattgttatccgctcacaattccggtacatcgtaccgtgtttacttcatgttgtcaaccgttttgtttcg然后将接头作为xbal/ecori片段连接到质粒pzt7#2.0中，转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。通过限制酶切消化质粒dna进行初步筛选。然后通过测序确认序列。通过限制酶切消化和测序筛选到了94个克隆。用正确的序列再一次没有鉴定到克隆。然而，发现了一个克隆具有接近完整的序列。这个克隆在序列的大约位置-37处含有额外的“g”。很难指定突变的确切位置，因为期望的序列在这个区域含有-gg-。将人tnfα基因作为ndei/xhoi片段克隆到带有接近完整序列的质粒中。从克隆宿主株株xl-bluemr(stratagene)中筛选到了20个克隆。有一个是没有突变(除了上述额外的“g”)的阳性克隆。将该质粒转化到生产宿主(atcc27325)，再次测序质粒。这表明质粒在t7a3启动子和人tnfα序列两者中都含有严重突变，表明t7a3启动子的使用即使在天然lac操纵基因序列的控制之下也导致质粒不稳定。实施例3从-80℃冷冻机中取出cld032小瓶，让它解冻。将10μl的解冻甘油原液接种到补充四环素(10μg/ml)和葡萄糖(1g/l)的5mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)中。在37℃的定轨摇床中温育16小时。然后使用500μl的该培养物接种含有50ml的lb培养液(组成如上所述)的两个250ml锥形瓶。将锥形瓶在定轨摇床中37℃、200rpm进行温育。监测生长直到od600＝0.5-0.7。这时用0.05mm终浓度的iptg(异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导一个锥形瓶，而第二个锥形瓶不诱导，留着监测基础表达。在上述条件下继续温育，在此期间取样进行生长的测定、细菌细胞中htnfα累积的测定。使用光密度扫描取样细菌的全细胞溶胞产物的胶体蓝染色的sds-page胶来确定htnfα的累积水平。结果汇总在下面的表3中。表3(*)：tcp＝细胞总蛋白质一并考虑比较例1和2以及实施例3提供的数据，证明使用单一完全回文操纵基因序列令人惊讶地实现了强力t7a3启动子的有效控制。这是完全预料不到的，因为已知的是单一天然操纵基因的使用(比较例2)不会提供足够的基础控制来允许建立稳定的重组生产菌株。用单一完全回文控制系统在使用相当低浓度的诱导物进行诱导时就获得了高的产物累积水平。尽管观察到了基础表达(没有诱导物时)，但是显然仅仅是在显著延长温育(24小时)之后的。实施例4从-80℃冷冻机中取出cld018小瓶，让它们解冻。将10μl的解冻甘油原液接种到补充四环素(10μg/ml)和葡萄糖(1g/l)的5mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)中。在37℃的定轨摇床中温育种子培养物16小时。然后使用500μl的种子培养物接种含有50ml的lb培养液(组成如上所述)的250ml锥形瓶。将锥形瓶在定轨摇床中37℃、200rpm进行温育。监测生长直到od600＝0.5-0.7。这时用0.05mm和1mm终浓度的iptg(异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导锥形瓶。也留下锥形瓶不诱导，在上述条件下继续锥形瓶的温育，在此期间取样进行生长的测定、细菌细胞中htnfα累积的测定。使用光密度扫描取样细菌的全细胞溶胞产物的胶体蓝染色的sds-page胶来确定htnfα的累积水平。结果汇总在下面的表4中。表4该数据证明，强力t7a3启动子的进一步控制能够使用间隔91bp的两个完全回文操纵基因序列来实现。与使用单一完全回文操纵基因控制阻抑所获得的相比，基础表达(没有诱导物时)已经显著降低了。与us6537779的t7系统相比，使用双重完全回文序列所获得的基础表达的控制是预料不到的，所述t7系统的基础表达控制需要两种不同的控制元件。在本实施例中，基础表达的控制是在大肠杆菌rna聚合酶的高背景中实现的。实施例5从-80℃冷冻机中取出cld026小瓶，让它们解冻。将10μl的解冻甘油原液接种到补充四环素(10μg/ml)和葡萄糖(1g/l)的5mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)中。在37℃的定轨摇床中温育16小时。然后使用500μl的该培养物接种含有50ml的lb培养液(组成如上所述)的250ml锥形瓶。将锥形瓶在定轨摇床中37℃、200rpm进行温育。监测生长直到od600＝0.5-0.7。这时用0.05mm和0.005mm终浓度的iptg(异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导锥形瓶。也留下锥形瓶不诱导，在上述条件下继续温育，在此期间取样进行生长的测定、细菌细胞中htnfα累积的测定。使用光密度扫描取样细菌的全细胞溶胞产物的胶体蓝染色的sds-page胶来确定htnfα的累积水平。结果汇总在下面的表5中。表5结果证明，两个完全回文操纵基因序列之间1bp间隔的变化(从91到92bp)没有不利影响所获得的基础表达和最终累积水平的表现。出乎意料的是，降低iptg浓度10倍(从0.05mm到0.005mm)没有显著降低诱导的生产率。实施例6从-80℃冷冻机中取出cld042和cld043小瓶，让它们解冻。将10μl的每瓶解冻甘油原液分别接种到补充四环素(10μg/ml)和葡萄糖(1g/l)的每份2×5mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)中。在37℃的定轨摇床中温育16小时。然后使用500μl的这些培养物分别接种含有50ml的lb培养液(组成如上所述)的250ml锥形瓶。将锥形瓶在定轨摇床中37℃、200rpm进行温育。监测生长直到od600＝0.5-0.7。这时用0.5mm终浓度的iptg(异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导锥形瓶。也留下含有每种菌株培养物的锥形瓶不诱导，在上述条件下继续温育，在此期间取样进行生长的测定、细菌细胞中htnfα累积的测定。使用光密度扫描取样细菌的全细胞溶胞产物的胶体蓝染色的sds-page胶来确定htnfα的累积水平。在取样细菌的sds-page之后，通过蛋白质印迹(使用抗htnfα抗体)比较温育20小时后的cld042和cld043的未诱导培养物中htnfα的基础累积水平。结果汇总在下面的表6中。表6(*)＝蛋白质印迹上的htnfα带的扫描。将cld042的强度扫描数据对cld043的强度扫描数据进行标准化。结果证明，单一的完全回文操纵基因序列能够用来降低基础表达(没有诱导物时)四倍，而没有不利影响tac启动子系统的诱导的生产率。实施例7从-80℃冷冻机中取出cld019小瓶，让它解冻。将10μl的解冻甘油原液接种到补充四环素(10μg/ml)和葡萄糖(1g/l)的5mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)中。在37℃的定轨摇床中温育16小时。然后使用500μl的该培养物接种含有50ml的lb培养液(组成如上所述)的250ml锥形瓶。将锥形瓶在定轨摇床中37℃、200rpm进行温育。监测生长直到od600＝0.5-0.7。这时用0.5mm、0.1mm、0.05mm和0.005mm终浓度的iptg(异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导锥形瓶。也留下锥形瓶不诱导，在上述条件下继续温育，在此期间取样进行生长的测定、细菌细胞中htnfα累积的测定。使用光密度扫描取样细菌的全细胞溶胞产物的胶体蓝染色的sds-page胶来确定htnfα的累积水平。结果示于图2中。图2显示的数据证明，tac启动子与双重完全回文操纵基因序列的组合产生了这样一种系统，其中的表达速率可被用来诱导的iptg的浓度直接调节。可采用这样的系统来调节异源蛋白质的表达，例如最大化可溶形式蛋白质的累积或者避免异源蛋白质分泌所可能具有的对重组细胞生长和生产率的有害影响这一问题。实施例8从-80℃冷冻机中取出小瓶cld030，让它解冻。将10μl的解冻甘油原液接种到补充四环素(10μg/ml)和葡萄糖(1g/l)的5mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)中。在37℃的定轨摇床中温育16小时。然后使用500μl的该培养物接种含有50ml的lb培养液(组成如上所述)的250ml锥形瓶。将锥形瓶在定轨摇床中37℃、200rpm进行温育。监测生长直到od600＝0.5-0.7。这时用0.005mm终浓度的iptg(异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导锥形瓶，同时留下另一个锥形瓶不诱导，在上述条件下继续温育，在此期间取样进行生长的测定、细菌细胞中htnfα累积的测定。使用光密度扫描取样细菌的全细胞溶胞产物的胶体蓝染色的sds-page胶来确定htnfα的累积水平。结果汇总在下面的表7中。表7时间(小时)htnfα的累积水平(％tcp)426589241224(基础的，无iptg)未检出表7所示数据清楚地显示，使用单一的完全回文操纵基因序列可令人惊讶地获得非常强力的λpl启动子。使用单一的完全回文控制系统可获得高的产物累积水平。实施例9从-80℃冷冻机中取出cld021和cld038小瓶，让它们解冻。将10μl的每瓶解冻甘油原液分别接种到补充四环素(10μg/ml)和葡萄糖(1g/l)的5mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)中。在37℃的定轨摇床中温育16小时。然后使用500μl的该培养物接种含有50ml的lb培养液(组成如上所述)的250ml锥形瓶。将锥形瓶在定轨摇床中37℃、200rpm进行温育。监测生长直到od600＝0.5-0.7。这时用1mm终浓度的iptg(异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导锥形瓶，同时留下第二个锥形瓶不诱导，在上述条件下继续温育，在此期间取样进行生长的测定、细菌细胞中htnfα累积的测定。在取样细菌的全细胞溶胞产物的sds-page之后，使用胶体蓝染色的sds-page胶和蛋白质印迹分析(使用抗htnfα抗体)确定htnfα的累积。数据汇总在表8中。菌株cld038的蛋白质印迹分析示于图3中。表8这些结果证明，间隔91bp或92bp的带有λpl启动子的双重完全回文操纵基因序列的组合产生了非常严重的阻抑。蛋白质印迹表明，未检测到靶蛋白的基础表达。在诱导时获得了低水平的表达水平。这些结果是完全预料不到的，因为已知的是λpl启动子是极其强力的启动子。这样的系统可用于例如引导对宿主细胞有高毒性的蛋白质的表达。当受控表达是有利的时候，它也可用于膜蛋白的表达和插入。实施例10从-80℃冷冻机中取出cld028和cld035小瓶，让它们解冻。将10μl的每瓶解冻甘油原液分别接种到补充四环素(10μg/ml)和葡萄糖(1g/l)的每份2×5mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)中。在37℃的定轨摇床中温育16小时。然后使用500μl的这些培养物分别接种含有50ml的lb培养液(组成如上所述)的250ml锥形瓶。将锥形瓶在定轨摇床中37℃、200rpm进行温育。监测生长直到od600＝0.5-0.7。这时用1mm终浓度的iptg(异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导锥形瓶，在上述条件下继续温育，在此期间取样进行生长的测定、细菌细胞中htnfα累积的测定。使用光密度扫描取样细菌的全细胞溶胞产物的胶体蓝染色的sds-page胶来确定htnfα的累积水平。结果汇总在下面的表9中。表9这些数据结合前面实施例4和5所示数据一起来看，表明能够使用大肠杆菌k-12和b菌株两者。实施例11通过将下面描述的每种菌株的200μl甘油原液加入到含有补充了15μg/ml四环素的200mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)的2.0l带挡板的摇瓶中而产生发酵接种物。在带有250rpm搅拌的摇床-培养箱中于37℃生长接种物12小时。使用200ml摇瓶接种物来接种含有10l分批生长培养基的15l工作体积的发酵罐。在下面描述的工作条件下进行发酵。将温度控制在37℃，通过35％(w/v)氢氧化铵的自动添加将ph控制在6.8。溶解氧张力(dot)设定点是30％空气饱和度，通过发酵罐搅拌器速度(从最小的250rpm直到最大的1500rpm)的自动调节来控制，氧气自动补充到入口气流中。到发酵罐容器的气流始终是10l/min。发酵罐中的压力保持在50和200毫巴之间。以分批模式进行发酵，直到碳源(即甘油)耗尽，它发生在接种后大约10小时，特征在于dot的急剧升高。在碳源耗尽时通过以每小时每升培养基11g甘油的进料速度加入甘油/氯化镁进料来起始补料分批发酵。一旦发酵中的生物量水平达到od600＝50-60，就通过加入iptg到0.5mm终浓度而进行诱导。在诱导后继续补料分批阶段12小时。在收获时取样确定生物量水平(od600)和htnfα累积(％tcp)/htnfα滴度(g/l)(胶体蓝染色的sds-page胶)。分批生长培养基的组成提供在表10中。表10成分终浓度[g/l]、[mg/l]和[ml/l]净化水(nh4)2so414.0甘油35.0酵母提取物(bectondickinson)20.0kh2po42.0k2hpo416.5柠檬酸7.5mgso4.7h2o2.47h3po41.5ml/lcacl2.2h2o0.294消泡剂af2040.2ml/l四环素15mg/lfeso4.7h2o114mg/lznso4.7h2029mg/lmnso4.h2o17mg/lna2moo4.2h2o9mg/lcuso4.5h2o4mg/lh3.bo312mg/l甘油/氯化镁进料的组成提供在表11中。表11结果汇总在表12中。菌株cld030的htnfα生产率分布图示于图4中。表12数据清楚地证明了系统用于制备异源蛋白质的有用性。使用简单的普通优化的发酵和诱导工艺获得了高的产物滴度。如图4中例举的生产率分布图所证实的，可利用质粒pave027的控制特征来最大化异源蛋白质的生产，特别是需要控制表达以最大化分泌的蛋白质。实施例12从-80℃冷冻机中取出cld050小瓶，让它解冻。将10μl的解冻甘油原液接种到补充四环素(10μg/ml)和葡萄糖(1g/l)的5mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)中。在37℃的定轨摇床中温育16小时。然后使用500μl的该培养物接种含有50ml的lb培养液(组成如上所述)的250ml锥形瓶。将锥形瓶在定轨摇床中37℃、200rpm进行温育。监测生长直到od600＝0.5-0.7。这时用0.05mm终浓度的iptg(异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导锥形瓶，同时留下另一锥形瓶不诱导，在上述条件下继续温育，在此期间取样进行生长的测定、细菌细胞中htnfα累积的测定。使用光密度扫描取样细菌的全细胞溶胞产物的胶体蓝染色的sds-page胶来确定htnfα的累积水平。结果汇总在下面的表13中。表13诱导后时间(小时)htnfα(％tcp)的累积水平41624(基础的，无iptg)未检出令人惊讶的是，当间隔增加时，双重完全回文操纵基因序列是起作用的。例如可以改变双重完全回文的间隔以实现对其它启动子的有效控制。实施例13从-80℃冷冻机中取出cld048小瓶，让它解冻。将10μl的解冻甘油原液接种到补充四环素(10μg/ml)和葡萄糖(1g/l)的5mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)中。在37℃的定轨摇床中温育16小时。然后使用500μl的该培养物接种含有50ml的lb培养液(组成如上所述)的250ml锥形瓶。将锥形瓶在定轨摇床中37℃、200rpm进行温育。监测生长直到od600＝0.5-0.7。这时用0.1mm终浓度的iptg(异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导锥形瓶，在上述条件下再继续温育2小时。然后收获细胞和剩余的没有细胞的生长培养基。进一步进行所收获细胞的渗透压休克细胞分级分离以分离含有蛋白质的细胞组分，它们是分布在可溶性大肠杆菌周质组分中的。参考用纯化的活性d1.3fab所制备的标准曲线，通过确定elisa分析中d1.3fab与溶菌酶(抗原)的结合来评估可溶性周质提取物和残余生长培养基中生物活性d1.3fab的累积。大肠杆菌周质和残余生长培养基(因为物质从周质泄漏到了生长培养基中)中生物活性d1.3fab的累积示于表14中。将周质和残余生长培养基中的d1.3fab的累积标准化为“每单位生物量每升培养物的μg活性物质(od600)”。表14该系统所提供的控制使得能够高水平分泌异源蛋白质，特别是需要复杂的二硫键形成的那些蛋白质的，有用性被大肠杆菌周质中高水平生物活性d1.3fab的分泌和累积清楚地例证。此外，如何才能使用补料分批发酵(例如前面实施例11或下面的实施例14中所描述的)来高产率地制备这样的蛋白质，这对于本领域技术人员来说将是明确的。实施例14使用cld048重复实施例11所描述的发酵过程。一旦发酵物中的生物量水平达到od600＝大约50，就通过加入iptg到0.15mm终浓度进行诱导。在诱导后继续补料分批阶段35-45小时。然后收获细胞和剩余的不含细胞的生长培养基。进一步进行所收获细胞的渗透压休克细胞分级分离以分离含有蛋白质的细胞组分，它们是分布在可溶性大肠杆菌周质组分中的。参考用纯化的活性d1.3fab所制备的标准曲线，通过确定elisa分析中d1.3fab与溶菌酶(抗原)的结合来评估可溶性周质提取物和残余生长培养基中生物活性d1.3fab的累积。将周质和残余生长培养基中的d1.3fab的累积标准化为“每升培养物的mg活性物质”。大肠杆菌周质和残余生长培养基(因为物质从周质泄漏到了生长培养基中)中生物活性d1.3fab的累积示于表15中。表15使用表达系统证明生物活性d1.3fab的高水平分泌。实施例15设计了合成的双特异性单链四价双抗体(diabody)(bsctdb)，其中将来自d1.3(抗溶菌酶)和a5b7(抗-cea(癌胚抗原))的轻链可变区和重链可变区连接在单一的多肽链上。该分子的dna序列示于图5中(seqidno22)。将它作为ndei/noti片段克隆到已经用ndei和noti消化过的pave046中。通过限制酶切消化筛选重组质粒，通过测序确认。将所得质粒命名为pave078。将pave078转化到大肠杆菌w3110中以制备cld073，将它纯化并保藏在-80℃的甘油原液中。从-80℃冷冻机中取出cld073小瓶，让它解冻。将10μl的解冻甘油原液接种到补充四环素(10μg/ml)和葡萄糖(1g/l)的5mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)中。在37℃的定轨摇床中温育16小时。然后使用500μl的该培养物接种含有50ml的lb培养液(组成如上所述)的两个250ml锥形瓶。将锥形瓶在定轨摇床中37℃、200rpm进行温育。监测生长直到od600＝0.5-0.7。这时用0.5mm或0.1mm终浓度的iptg(异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导锥形瓶，在上述条件下再继续温育20小时。然后收获细胞和剩余的没有细胞的生长培养基。进一步进行所收获细胞的渗透压休克细胞分级分离以分离含有蛋白质的细胞组分，它们是分布在可溶性大肠杆菌周质组分中的。通过确定竞争性elisa分析中抗-cea单克隆抗体与cea(抗原)的结合抑制以及通过竞争性elisa分析中抗溶菌酶fab抗体片段与溶菌酶(抗原)的结合来评估周质提取物和残余生长培养基中生物活性d1.3-a5b7bsctdb的表达、分泌、折叠和累积。获得的数据表明，在诱导结束时大多数的d1.3-a5b7bsctdb分布在残余生长培养基中(从周质泄漏)。该数据(竞争性elisa中bsctdb的结合)示于表16中。获得的数据证明，来自0.5mmiptg诱导的培养物的残余生长培养基样品就完全抑制了竞争性elisa分析中抗-cea和抗溶菌酶抗体两者的结合。来自0.1mmiptg诱导的培养物的残余生长培养基样品显示了降低的抑制水平，这表明该样品中生物活性d1.3-a5b7bsctdb的累积水平更低。表16使用新表达系统就可以生产使用大肠杆菌很难生产的复杂的多链异源蛋白质。通过证明使用新表达系统在大肠杆菌中能够生产生物活性形式的双特异性单链四价双抗体，已经例证了这一点。这进一步例证了表达系统的有用性。实施例16将谷胱甘肽-s-转移酶-3c蛋白酶融合物(gst-3c)作为ndei/xhoi片段克隆到用ndei和xhoi消化过的pave011中。插入片段的序列示于图6中(seqidno23)。通过限制酶切消化筛选重组质粒，通过测序确认。将所得质粒命名为pave052。将pave052转化到大肠杆菌bl21中以制备cld054，将它纯化并保存在-80℃的甘油原液中。将人干扰素α2(ifnα2)基因作为ndei/xhoi片段克隆到用ndei和xhoi消化过的pave011中。插入片段的dna序列示于图7中(seqidno24)。通过限制酶切消化筛选重组质粒，通过测序确认。将所得质粒命名为pave058。将pave058转化到大肠杆菌w3110中以制备cld059，将它纯化并保存在-80℃的甘油原液中。将已经进行适于大肠杆菌表达的密码子优化的人促红细胞生成素(epo)基因作为ndei/xhoi片段克隆到用ndei和xhoi消化过的pave011中。插入序列的dna序列示于图8中(seqidno25)。通过限制酶切消化筛选重组质粒，通过测序确认。将所得质粒命名为pave061。将pave061转化到大肠杆菌w3110中以制备cld060，将它纯化并保存在-80℃的甘油原液中。使用实施例11中描述的培养基和工艺条件进行使用cld054、cld059和cld060的补料分批发酵。如表19中所述将发酵保持在30℃或37℃。以分批模式进行发酵，直到碳源(即甘油)耗尽。这时通过加入含有甘油(714g/l)和硫酸镁(30g/l)的进料来起始补料分批发酵。一旦发酵中的生物量水平达到od600＝50-60，就通过加入iptg进行诱导。使用的iptg浓度如表17中所述。在诱导后继续补料分批阶段12-15小时。在发酵期间取样确定生物量水平(od600)和蛋白质产物((gst-3c、ifnα2和epo)滴度(g/l)，使用取样细菌的全细胞溶胞产物的胶体蓝染色的sds-page胶)。表17表17中提供的数据进一步证明了系统用于广范围的异源蛋白质生产的有用性。使用简单的普通发酵工艺加上仅仅控制用于诱导的iptg浓度就获得了高的产物滴度。降低工艺过程开发的时间界限对于治疗上有用的异源蛋白质来说是特别有利的。实施例17使用已经用pcr改造过的ndei和spei位点克隆了来自恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)的l-2-卤代链烷酸脱卤素酶(hadl)基因。基因序列示于图9中(seqidno26)。用ndei和spei消化质粒pave011，对带进行凝胶提取。用ndei和spei消化hadl，对hadl基因进行凝胶提取，连接到pave011中产生pave075。使用pcr从质粒pcn60(atcc77101；nietoc，etal.(1990)基因(gene)87：145-149)中拷贝了萨氏假单胞菌(pseudomonassavastanoi)的复制起点。使用的引物是：f37a：序列：5′agatctacgcttatgggtgcctttcc(seqidno27)，以及b29a：序列：5′agatctaatacgcaaaccgcctctcc(seqidno28)。将pcr产物首先克隆到topotapcr2.1(invitrogen)中，然后通过bglii消化克隆到pave075中。通过电穿孔将所得质粒pave086转化到恶臭假单胞菌ncimb12018中以制备cld075，将它纯化并保存在-80℃的甘油原液中。从-80℃冷冻机中取出cld075小瓶，让它解冻。将10μl的解冻甘油原液接种到补充四环素(10μg/ml)的5mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)中。在37℃的定轨摇床中温育16小时。然后使用500μl的该培养物接种含有50ml的lb培养液(组成如上所述)的两个250ml锥形瓶。将锥形瓶在定轨摇床中30℃、200rpm进行温育。监测生长直到od600＝0.5-0.7。这时用0.5mm终浓度的iptg诱导一个锥形瓶，而留下第二个锥形瓶不诱导以检测基础表达。在上述条件下继续温育，在此期间取样进行生长的测定和细菌细胞中hadl蛋白质累积的测定。使用光密度扫描取样细菌的全细胞溶胞产物的胶体蓝染色的sds-page胶来确定hadl的累积水平。hadl蛋白质的表达和累积示于图10中。数据表明，t7a3：dpps91表达系统在另一种原核宿主系统中起作用。令人惊讶的是，表达系统在恶臭假单胞菌中的生产效率与使用大肠杆菌作为宿主系统所观察到的生产效率是相同的。甚至在没有诱导物的23小时温育之后也未检测到基础表达。在使用iptg诱导后获得了恶臭假单胞菌中的高水平蛋白质表达和累积。实施例18使用实施例11中描述的普通大肠杆菌培养基和工艺条件进行使用恶臭假单胞菌cld075的补料分批发酵。将发酵保持在30℃和ph7.0(用25％氢氧化铵和10％磷酸控制)。以分批模式进行发酵，直到碳源(即甘油)耗尽。这时通过加入含有甘油(714g/l)和硫酸镁(30g/l)的进料来起始补料分批发酵。一旦发酵中的生物量水平达到od600＝50，就通过加入1mmiptg(终浓度)进行诱导。在诱导后继续补料分批阶段12-15小时。在发酵期间取样确定生物量水平(od600)和hadl蛋白质累积((％tcp)取样细菌的全细胞溶胞产物的胶体蓝染色的sds-page胶)。诱导之后cld075的生长和hadl蛋白质的表达/累积示于图11中。使用表达系统在恶臭假单胞菌中获得了高水平的蛋白质表达和累积(＞40％tcp)，甚至通过仅仅使用设计来用于大肠杆菌的普通生长培养基也是如此。实施例19将合成的gal阻抑物基因(大肠杆菌)作为psti片段克隆到载体pzen042(如ep0502637所述)的psti位点中。鉴别具有顺时针方向和反时针方向gal阻抑物基因的克隆。选择具有反时针方向的克隆以产生pave071。在质粒pzt7#2.0中开始构建gal启动子和操纵基因序列，所述质粒根据us6537779所述进行制备。pzt7#2.0具有pat153载体骨架、cer稳定性序列、teta/r、感兴趣基因上游的单一天然lac操纵基因序列以及上游t4转录终止子。修饰天然gal操纵基因序列以产生完全回文操纵基因序列。使用合成的寡核苷酸接头通过ecori和xbai限制酶位点将它克隆到上述质粒中。通过退火寡核苷酸galb1和galb2来制备接头galb：galb1(seqidno29)5′aattcataccataagcctaattctacgaattatcagagttctggttaccggtgtaagcgcttacactgtgalb2(seqidno30)5′ctagacagtgtaagcgcttacaccggtaaccagaactctgataattcgtagaattaggcttatggtatg然后将接头连接到质粒pzt7#2.0中，作为ecori/xbai片段转化到克隆宿主株xl-1bluemr(stratagene)中。使用agei通过限制酶切消化初步筛选转化体。通过测序确认序列。将htnfα基因作为ndei/xhoi片段克隆到该质粒中。通过用xmai和msci消化并连接到用xmni和xmai消化过的pave071中来克隆htnfα基因和部分的gal完全回文操纵基因序列。通过限制酶切消化来筛选克隆中htnfα基因的存在。使用合成接头通过stui和ecori位点将每个上游完全回文gal操纵基因和gal启动子克隆到该质粒中。通过退火寡核苷酸gala1和gala2来制备接头gala：galal(seqidno31)：5＇caattgtgtaagcgcttacacaactttattccatgtcacacttttcgcatctttgttatgctatggtggala2(seqidno32)5′aattcaccatcgcataacaaggatgcgaaaagtgtgacatggaataaagttgtgtaagcgcttacacaattg用mfei消化来检测接头的存在，通过测序确认。将该质粒转化到大肠杆菌菌株w3110中以产生cld085，将它纯化并保存在-80℃的甘油原液中。从-80℃冷冻机中取出cld085小瓶，让它解冻。将10μl的解冻甘油原液接种到补充四环素(10μg/ml)的5mllb培养液(lb，5g/l酵母提取物(oxoid)，10g/l胰化蛋白胨(oxoid)和5g/l氯化钠)中。在37℃的定轨摇床中温育16小时。然后使用500μl的该培养物接种含有50ml的lb培养液(组成如上所述)的250ml锥形瓶。将锥形瓶在定轨摇床中37℃、200rpm进行温育。监测生长直到od600＝0.5-0.7。这时用10.0mm终浓度的半乳糖诱导锥形瓶。在上述条件下继续温育，在此期间取样进行生长的测定和细菌细胞中htnfα累积的测定。在取样细菌的sds-page之后，使用蛋白质印迹分析(使用抗-htnfα抗体)来确定htnfα的累积水平。数据提供在图17中。这证明使用完全回文的gal操纵基因序列结合gal阻抑物基因会导致没有诱导物时的gal启动子的非常严重的阻抑，同时令人惊讶的是，在加入半乳糖时，仍然保持了诱导能力。实施例20如下构建非整合型酵母载体：1)将序列1(啤酒糖酵母cyc1启动子的大肠杆菌laci下游)作为xhoi片段克隆到xhoi消化的pcr2.1(invitrogen)中。克隆序列1示于图15中(seqidno35)。2)将序列2(由啤酒糖酵母mf-α1基因启动子组成，在mf-α1启动子区的任意一侧带有完全回文lac操纵基因序列，带有蛋白质-抑弹性蛋白酶蛋白的基因序列，c-myc标记(抑弹性蛋白酶蛋白-cmyc)位于下游)作为hindiii片段(通过pcr制备)克隆到hindiii消化的步骤1所构建的质粒中以产生质粒2。克隆序列2示于图16中(seqidno36)。3)从yep13(atcc37115)克隆含有leu2(选择标记基因)和酵母2μ复制起点的spei片段到spei消化的质粒2中以产生pave091。通过电穿孔将pave091质粒dna转化到啤酒糖酵母xs95-6c(atcc204688)中，在没有亮氨酸的酵母缺陷培养基上筛选阳性菌落(kaiserc，michaeliss和mitchela，酵母遗传学方法，冷泉港实验手册(methodsinyeastgenetics，coldspringharborlaboratorymanual，1994))。使用同样的培养基进行摇瓶生长研究以确定抑弹性蛋白酶蛋白-cmyc蛋白质表达。将锥形瓶在定轨摇床中30℃、200rpm进行温育。将克隆生长到约3的od，用0.5mmiptg(终浓度)诱导。在上述条件下再继续温育16小时，在此期间取样测定生长和分泌到生长培养基中的抑弹性蛋白酶蛋白-cmyc蛋白质。按照wiedowo，etal，jbiolchem.(1990)265(25)：14791-5所述，使用弹性蛋白酶抑制酶试验来确定分泌到残余生长培养基中的抑弹性蛋白酶蛋白-cmyc。iptg诱导后4小时，生长培养基中有30mg/l的活性抑弹性蛋白酶蛋白蛋白质。这证明本发明的表达系统在酵母中是有效的。实施例21合成含有组成型人巨细胞病毒(hcmv)启动子的dna片段，启动子侧接双重的完全回文lac操纵基因序列。将它克隆到表达iggfc蛋白质的表达载体中。将所得质粒命名为pave081，它源自pcmv-script(stratagene)，含有hcmv启动子，启动子侧接ndei/nhei片段上的双重的完全回文lac操纵基因序列，载体的多克隆位点中带有iggfcdna序列。hcmv启动子和双重的完全回文lac操纵基因的dna序列示于图12中(seqidno33)。iggfc蛋白质的dna序列示于图13中(seqidno34)。如现有技术中所充分描述的那样进行了表达iggfc蛋白质的pave081和表达lac阻抑物的pcmvlaci(stratagene)的瞬时共转染，以确定在iptg诱导型hcmv启动子-双重的完全回文lac操纵基因表达系统的控制之下能否表达iggfc蛋白质。将2ml的每毫升1.5x105个活细胞的中国仓鼠卵巢(cho细胞系ecacc85050302，适于在无血清培养基中悬浮生长)悬浮培养物加入到6孔组织培养平板的每个孔中。然后将6孔组织培养平板在5％co2的37℃湿润培养箱中温育过夜(16小时)，然后制备转染混合物，每孔含有2μg的pave081dna与等量pcmvlaci(stratagene)dna、6μl的转染试剂和94μl的生长培养基。将100μl的转染混合物加入到含有cho细胞的每个孔中。然后将6孔组织培养平板在5％co2的37℃湿润培养箱中温育。为确定表达/分泌进入生长培养基中的iggfc的水平，用5mmiptg(终浓度)诱导一组孔(第2天)，留下一组孔不诱导。在第三天，对用iptg诱导的一组孔和留下未诱导的那些孔进行取样(iptg诱导后和未诱导的)。如现有技术中所公知的那样通过elisa确定由cho细胞所表达和分泌到生长培养基中的iggfc蛋白质。所获得的数据示于图14中。数据清楚地证明了表达系统的广泛有用性。表达系统可用于控制典型地用在哺乳动物表达系统中的强力组成型启动子诸如hcmv启动子，以便在哺乳动物细胞中以可控制的、可诱导的方式来表达蛋白质。序列表<110>aveciabiologicslimited<120>表达系统<130>smc60733/wo<140>pct/gb2007/000351<141>2007-02-01<150>gb0602173.7<151>2006-02-03<160>40<170>patentinversion3.3<210>1<211>47<212>dna<213>人工的<220><223>在接头12.1的制备中使用的寡核苷酸1<400>1catgtgggaattgtgagcgctcacaattccaagaacaatcctgcacg47<210>2<211>47<212>dna<213>人工的<220><223>在接头12.1的制备中使用的寡核苷酸2.1<400>2aattcgtgcaggattgttcttggaattgtgagcgctcacaattccca47<210>3<211>77<212>dna<213>人工的<220><223>在t7a3启动子克隆中使用的寡核苷酸3<400>3aattcaaacaaaacggttgacaacatgaagtaaacacggtacgatgtaccggaattgtga60gcgctcacaattcccca77<210>4<211>77<212>dna<213>人工的<220><223>在t7a3启动子克隆中使用的寡核苷酸4<400>4ctggtggggggttgtgggcgctcgcggttccggtgcgtcgtgccgtgtttgcttcgtgtt60gtcggccgttttgtttg77<210>5<211>79<212>dna<213>人工的<220><223>在接头1112的制备中使用的寡核苷酸11<400>5aattttctgaaatgagctgttgacaattaatcatcggctcggatactgtgtggaattgtg60agcggataacaattcccca79<210>6<211>79<212>dna<213>人工的<220><223>在接头1112的制备中使用的寡核苷酸12<400>6ctagtggggaattgttatccgctcacaattccacacagtatccgagccgatgattaattg60tcaacagctcatttcagaa79<210>7<211>78<212>dna<213>人工的<220><223>在接头1314的制备中使用的寡核苷酸13<400>7aattttctgaaatgagctgttgacaattaatcatcggctcggatactgtgtggaattgtg60agcgctcacaattcccca78<210>8<211>78<212>dna<213>人工的<220><223>在接头1314的制备中使用的寡核苷酸14<400>8ctagtggggaattgtgagcgctcacaattccacacagtatccgagccgatgattaattgt60caacagctcatttcagaa78<210>9<211>78<212>dna<213>人工的<220><223>在t7a3启动子克隆中使用的寡核苷酸5<400>9aattcgaaacaaaacggttgacaacatgaagtaaacacggtacgatgtaccggaattgtg60agcgctcacaattcccca78<210>10<211>78<212>dna<213>人工的<220><223>在t7a3启动子克隆中使用的寡核苷酸6<400>10ctggtggggggttgtgggcgctcgcggttccggtgcgtcgtgccgtgtttgcttcgtgtt60gtcggccgttttgtttcg78<210>11<211>77<212>dna<213>人工的<220><223>在接头78的制备中使用的寡核苷酸7<400>11aattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcggaattgtga60gcgctcacaattcccca77<210>12<211>77<212>dna<213>人工的<220><223>在接头78的制备中使用的寡核苷酸8<400>12ctagtggggaattgtgagcgctcacaattccgctcagtatcaccgccagtggtatttatg60tcaacaccgccagagat77<210>13<211>77<212>dna<213>人工的<220><223>在tac启动子克隆中使用的寡核苷酸15<400>13aattcctgaaatgagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtga60gcgctcacaattcccca77<210>14<211>77<212>dna<213>人工的<220><223>在tac启动子克隆中使用的寡核苷酸16<400>14ctagtggggaattgtgagcgctcacaattccacacattatacgagccgatgattaattgt60caacagctcatttcagg77<210>15<211>33<212>dna<213>人工的<220><223>在ecori接头的制备中使用的寡核苷酸19<400>15aattcaccggtgtacagtcatgtacaaccggtg33<210>16<211>33<212>dna<213>人工的<220><223>在ecori接头的制备中使用的寡核苷酸20<400>16aattcaccggttgtacatgactgtacaccggtg33<210>17<211>1550<212>dna<213>鼠亚科种属(murinaegen.sp.)<400>17catatgaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgctgcccaacca60gcgatggcccaggtgcagctgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagc120ctgtccatcacatgcaccgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggtt180cgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgatttggggtgatggaaacaca240gactataattcagctctcaaatccagactgagcatcagcaaggacaactccaagagccaa300gttttcttaaaaatgaacagtctgcacactgatgacacagccaggtactactgtgccaga360gagagagattataggcttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcagcc420tccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggc480acagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtgg540aactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcagga600ctctactccctcagcagcgtggtgactgtgccctccagtagcttgggcacccagacctac660atctgcaacgtgaatcacaaccccagcaacaccaaggtcgacaagaaagttgagcccaaa720tcttcaactaagacgcacacatcaggaggtgaacagaagctcatctcagaagaggatctg780aattaataagggagcttgcatgcaaattctatttcaaggagacagtcataatgaaatacc840tattgcctacggcagccgctggattgttattactcgctgcccaaccagcgatggccgaca900tcgagctcacccagtctccagcctccctttctgcgtctgtgggagaaactgtcaccatca960catgtcgagcaagtgggaatattcacaattatttagcatggtatcagcagaaacagggaa1020aatctcctcagctcctggtctattatacaacaaccttagcagatggtgtgccatcaaggt1080tcagtggcagtggatcaggaacacaatattctctcaagatcaacagcctgcaacctgaag1140cttttgggagttattactgtcaacatttttggagtactcctcggacgttcggtggaggga1200ccaagctcgagatcaaacggactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctg1260atgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatccca1320gagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga1380gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctga1440gcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctga1500gttcgcccgtcacaaagagcttcaaccgcggagagtcatagtaaggatcc1550<210>18<211>72<212>dna<213>人工的<220><223>在接头2122的制备中使用的寡核苷酸21<400>18aattcgaaacaaaacggttgacaacatgaagtaaacacggtacgatgtaccacatgaaac60gacagtgagtca72<210>19<211>72<212>dna<213>人工的<220><223>在接头2122的制备中使用的寡核苷酸22<400>19ctagtgactcactgtcgtttcatgtggtacctcgtaccgtgtttacttcatgttgtcaac60cgttttgtttcg72<210>20<211>79<212>dna<213>人工的<220><223>在接头2324的制备中使用的寡核苷酸23<400>20aattcgaaacaaaacggttgacaacatgaagtaaacacggtacgatgtaccggaattgtg60agcggataacaattcccca79<210>21<211>79<212>dna<213>人工的<220><223>在接头2324的制备中使用的寡核苷酸24<400>21ctagtggggaattgttatccgctcacaattccggtacatcgtaccgtgtttacttcatgt60tgtcaaccgttttgtttcg79<210>22<211>1592<212>dna<213>人工的<220><223>编码实施例15中所产生的双特异性单链四价二体的序列<400>22catatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagct60caagcccaggtgcagctgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctg120tccatcacatgcaccgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgc180cagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgatttggggtgatggaaacacagac240tataattcagctctcaaatccagactgagcatcagcaaggacaactccaagagccaagtt300ttcttaaaaatgaacagtctgcacactgatgacacagccaggtactactgtgccagagag360agagattataggcttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcagcctcc420accaagggcccatcgagcgccaaaaccaccccggacatcgagctctcccagtctccagca480atcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgta540acttacattcactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaatcctggatttatgcc600acatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctct660tactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccaacat720tggagtagtaaaccaccgacgttcggtggaggcaccaagctcgagatcaaacggactgtg780cgcgccgatgccgccccgaccgtgcaggtgcagctgcaggaatctggtggtggcttagtt840caacctggtggttccctgagactctcctgtgcaacttctgggttcaccttcactgattac900tacatgaactgggtccgccagcctccaggaaaggcacttgagtggttgggttttattgga960aacaaagctaatggttacacaacagagtacagtgcatctgtgaagggtcggttcaccatc1020tccagagataaatcccaaagcatcctctatcttcaaatgaacaccctgagagctgaggac1080agtgccacttattactgtacaagagatagggggctacggttctactttgactactggggc1140caaggcaccacggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcgagcgccaaaacc1200accccggacatcgagctcacccagtctccagcctccctttctgcgtctgtgggagaaact1260gtcaccatcacatgtcgagcaagtgggaatattcacaattatttagcatggtatcagcag1320aaacagggaaaatctcctcagctcctggtctattatacaacaaccttagcagatggtgtg1380ccatcaaggttcagtggcagtggatcaggaacacaatattctctcaagatcaacagcctg1440caacctgaagcttttgggagttattactgtcaacatttttggagtactcctcggacgttc1500ggtggagggaccaagctcgagatcaaacggactgtgggatccgaacaaaagctgatctca1560gaagaagacctaaactcatgataagcggccgc1592<210>23<211>1237<212>dna<213>人工的<220><223>编码实施例16中所产生的gst融合蛋白的序列<400>23catatgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgactt60cttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgat120aaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttccttattatatt180gatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatagctgacaagcac240aacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggtt300ttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaa360gttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcat420aaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtatgacgctctt480gatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaattagtttgtttt540aaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatata600gcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatcg660gatctggttccgcgtggatccggaccaaacacagaatttgcactatccctgttaaggaaa720aacataatgactataacaacctcaaagggagagttcacagggttaggcatacatgatcgt780gtctgtgtgatacccacacacgcacagcctggtgatgatgtactagtgaatggtcagaaa840attagagttaaggataagtacaaattagtagatccagagaacattaatctagagcttaca900gtgttgactttagatagaaatgaaaaattcagagatatcaggggatttatatcagaagat960ctagaaggtgtggatgccactttggtagtacattcaaataactttaccaacactatctta1020gaagttggccctgtaacaatggcaggacttattaatttgagtagcacccccactaacaga1080atgattcgttatgattatgcaacaaaaactgggcagtgtggaggtgtgctgtgtgctact1140ggtaagatctttggtattcatgttggcggtaatggaagacaaggattttcagctcaactt1200aaaaaacaatattttgtagagaaacaataagaattcc1237<210>24<211>513<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>24catatgatgtgtgatctgccgcaaactcatagcctgggtagccgtcgcaccctgatgctg60ctggcccaaatgcgccgtatctccctgttctcctgtctgaaagaccgccatgactttggc120ttcccgcaggaagagttcggtaaccagttccaaaaggcagaaactatcccggtactgcac180gaaatgattcaacagatttttaacctgttcagcactaaagactcctctgctgcatgggac240gaaactctcctggacaaattctacaccgaactgtaccagcaactgaacgacctggaagcc300tgcgtcatccagggtgttggcgtaaccgaaactccgctgatgaaagaagactccatcctg360gctgttcgcaaatacttccagcgtatcaccctgtacctgaaagagaagaaatacagcccg420tgcgcttgggaagttgtacgcgctgaaatcatgcgttccttcagcctgtccactaacctg480caagaatctctgcgtagcaaagaataactcgag513<210>25<211>517<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>25catatggctccgccacgtctgatttgtgactctcgcgttctggagcgttacctgctggag60gccaaggaagccgaaaacatcacgaccggttgtgcggaacattgctctctgaatgagaac120atcactgttccggatacgaaggttaacttctacgcttggaaacgtatggaagtaggccag180caggcagtagaagtgtggcagggtctggcgctgctgtccgaagcggttctgcgtggccag240gcgctgctggtcaactccagccagccgtgggagccgctgcagctgcacgtagataaagcg300gttagcggtctgcgttccctgactaccctgctgcgcgcgctgggtgcgcaaaaagaagct360atctccccgccagatgcggcatctgcagccccgctgcgtaccatcactgcagatactttc420cgcaagctgtttcgtgtttattccaacttcctgcgtggtaaactgaagctgtacaccggt480gaagcgtgccgtaccggcgatcgttaataaactcgag517<210>26<211>713<212>dna<213>恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)<400>26catatgaaggaaataaccaatgaaaaacatccaaggtatcgttttcgatttgtatggcac60gctctacgacgtgcattccgtggtgcaagcctgtgaagaggtctatccgggccaaggcga120cgctatttctcgcctctggcggcaaaagcaattggaatacacctggctcaggagcctcat180gggccgttacgtgaactttgagaaagcaacagaggatgccttgcgctttacctgcacgca240tctgggcttgtcgctcgatgatgaaacccaccagcgcctcagtgatgcttatttgcacct300caccccttatgccgatacagctgacgccgttcgccgtttgaaagctgcgggcctaccgct360aggcatcatttcaaatggttctcattgctcgatcgagcaagtcgtgactaactctgaaat420gaattgggcgttcgatcagctgatcagcgtcgaggatgtgcaagtgttcaaacctgatag480tcgcgtctatagccttgccgagaagcgcatgggttttccaaaggaaaacatcctcttcgt540ttcgtcaaacgcgtgggatgcgagtgcagccagtaactttggtttcccggtttgctggat600caatcggcagaacggcgcgtttgatgagctggatgcaaagccgacacacgtcgtgcgtaa660tctcgccgaaatgtcgaactggctggttaattcgctcgattaatgaaggatcc713<210>27<211>26<212>dna<213>人工的<220><223>实施例17中使用的f37a引物<400>27agatctacgcttatgggtgcctttcc26<210>28<211>26<212>dna<213>人工的<220><223>实施例17中使用的b29a引物<400>28agatctaatacgcaaaccgcctctcc26<210>29<211>69<212>dna<213>人工的<220><223>在galb接头的制备中使用的寡核苷酸galb1<400>29aattcataccataagcctaattctacgaattatcagagttctggttaccggtgtaagcgc60ttacactgt69<210>30<211>69<212>dna<213>人工的<220><223>在galb接头的制备中使用的寡核苷酸galb2<400>30ctagacagtgtaagcgcttacaccggtaaccagaactctgataattcgtagaattaggct60tatggtatg69<210>31<211>68<212>dna<213>人工的<220><223>在gala接头的制备中使用的寡核苷酸gala1<400>31caattgtgtaagcgcttacacaactttattccatgtcacacttttcgcatctttgttatg60ctatggtg68<210>32<211>72<212>dna<213>人工的<220><223>在gala接头的制备中使用的寡核苷酸gala2<400>32aattcaccatcgcataacaaggatgcgaaaagtgtgacatggaataaagttgtgtaagcg60cttacacaattg72<210>33<211>438<212>dna<213>人工的<220><223>编码实施例21中所使用的hcmv启动子和lac操纵基因的序列<400>33catatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattat60gcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatc120gctattataccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttg180actcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcacc240aaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggga300attgtgagcgctcacaattcctctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatca360ctagatgcgtacagtccgatgacttgcatggaattgtgagcgctcacaattccaagcttt420attgcggtataggctagc438<210>34<211>813<212>dna<213>人工的<220><223>编码实施例21中使用的iggfc蛋白的序列<400>34atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggt60gacgcggcccagccggccaggcgcgcgcgccgtacgtacaagcttggatccgcagagccc120aaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggggga180ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccct240gaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactgg300tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaac360agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaag420gagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc480aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgag540ctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatc600gccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg660ctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg720cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg780cagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga813<210>35<211>1104<212>dna<213>人工的<220><223>实施例20中使用的克隆序列1<400>35ctcgaggcatgtgctctgtatgtatataaaactcttgttttcttcttttctctaaatatt60ctttccttatacattaggacctttgcagcataaattactatacttctatagacacgcaaa120cacaaatacacacactaaatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaa180ctggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcg240ccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtg300gtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctc360gcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgct420gtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacaccc480atcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtc540gcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgt600ctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaa660cgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgag720ggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgc780gccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgat840accgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctg900ctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggc960aatcagcttttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaa1020accgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctcgcacgacaggtttcccga1080ctggaaagcgggcagtgactcgag1104<210>36<211>1026<212>dna<213>人工的<220><223>实施例20中使用的克隆序列2<400>36ggatcctaggcaataattatgagataaatggtgcagcactattaagtagtgtggatttca60ataatttccgaattaggaataaatgcgctaaatagacatcccgttctctttggtaatctg120cataattctgatgcaatatccaacaactatttgtgcaattatttaacaaaatccaattaa180ctttcctaattagtccttcaatagaacatctgtattccttttttttatgaacaccttcct240aattaggccatcaacgacagtaaattttgccgaatttaatagcttctactgaaaaacagt300ggaccatgtgaaaagatgcatctcatttatcaaacacataatattcaagtgagccttact360tcaattgtattgaagtgcaagaaaaccaaaaagcaacaacaggttttggataagtacata420tataagggaattgtgagcgctcacaattcctgttactgttcttacgattcatttacgatt480caagaatagttcaaacaagaagattacaaactatcaatggaattgtgagcgctcacaatt540ccaagaatgagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcatta600gctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtc660atcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagc720acaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaa780ggggtatctctcgagaaaagagaggctgaagctgctcaagaaccagttaaaggtcctgtg840tctactaagccaggttcttgtcctattatcttgattcgttgcgctatgttaaacccacct900aaccgttgtttgaaggacactgattgtccaggtatcaaaaagtgctgtgaaggttcctgc960ggtatggcttgtttcgttccacaagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgtaatag1020cagctg1026<210>37<211>78<212>dna<213>人工的<220><223>在tac启动子克隆中使用的寡核苷酸17<400>37aattttctgaaatgagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtg60agcgctcacaattcccca78<210>38<211>78<212>dna<213>人工的<220><223>在tac启动子克隆中使用的寡核苷酸18<400>38ctagtggggaattgtgagcgctcacaattccacacattatacgagccgatgattaattgt60caacagctcatttcagaa78<210>39<211>78<212>dna<213>人工的<220><223>在lambdapl启动子克隆中使用的寡核苷酸9<400>39aattcatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcggaattgtg60agcgctcacaattcccca78<210>40<211>78<212>dna<213>人工的<220><223>在lambdapl启动子克隆中使用的寡核苷酸10<400>40ctagtggggaattgtgagcgctcacaattccgctcagtatcaccgccagtggtatttatg60tcaacaccgccagagatg78当前第1页12