一种颠茄AbPDS基因及其应用的制作方法

本发明属于vigs技术体系领域，具体是一种颠茄abpds基因及其在构建vigs体系中的应用。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(virusinducedgenesilencing,vigs)能够诱导靶基因瞬时沉默从而应用于植物基因功能的研究，然而目前在颠茄上的vigs的体系尚未建立。病毒诱导的基因沉默目前已经广泛应用于植物基因功能的研究。该技术主要是以植物病毒为载体，导入靶基因的部分序列后，采用注射含病毒载体的菌体入植物细胞后，导入序列会与靶基因mrna形成双链最终导致靶基因降解，从而起到了基因沉默的作用。

技术实现要素：

鉴于此，本发明解决的技术问题是，本发明提供了一种在颠茄中实现瞬时基因沉默的vigs体系，为研究颠茄基因功能提供了重要的技术支持。

本发明在传统中药材颠茄中建立了病毒诱导的vigs体系。从颠茄中克隆了编码八氢番茄红素脱氢酶(phytoenedesaturase,pds)基因，通过vigs技术在颠茄中实现了pds基因表达沉默，从而抑制了颠茄叶绿素的生物合成，最终导致了叶片出现漂白现象。本发明首次克隆abpds基因并建立了颠茄的vigs体系，为研究颠茄基因的生物学功能提供了可靠的技术保障。

本发明采用的技术方案是：一种颠茄abpds基因，其dna序列为seqidno.1。

上述颠茄abpds基因，由dna序列为seqidno.2和dna序列为seqidno.3的上游引物和下游引物，进行pcr扩增获得。

pcr扩增的体系如下：

pcr程序为：95℃,3min→(95℃，变性30s→58℃，退火30s→72℃，延伸1min)×35循环→72℃，5min。

本发明所述abpds基因抑制叶绿素合成，用于构建vigs体系。所述vigs体系的构建步骤如下：

选择abpds基因中的770-bp片段克隆至ptrv2中，构建ptrv2-abpds重组质粒；ptrv2-abpds重组质粒是将所述abpds基因中的770-bp片段和trv2质粒分别用saci和kpni进行双酶切；再通过t4连接酶进行连接获得的。

分别将trv1以及trv2-abpds重组质粒转化进入农杆菌gv3101；

用trv1+trv2-abpds转化的农杆菌gv3101注射两周大颠茄幼苗，暗培养48h后移入光照培养，10d左右发现光漂白现象；

用分光光度法测定vigs介导的abpds沉默颠茄叶片的叶绿素含量，并用qpcr分析abpds基因的表达水平验证vigs效果。

本发明获得了颠茄abpds基因，验证了abpds基因的沉默具有抑制叶绿素合成的作用，为颠茄vigs体系的建立提供了重要的对照基因；颠茄vigs体系的构建有助于研究颠茄基因的生物学功能。

附图说明

图1为vigs沉默abpds导致的漂白结果图；

图2为颠茄叶绿素含量图；

图3为abpds基因表达水平示意图。

具体实施方式

1.利用pcr技术克隆获得abpds基因全长(编码区)，dna序列为seqno.1；如下所示：

其中下划线部分为本发明所选择的插入片段，用于构建ptrv2-abpds载体。

pcr反应中所用的引物：

序列为seqidno.2的上游引物(f-abpdscds)：

5-atgtgtcataagttaaagattc-3

序列为seqidno.3的下游引物(r-abpdscds)：

5-ctaaattacacttgcttctgcc-3

pcr步骤包括：

pcr体系如下：

pcr程序：95℃,3min→(95℃，变性30s→58℃，退火30s→72℃，延伸1min)×35循环→72℃，5min。

2.选择abpds基因中的770-bp片段克隆至vigs载体ptrv2中，构建ptrv2-abpds沉默载体并转入农杆菌gv3101；

插入片段，以高保真酶扩增获得的abpds编码序列为模板，采用下列引物进行pcr扩增：

f-abpds-trv2-saci：

5-gcgagctctcaatgcagtgcatcttgatcgc-3

r-abpds-trv2-kpni：

5-gcggtaccaagacagcaccttccattgaggc-3

将获得的770-bp片段和trv2质粒分别用saci和kpni进行双酶切；再通过t4连接酶进行连接获得ptrv2-abpds重组质粒

trv1质粒编码了病毒的复制蛋白、运动蛋白和转运因子，是vigs体系中不可或缺的质粒，在这个质粒的作用下，烟草脆裂病毒能够侵染植株。

分别将trv1，trv2以及trv2-abpds重组质粒转化进入农杆菌gv3101。

3.用trv1+trv2-abpds转化的农杆菌gv3101注射两周大颠茄幼苗，暗培养48h后移入光照培养，10d左右发现光漂白现象；

在实验中分别设置有对照组(trv1+trv2)以及实验组(trv1+trv2-abpds)。对照组结果如图1左图所示，实验组结果如图1右图所示。

4.用分光光度法测定vigs介导的abpds沉默颠茄叶片的叶绿素含量，并用qpcr分析abpds基因的表达水平验证vigs效果。

分光光度法测定叶绿素的方法如下：

色素的提取：剪去新鲜的白化叶片与对照组叶片，除去粗大的叶脉并剪成均一碎块，分别称重0.5g作为实验材料。在研钵中加入丙酮5毫升、少许石英砂、少许碳酸钙，然后研磨成匀浆待用。把匀浆放入离心管中离心，并用80％的丙酮冲洗研钵2次一并倒进离心管离心，4000rpm/6min。待离心后取上清液用80％的丙酮定容到20ml。

od值的测定：叶绿素a、叶绿素b分别在波长663nm、645nm处有最大吸收值，可采用光度法进行测定叶绿素的含量。取上述叶绿素提取液1毫升，稀释到5毫升，加入到比色皿中测定od663、od645的吸光值。将测定获得的吸光值分别用下列公式进行计算：

ρa＝0.0127a663-0.00269a645

ρb＝0.0229a663-0.00468a645

ρt＝ρa+ρb

ρa：叶绿素a含量；ρb：叶绿素b含量；ρt：总叶绿素含量。

分别计算出叶绿素a、叶绿素b的含量和总的含量，在计算出每g所含的叶绿素含量。将白化的叶片叶绿素含量与对照组叶片叶绿素的含量进行比对。结果如图2所示，图中(a)表示叶绿素a的含量，(b)表示叶绿素b的含量，(c)表示的是总叶绿素含量。从图中可知在vigs植株中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量较对照都有显著性地降低。

qpcr方法得到的结果如图3所示。

qpcr引物如下：

采用iqtm5多通道实时监测系统(bio-rad,usa)对上述处理样本进行了荧光定量pcr分析。按照premixextaq(宝生物，中国大连)的方案进行如下操作。

在200μlep管中加入以下反应试剂，正向引物和反向引物序列见上表所示：

反应程序为：95℃，30s；(95℃，5s；各基因最佳退火温度，30s；72℃，20s，检测荧光信号)×40个循环；各个组织的样本分别设3个机械重复1个阴性对照。为了判断荧光定量pcr的扩增是否特异，在上述扩增程序完成后进行融解曲线分析，程序如下：60℃到95℃逐渐升温，每间隔0.5℃读数一次，每次5s，连续记录荧光信号的变化。

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<110>重庆科技学院

<120>一种颠茄abpds基因及其应用

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