本发明属于固废资源化领域，具体涉及一种复合生物表面活性剂的制备方法。
背景技术
城市生活垃圾治理是当前人类所面临的普遍性问题，它直接关系到人口、资源、环境能否协调发展的问题。当前，堆肥作为废弃资源循环利用的有效措施在世界上许多国家和地区得到了广泛应用。堆肥过程是利用微生物(包括细菌、酵母菌、放线菌、真菌和原生动物等)在一定温度、湿度和ph值条件下，使固体废物中有机物发生生物化学降解，形成一种类似腐殖质土壤的物质，其影响腐熟的因素主要包括有机质含量、水分、通气量、温度、碳氮比、ph值等。随着城市人口的增多，传统堆肥方法的效率已不能满足要求。为了提高堆肥效率，我国科研工作者针对堆肥的不同影响因素作了大量的试验，王敦球等在猪粪的堆肥中加入竹醋酸，以促进微生物的活性，缩短达到高温所需的时间，减少氮损失；王伟东等研究了供氧方式及供氧量对堆肥发酵进程的影响；席北斗等研究了温度对生活垃圾堆肥效率的影响。
目前，向堆肥中加入表面活性剂成为提高堆肥效率的常用方法，其提高堆肥效率的原理是：(1)有利于有机物从堆肥颗粒上脱除进入堆肥间隙液相中，再由微生物进行降解，间接缩短了堆肥时间。(2)降低了堆肥颗粒间隙液相的表面张力，有利于有机物和菌体的传输，使堆肥各个层面的有机物与菌体充分接触，从而提高堆肥的效率。(3)促进水分在堆肥颗粒中传输和分散，使水分在较短的时间内渗透到堆肥的深层，而且表面活性剂具有良好的保湿性能，能够减缓堆肥中水分的蒸发，有利于长时间保持微生物的活性。
表面活性剂分为合成表面活性剂和生物表面活性剂。生物表面活性剂是微生物的次级代谢产物，它本身具有既亲油又亲水的两亲性分子结构，具有分散、增溶、润湿、渗透等特性，能够降低界面张力和表面张力。与合成表面活性剂相比，生物表面活性剂具有更好的生物可降解性、生物可适应性以及环境友好性等优点。单一的生物表面活性剂在提高堆肥效率方面有一定的局限性。因此，有必要研发用于堆肥的复合生物表面活性剂，加速微生物对废弃有机物的分解，提高堆肥效率。
技术实现要素：
为满足上述领域的需求，本发明提供一种复合生物表面活性剂的制备方法，该方法简便易行，无需分离纯化步骤，所得到的复合生物表面活性剂的表面张力低于25mn/m，与生活垃圾混合后能够显著提高堆肥效率。
本发明请求保护的技术方案如下：
一种复合生物表面活性剂的制备方法，其特征在于，混合枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和解脂假丝酵母(candidalipolytica)，得到复合菌剂；将所述复合菌剂接种于培养基中发酵培养，所得发酵液即复合生物表面活性剂。
优选地，所述复合菌剂中，所述枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母的活菌数量比为4～7：3～8。
优选地，所述复合菌剂的接种量为培养基体积的4％～6％。
优选地，发酵培养条件为：温度32～34℃，搅拌速度440～570r/min，通气量1.5～1.8vvm。
优选地，发酵培养46～50小时。
优选地，所述培养基由以下成分组成：na2hpo44～4.5g/l，kh2po43.5～4.5g/l，nh4no32.5～3.0g/l，mgso40.09-0.10g/l，cacl2·2h2o0.02～0.03g/l，nacl0.05～0.10g/l，微量元素溶液0.8～1.0ml/l，葡萄糖35～45g/l，ph6.5～7.0；
所述微量元素溶液的配方为：znso42.3-4mg/l，mncl2·4h2o178-200mg/l，cocl2·6h2o5-12mg/l，cuso4·5h2o3-10mg/l，fec6h5o7·5h2o2.1-3.9g/l。
任一所述的制备方法制备得到的复合生物表面活性剂。
用于培养生物表面活性剂产生菌产生物表面活性剂的培养基，其特征在于，由以下成分组成：na2hpo44～4.5g/l，kh2po43.5～4.5g/l，nh4no32.5～3.0g/l，mgso40.09-0.10g/l，cacl2·2h2o0.02～0.03g/l，nacl0.05～0.10g/l，微量元素溶液0.8～1.0ml/l，葡萄糖35～45g/l，ph6.5～7.0；
所述微量元素溶液的配方为：znso42.3-4mg/l，mncl2·4h2o178-200mg/l，cocl2·6h2o5-12mg/l，cuso4·5h2o3-10mg/l，fec6h5o7·5h2o2.1-3.9g/l。
优选地，所述生物表面活性剂产生菌是指枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和解脂假丝酵母(candidalipolytica)。
本发明研究发现，将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和解脂假丝酵母(candidalipolytica)的复合菌剂在一定条件下进行发酵培养，所得到的发酵液表面张力低至22.5mn/m，将所述发酵液与生活垃圾混合后进行堆肥发酵，能够明显提高生活垃圾的堆肥效率。
不同的菌种生产生物表面活性剂所需要的营养元素和培养条件都不相同，枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种细菌，解脂假丝酵母是假丝酵母属的一种真菌，两者的最适生长条件相差较远。要获得高产量的生物表面活性剂，所选择的培养基和培养条件需要兼顾菌种的生长繁殖和生物表面活性剂的产生。当发酵液的表面张力低于30mn/m后，每降低1mn/m都十分困难。本发明通过优化培养基中必需元素和微量元素的配比以及发酵培养条件，不仅能够同时满足枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母的生长需要，还能够促进生物表面活性剂的产生。
采用本发明方法获得的枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母的发酵液，可直接作为复合生物表面活性剂使用。将所述发酵液与生活垃圾混合后进行堆肥，能够有效降低堆肥中有机颗粒界面的表面张力，加快微生物对有机物的降解速度，使堆肥效率提高40～70％。在本发明的其它实施例中，也可以从发酵液中分离纯化生物表面活性剂。
综上，本发明的复合生物表面活性剂的制备方法具有以下优点：(1)制备方法简单：只需将枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母按比例混合，在一定条件下发酵培养，所得发酵液即复合生物表面活性剂；(2)表面张力低：发酵液的表面张力值低于25mn/m；(3)成本低廉：所得发酵液无需进一步分离纯化，可直接用于生活垃圾堆肥发酵，降低了成本。因此，本发明的复合生物表面活性剂作为一种新的生物表面活性剂，具有应用于堆肥工业化生产的巨大潜力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的保护范围。
生物材料来源：
枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号cgmcc1.3358；
解脂假丝酵母(candidalipolytica)：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号cicc1457。
上述菌种本实验室亦有保存，申请人声明：自申请日起二十年内可向公众免费发放用于必要的验证实验。应该理解的是，本发明的实现并不依赖于上述菌株编号代表的菌株，每个菌株可以采用同一菌种中的其它菌株进行替代。因此，在此提供的菌株不用于限制本发明的保护范围。
试剂与仪器：
蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉：购买自北京兰博利德商贸有限公司；
葡萄糖：购买自苏州蓝翔化工科技有限公司；
橄榄油：购买自江西省吉水中南天然香料油厂；
无机试剂：购买自国药集团化学试剂有限公司。
自动界面张力仪，型号qjzy-1，购买自上海平轩科学仪器有限公司；下述实施例中，用自动界面张力仪按照厂家说明书记载的方法检测发酵液的表面张力值。
下述实施例中未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得；未特别说明的实验方法和条件可参考本领域常规的实验方法和条件进行。
实施例1.菌种的种子液制备
1、斜面活化
将枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母分别接种于新鲜的斜面培养基中，在恒温培养箱中于30℃培养48小时。
斜面培养基的成分为：牛肉膏2.0g/l；蛋白胨5.0g/l；nacl5.0g/l；琼脂20.0g/l；ph7.0。将配制好的斜面培养基在121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温后使用。
2、种子液培养
制备种子液培养基：称取去皮马铃薯200.0g，切成1厘米见方的小块，加水1000ml，煮沸后小火保持沸腾30分钟，用三层纱布过滤，将滤液补足1000ml，加入蔗糖20.0g，自然ph。121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温后使用。
接种：在无菌操作条件下，使用无菌操作技术，将斜面培养基中活化好的枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母分别接入灭菌的种子液培养基中。
培养：将接种了枯草芽孢杆菌的种子液培养基在180r/min的转速条件下37℃摇床培养18小时；将接种了解脂假丝酵母的种子液培养基在180r/min的转速条件下30℃摇床培养18小时。
活菌计数：分别检测培养的枯草芽孢杆菌菌液和解脂假丝酵母菌液中的活菌数，两种菌各自的活菌数至少达到1.0×108cfu/ml数量级时，即制得种子液。
实施例2.复合生物表面活性剂的制备
将枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母的种子液按照4～7：3～8的活菌数量比混合，得到复合菌剂。将复合菌剂按照4％～6％的体积百分比接种于发酵用培养基中，培养46～50小时，得到的发酵液即复合生物表面活性剂。
培养条件为：温度32～34℃，搅拌速度440～570r/min，通气量1.5～1.8vvm。
发酵用培养基的配方为：na2hpo44～4.5g/l，kh2po43.5～4.5g/l，nh4no32.5～3.0g/l，mgso40.09-0.10g/l，cacl2·2h2o0.02～0.03g/l，nacl0.05～0.10g/l，微量元素溶液0.8～1.0ml/l，葡萄糖35～45g/l，ph6.5～7.0。其中，微量元素溶液的配方为：znso42.3-4mg/l，mncl2·4h2o178-200mg/l，cocl2·6h2o5-12mg/l，cuso4·5h2o3-10mg/l，fec6h5o7·5h2o2.1-3.9g/l，溶剂为蒸馏水。
用自动界面张力仪检测发酵液的表面张力，结果表明，发酵液的表面张力值低于25mn/m。
以下是具体的实验例和对比例：
实验例1
发酵用菌种：按照4：8的活菌数量比混合枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母的种子液，得到复合菌剂。
将复合菌剂按照4％的体积百分比接种于发酵用培养基中，控制温度为34℃，搅拌速度为440r/min，通气量为1.5vvm，发酵培养50小时，得发酵液。
发酵用培养基的配方为：na2hpo44.3g/l，kh2po44g/l，nh4no32.7g/l，mgso40.10g/l，cacl2·2h2o0.03g/l，nacl0.08g/l，微量元素溶液1.0ml/l，葡萄糖40g/l，ph6.8，溶剂为蒸馏水。
微量元素溶液的配方为：znso43mg/l，mncl2·4h2o190mg/l，cocl2·6h2o9mg/l，cuso4·5h2o7mg/l，fec6h5o7·5h2o3g/l，溶剂为蒸馏水。
经检测，发酵液的表面张力值为24.1mn/m。
实验例2
发酵用菌种：按照7：3的活菌数量比混合枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母的种子液，得到复合菌剂。
将复合菌剂按照5％的体积百分比接种于发酵用培养基中，控制温度为32.7℃，搅拌速度为570r/min，通气量为1.8vvm，发酵培养48小时，得发酵液。
发酵用培养基的配方为：na2hpo44.3g/l，kh2po44g/l，nh4no32.7g/l，mgso40.10g/l，cacl2·2h2o0.03g/l，nacl0.08g/l，微量元素溶液1.0ml/l，葡萄糖40g/l，ph6.8，溶剂为蒸馏水。
微量元素溶液的配方为：znso43mg/l，mncl2·4h2o190mg/l，cocl2·6h2o9mg/l，cuso4·5h2o7mg/l，fec6h5o7·5h2o3g/l，溶剂为蒸馏水。
经检测，发酵液的表面张力值为22.5mn/m。
实验例3
发酵用菌种：按照5：6的活菌数量比混合枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母的种子液，得到复合菌剂。
将复合菌剂按照6％的体积百分比接种于发酵用培养基中，控制温度为32℃，搅拌速度为500r/min，通气量为1.7vvm，发酵培养46小时，得发酵液。
发酵用培养基的配方为：na2hpo44.3g/l，kh2po44g/l，nh4no32.7g/l，mgso40.10g/l，cacl2·2h2o0.03g/l，nacl0.08g/l，微量元素溶液1.0ml/l，葡萄糖40g/l，ph6.8，溶剂为蒸馏水。
微量元素溶液的配方为：znso43mg/l，mncl2·4h2o190mg/l，cocl2·6h2o9mg/l，cuso4·5h2o7mg/l，fec6h5o7·5h2o3g/l，溶剂为蒸馏水。
经检测，发酵液的表面张力值为23.8mn/m。
实验例4
发酵用菌种：按照7：3的活菌数量比混合枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母的种子液，得到复合菌剂。
将复合菌剂按照5％的体积百分比接种于发酵用培养基中，控制温度为32.7℃，搅拌速度为570r/min，通气量为1.8vvm，发酵培养48小时，得发酵液。
发酵用培养基的配方为：na2hpo44g/l，kh2po43.5g/l，nh4no32.5g/l，mgso40.09g/l，cacl2·2h2o0.02g/l，nacl0.05g/l，微量元素溶液0.8ml/l，葡萄糖35g/l，ph6.5，溶剂为蒸馏水。
微量元素溶液的配方为：znso42.3mg/l，mncl2·4h2o178mg/l，cocl2·6h2o5mg/l，cuso4·5h2o3mg/l，fec6h5o7·5h2o2.1g/l，溶剂为蒸馏水。
经检测，发酵液的表面张力值为23.3mn/m。
实验例5
发酵用菌种：按照7：3的活菌数量比混合枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母的种子液，得到复合菌剂。
将复合菌剂按照5％的体积百分比接种于发酵用培养基中，控制温度为32.7℃，搅拌速度为570r/min，通气量为1.8vvm，发酵培养48小时，得发酵液。
发酵用培养基的配方为：na2hpo44.5g/l，kh2po44.5g/l，nh4no33.0g/l，mgso40.10g/l，cacl2·2h2o0.03g/l，nacl0.10g/l，微量元素溶液1.0ml/l，葡萄糖45g/l，ph7.0，溶剂为蒸馏水。
微量元素溶液的配方为：znso44mg/l，mncl2·4h2o200mg/l，cocl2·6h2o12mg/l，cuso4·5h2o10mg/l，fec6h5o7·5h2o3.9g/l，溶剂为蒸馏水。
经检测，发酵液的表面张力值为23.1mn/m。
实验例6
发酵用菌种：按照4：8的活菌数量比混合枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母的种子液，得到复合菌剂。
将复合菌剂按照4％的体积百分比接种于发酵用培养基中，控制温度为34℃，搅拌速度为440r/min，通气量为1.5vvm，发酵培养50小时，得发酵液。
发酵用培养基的配方为：na2hpo44g/l，kh2po43.5g/l，nh4no32.5g/l，mgso40.09g/l，cacl2·2h2o0.02g/l，nacl0.05g/l，微量元素溶液0.8ml/l，葡萄糖35g/l，ph6.5，溶剂为蒸馏水。
微量元素溶液的配方为：znso42.3mg/l，mncl2·4h2o178mg/l，cocl2·6h2o5mg/l，cuso4·5h2o3mg/l，fec6h5o7·5h2o2.1g/l，溶剂为蒸馏水。
经检测，发酵液的表面张力值为24.7mn/m。
对比例1
发酵用菌种：按照7：3的活菌数量比混合枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母的种子液，得到复合菌剂。
将复合菌剂按照5％的体积百分比接种于发酵用培养基中，控制温度为37℃，搅拌速度为500r/min，通气量为1.8vvm，发酵培养45小时，得发酵液。
发酵用培养基的配方为：na2hpo44.3g/l，kh2po44g/l，nh4no32.7g/l，mgso40.10g/l，cacl2·2h2o0.03g/l，nacl0.08g/l，微量元素溶液1.0ml/l，葡萄糖40g/l，ph6.8，溶剂为蒸馏水。
微量元素溶液的配方为：znso43mg/l，mncl2·4h2o190mg/l，cocl2·6h2o9mg/l，cuso4·5h2o7mg/l，fec6h5o7·5h2o3g/l，溶剂为蒸馏水。
经检测，发酵液的表面张力值为28.9mn/m。
对比例2
发酵用菌种：按照7：3的活菌数量比混合枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母的种子液，得到复合菌剂。
将复合菌剂按照5％的体积百分比接种于发酵用培养基中，控制温度为32.7℃，搅拌速度为570r/min，通气量为1.8vvm，发酵培养48小时，得发酵液。
发酵用培养基的配方为：na2hpo44.3g/l，kh2po44g/l，nh4cl5g/l，mgso40.10g/l，cacl2·2h2o0.03g/l，nacl0.08g/l，微量元素溶液1.0ml/l，橄榄油50g/l，ph6.8，溶剂为蒸馏水。
微量元素溶液的配方为：znso43mg/l，mncl2·4h2o190mg/l，cocl2·6h2o9mg/l，cuso4·5h2o7mg/l，fec6h5o7·5h2o3g/l，溶剂为蒸馏水。
经检测，发酵液的表面张力值为27.4mn/m。
对比例3
发酵用菌种：按照7：3的活菌数量比混合枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母的种子液，得到复合菌剂。
将复合菌剂按照5％的体积百分比接种于发酵用培养基中，控制温度为32.7℃，搅拌速度为570r/min，通气量为1.8vvm，发酵培养48小时，得发酵液。
发酵用培养基的配方为：na2hpo44.3g/l，kh2po44g/l，nh4no32.7g/l，mgso40.10g/l，cacl2·2h2o0.03g/l，nacl0.08g/l，葡萄糖40g/l，ph6.8，溶剂为蒸馏水。
经检测，发酵液的表面张力值为26.6mn/m。
对比例4
发酵用菌种：枯草芽孢杆菌的种子液。
将枯草芽孢杆菌的种子液按照5％的体积百分比接种于发酵用培养基中，控制温度为37℃，搅拌速度为500r/min，通气量为1.8vvm，发酵培养45小时，得发酵液。
发酵用培养基的配方为：na2hpo44.3g/l，kh2po44g/l，nh4no32.7g/l，mgso40.10g/l，cacl2·2h2o0.03g/l，nacl0.08g/l，微量元素溶液1.0ml/l，葡萄糖40g/l，ph6.8，溶剂为蒸馏水。
微量元素溶液的配方为：znso43mg/l，mncl2·4h2o190mg/l，cocl2·6h2o9mg/l，cuso4·5h2o7mg/l，fec6h5o7·5h2o3g/l，溶剂为蒸馏水。
经检测，发酵液的表面张力值为30.5mn/m。
上述发酵液可以直接作为复合生物表面活性剂用于堆肥，发酵液的用量为生活垃圾质量的0.2～0.6％。
实施例3.复合生物表面活性剂在生活垃圾堆肥中的应用
本实施例所使用的生活垃圾，取自北京市某居民区的厨余垃圾，有机成分见表1。
表1.生活垃圾中的有机成分表
处理组1～3：将实验例1～3中发酵培养得到的发酵液分别与生活垃圾充分混合后进行堆肥发酵，具体如下：将50公斤的生活垃圾与7公斤的草木灰(秸秆与锯末完全焚烧后得到的混合物，其中秸秆与锯末的质量比为6-9：2-5)混合，在混合的过程中喷洒发酵液，发酵液的添加量为生活垃圾质量的0.2％。采用保温箱体进行好氧堆肥发酵，发酵过程中采取每4小时曝气30分钟的方式进行供氧，同时温度保持在40℃。
对照组：以蒸馏水代替发酵液，其余步骤同处理组1～3。
在堆肥发酵过程中每24h提取垃圾间隙液，测定表面张力，同时检测co2的产生速率，结果如表2和表3所示。
表2.垃圾间隙液的表面张力测定结果(mn/m)
表3.co2的产生速率(mol/h.kg)