本发明属于微生物领域，具体涉及一株产胞外多糖，具有固沙能力的溶杆菌scsio17111及其应用。
背景技术：
溶杆菌属(lysobacter)属于变形菌门、γ-变形菌纲、黄单胞菌目、黄单胞菌科。溶杆菌属菌株细胞呈细杆状，大小一般为0.2～0.5×1.0～15(有些能达到70)μm，无鞭毛，具滑行能力，可弯曲，为革兰氏阴性、好氧细菌，其基因组dna中g+c含量高，达到61.7％～70.7％。溶杆菌属菌落具有较强黏性，颜色一般为奶油色、粉红色或黄褐色。
近二、三十年来，随着人口数量增加，城市规模不断扩大，人类经济活动的加剧，对土地资源的不合理利用和破坏，使干旱、半干旱和具有干旱灾害的半湿润地区的土地发生退化，即土地退化，也叫“沙漠化”。在人类诸多的环境问题中，荒漠化是最为严重的灾难之一，全球沙化土壤正以每年5～7万平方公里的速度扩展，有10亿以上的人、40％以上的陆地表面受到荒漠化的影响。
干旱、半干旱地区沙漠化的扩张越来越严重，导致土地退化，土壤肥力、生物多样性降低，极端环境和社会经济因素加剧了土地的退化。目前防沙固沙的主要方法是物理固沙、化学固沙和植被的培植，但成本相对较高，且干旱半干旱地区降水不足、蒸发强烈，植树造林的成活率较低。利用微生物结皮固沙作为新型固沙方式，具有适应性强、成本低、见效快等优势。沙漠结皮中的微生物既是结皮形成的参与者，又是结皮的重要组成部分，具有增强土壤团聚稳定性、改善表层土壤水分状况、防止土壤侵蚀等作用。已有研究表明，土壤结皮之所以能形成，与微生物以及它所分泌的多糖类物质有着密不可分的关系。细菌在土壤结皮形成的初期，起到了重要作用，在其代谢过程中会分泌大量的胞外聚合物即胞外多糖。多糖物质能胶结土壤颗粒使之成为团聚体，在团聚体的形成与稳定过程中起到了粘结作用。有关细菌固沙的研究已有报道，pan等将从新疆古尔班通古特沙漠生物土壤结皮底层分离出来的一株寡营养细菌制成菌剂喷洒于沙漠表面，可以起到固沙和减缓土壤水分蒸发的效果，从而对沙漠环境起到了一定的改善作用。张雪梅等将从古尔班通古特沙漠中分离纯化得到的一株产胞外多糖的固氮细菌(azotobactersp.)制成菌液喷洒在流沙表面形成了一层微生物结皮，对中麻黄、乌拉尔甘草等多年生干旱荒漠植物有保水、保苗作用。wu等将从沙漠生物结皮中分离出的细菌接种到野外沙田后，刺激了表层土壤中异养微生物的聚集，细菌、放线菌的数量及总磷、速效氮、速效磷含量显著增加，对土壤具有固沙、保水、防化学侵蚀的作用，同时对生物结皮的恢复起到有效的作用。
现阶段，已用于固沙的微生物主要集中在蓝藻门，主要包括丝状蓝藻，如念珠藻属(nostoc)、颤藻属(oscillatoria)、柱孢藻属(cylindrospermum)和席藻属(phormidium)等。蓝藻作为土壤调节剂的使用已被断断续续地研究了几十年，随着人们逐渐认识到蓝藻在生物结皮形成过程中的重要性，最近又重新成为关注的重点。将蓝藻接种到沙地表面，可通过藻丝对沙粒的机械缠绕和细胞多糖等有机物的粘附作用形成团聚体，由团聚体构成的生物结皮能起到固沙作用。科研人员摸索研发在野外流沙上接种蓝藻的技术方法，取得了一定的成果，相关技术应用于修复荒漠化生境。溶杆菌虽可产生胞外多糖，但目前未见对溶杆菌的固沙能力的相关研究报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株从中国海南省三沙市南沙岛礁生物土壤结皮中分离获得的产胞外多糖并能够固沙的溶杆菌(lysobactersp.)scsio17111菌株，为固沙和生物土壤结皮提供新的微生物资源。
本发明的溶杆菌(lysobactersp.)scsio17111于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.14537。
本发明根据苯酚-硫酸法(phenol-sulphuricacidmethod)，利用葡萄糖标准曲线，测定菌株scsio17111胞外多糖产量，结果显示其胞外多糖产量为0.08±0.01mg/ml。用溶杆菌scsio17111的tsb培养液均匀的喷洒在粒径小于1.25mm且大于0.20mm的无菌珊瑚沙时，经过55天的培养，发现其能够有效地促进结皮的形成，形成的结皮厚度为6.00±1.32mm；当培养液均匀地喷洒在粒径小于0.20mm的无菌珊瑚沙上时，经过55天的培养，形成的结皮厚度为2.33±0.58mm。虽然后者的结皮厚度不如前者，但是后者的土壤团聚物稳定性更强，即对土壤团聚物进行干筛时，后者的团聚物能保持较好的稳定性，而前者更易破碎。
因此，本发明的第二个目的是提供溶杆菌scsio17111在固沙和/或建立生物土壤结皮中的应用。
优选应用方法是先培养溶杆菌scsio17111的菌液，然后菌液接种到需要固沙的区域。
进一步优选，所述的培养溶杆菌scsio17111的菌液是用tsb培养基培养溶杆菌scsio17111，获得菌液，所述的tsb培养基为：胰蛋白胨17.0g/l，大豆蛋白胨3.0g/l，葡萄糖2.5g/l，氯化钠5.0g/l，k2hpo42.5g/l，溶剂为水，ph7.3±0.2。
本发明所提供的溶杆菌scsio17111可以使沙粒团聚并保持相对稳定的状态，从而起到固沙的效果，可以应用于防治干旱、半干旱地区沙漠化和岛礁生物土壤结皮的构建。相较于物理固沙、化学固沙和植被的培植，利用微生物结皮固沙作为新型固沙方式，具有适应性强、成本低、见效快等优势。本发明首次公开了对溶杆菌固沙能力的定性定量研究。
本发明的溶杆菌(lysobactersp.)scsio17111于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.14537。
附图说明：
图1是菌株scsio17111对粒径小于1.25mm且大于0.2mm的无菌珊瑚沙的固沙效果。
图2是菌株scsio17111对粒径小于0.2mm的无菌珊瑚沙的固沙效果。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：溶杆菌(lysobactersp.)scsio17111的分离
1.样品采集
生物土壤结皮样品于2016年11月采自中国南海岛礁。样品采集后，迅速装入无菌的聚乙烯采样袋中，阴干，保存于室温。
2.分离培养基
分离培养基为tsa(胰蛋白大豆琼脂)培养基：市售产品(bd)，胰蛋白胨15.0g/l，大豆蛋白胨5.0g/l，氯化钠5.0g/l，琼脂15.0g/l，溶剂为水，ph7.3±0.2。其配制方法是将上述组分按其含量混合均匀，调ph值至ph7.3±0.2，灭菌消毒即得。
3.菌株的分离筛选
将结皮样品进行充分研磨并混匀，然后取2g置于装有18ml无菌去离子水的锥形瓶中，锥形瓶中放有一些已灭菌的小玻璃珠，30℃、200r/min振荡摇匀30min，静置1min后取1ml的样品悬液进行梯度稀释，分别取200μl原液及稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍、1000000倍的样品涂布于分离培养基上，每一处理设3个重复。30℃培养2-4天，根据菌落的形态，从平板上挑出单菌落，并在新鲜的培养基上进行四区划线纯化。由此分离纯化获得菌株scsio17111。
对菌株scsio17111使用easypurebacteriagenomicdnakit(全式金)进行基因组dna抽提，然后用通用引物27f/1492r扩增16srrna基因片段并测序，其序列如seqidno.1所示。对16srrna基因序列通过ezbiocloud网站的在线比对，发现与其亲缘关系最近的是菌株pb-6250t，菌种名为lysobacterfirmicutimachus，相似度为99.78％。因此，本发明的菌株scsio17111属于溶杆菌lysobacter属，将其命名为溶杆菌(lysobactersp.)scsio17111，该菌于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.14537。
本发明的溶杆菌(lysobactersp.)scsio17111与现有技术中的lysobacterfirmicutimachuspb-6250t具有很多区别，如lysobacterfirmicutimachuspb-6250t在42℃不生长，以及没有记录可在10℃生长，但是本发明的溶杆菌(lysobactersp.)scsio17111能在42℃和10℃下生长，同时本发明的溶杆菌(lysobactersp.)scsio17111的最适生长温度是28-32℃，而lysobacterfirmicutimachuspb-6250t的最适生长温度是25-28℃。l.firmicutimachuspb-6250t仅能在nacl浓度(w/v)小于等于0.5％时生长，而本发明的溶杆菌(lysobactersp.)scsio17111可在nacl浓度(w/v)为1％时生长；此外，目前未见lysobacter属已知种固沙效果相关介绍，而本发明的这一新菌株具有固沙效果，因此本发明的溶杆菌(lysobactersp.)scsio17111是lysobacter属的一个新株。
实施例2：溶杆菌scsio17111胞外多糖产量的测定
将溶杆菌scsio17111接种于tsb培养基(bd)中，培养基成分为胰蛋白胨17.0g/l，大豆蛋白胨3.0g/l，葡萄糖2.5g/l，氯化钠5.0g/l，k2hpo42.5g/l，溶剂为水，ph7.3±0.2，其配制方法是将上述成分按其含量混合均匀，调ph值，然后再灭菌即得。30℃、180r/min条件下，培养45h。将培养液经11603g离心20min去除菌体，然后将上清液再通过0.22μm的滤膜过滤，充分去除残余的微生物细胞。接着将滤液倒入试管中，加入4倍体积的体积分数95％乙醇水溶液，4℃沉淀过夜。然后将混合液经2057g离心20min，去除上清液，收集沉淀物。所获得的沉淀物经丙酮、无水乙醇依次洗涤，洗涤后的沉淀然后再加入体积分数为80％的三氯乙酸4ml，用于去除蛋白质。最后将液体除去，将沉淀物置于烘箱中60℃干燥30h，获得胞外多糖样品。
采用苯酚-硫酸法对胞外多糖样品进行多糖含量的测定。首先制作单糖标准曲线：准确称取葡萄糖(分析纯)10mg于50ml烧杯中，加去离子水充分溶解，并将水溶液倒入250ml容量瓶中，加去离子水定容，分别吸取0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml于试管中，各补水至1.0ml。然后加入6％苯酚0.5ml及浓硫酸(分析纯，95.5％)2.5ml，静置10min，摇匀，室温放置20min后用分光光度计于490nm测吸光度，以1.0ml去离子水按同样显色操作为空白对照。横坐标为葡萄糖质量，纵坐标为光吸收值，绘制标准曲线。然后将制备的溶杆菌scsio17111的胞外多糖样品重新溶于与原菌株培养液等体积的去离子水中，制成溶液。从样品溶液中移取0.8ml放进试管中，然后加水补至1.0ml。然后加入6％苯酚0.5ml及浓硫酸(分析纯，95.5％)2.5ml，静置10min，摇匀，室温放置20min后利用分光光度计在490nm下测吸光度，以1.0ml去离子水按同样显色操作为空白对照，测出吸光度，根据标准曲线计算出多糖含量。检测结果表明溶杆菌scsio17111用tsb培养基培养45h，其胞外多糖产量为0.08±0.01mg/ml。
实施例3：溶杆菌scsio17111固沙能力的测定
将珊瑚沙依次过16目(筛孔1.25mm)和80目(筛孔0.20mm)筛具，分别获得粒径小于1.25mm且大于0.20mm的珊瑚沙和粒径小于0.20mm的珊瑚沙，将其分别装于不同的培养皿中，每种规格沙质均做3个重复，然后将其121℃灭菌25min，置于烘箱中60℃烘干并拌至松散均匀。将溶杆菌scsio17111接种于tsb培养基(同实施例2)中，30℃、180r/min条件下，振荡培养48h后，将菌液装于无菌的小喷壶中，均匀的喷洒于珊瑚沙上，以灭菌的tsb培养基为空白对照。于30℃，培养55天后，对结皮的厚度进行测量。检测结果表明溶杆菌scsio17111能够有效地促进结皮的形成，当培养液均匀的喷洒在粒径小于1.25mm且大于0.20mm的无菌珊瑚沙上时，形成的结皮厚度为6.00±1.32mm(图1)；当培养液均匀的喷洒在粒径小于0.20mm的无菌珊瑚沙上时，形成的结皮厚度为2.33±0.58mm(图2)。虽然后者的结皮厚度不如前者，但是后者的土壤团聚物稳定性更强，即对土壤团聚物进行干筛时，后者的团聚物能保持较好的稳定性，而前者更易破碎。而作为对照的tsb培养基喷洒到珊瑚沙后，两种粒径大小的珊瑚沙都没有结皮。由此可见，本发明所提供的溶杆菌scsio17111可以使沙粒团聚并保持相对稳定的状态，从而起到固沙的效果，可以应用于防治干旱、半干旱地区沙漠化和岛礁生物土壤结皮的构建。相较于物理固沙、化学固沙和植被的培植，利用微生物结皮固沙作为新型固沙方式，具有适应性强、成本低、见效快等优势。
序列表
<110>中国科学院南海海洋研究所
<120>一株产胞外多糖可固沙的溶杆菌scsio17111及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1390
<212>dna
<213>溶杆菌scsio17111(lysobactersp.)
<400>1
atgcagtcgaacggcagcacagaggagcttgctccttgggtggcgagtggcggacgggtg60
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