一种苯并[a]芘降解菌及其用法和用途以及制备该菌株的无机盐培养基及其制法的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及一种苯并[a]芘降解菌、该降苯并[a]芘降解菌的使用方法、用途以及该苯并[a]芘降解菌的无机盐培养液及其制法。技术背景多环芳烃（polycyclicaromatichydrocarbon,pahs）是由2个或2个以上的苯环以线状、角状或簇状的方式构成的烃类化合物及其衍生物，普遍的存在于环境中。土壤环境中的pahs多来源于石油化工生产过程中，由于石油化工会产生高盐度废水，因此pahs污染多伴随着盐环境存在，相关研究指出较高盐度的环境会影响一般微生物的正常代谢，导致污染修复效果不理想，利用嗜盐微生物降解盐环境下pahs污染土壤是一条可行的解决途径。高分子量pahs，由于辛醇-水分配系数高，水溶性差，在自然环境中对微生物的生长有严重抑制作用，加之其稳定的分子结构，使其更加难被生物所利用。现研究阶段以萘、菲、蒽等四环以下的低分子量多环芳烃为唯一碳源的菌株较多，而以高分子量pahs为唯一碳源的降解菌株相对较少。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供一种苯并[a]芘降解菌和无机盐培养液，以及该苯并[a]芘降解菌的使用方法，可高效降解苯并[a]芘。该苯并[a]芘降解菌还能用于降解菲和芘。技术方案：一种苯并[a]芘降解菌，分类命名为粪肠球菌enterococcusfaecalis，属于革兰氏阳性菌，命名为ef-b8，所述苯并[a]芘降解菌于2018年4月20日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏号为cgmccno.15636。所述降解菌16srrna的genbank登录号为mg255128。一种用于制备所述的苯并[a]芘降解菌的无机盐培养基，其组分包括na2so4，0.5g;nh4ci，0.3g;caci2,0.1g；kh2po4，0.2g；kci，0.5g及微量元素溶液1ml；加入蒸馏水定容至1l；所述无机盐培养基的ph为7.3~7.5，盐度为1%-10%。所述微量元素溶液包括hcl(25%)，10ml;fecl2·4h2o，1.5g；cocl2·4h2o，190mg;mncl2·4h2o,100mg；zncl2,70mg;h3bo3，62mg;namo4·2h2o,36mg；nicl2·6h2o,24mg；cucl2·2h2o,17mg；加入超纯水定容至1l。一种制备所述的无机盐培养基的方法：①取na2so4,0.5g;nh4ci,0.3g;caci2,0.1g；kh2po4,0.2g；kci,0.5g及微量元素溶液1ml，用蒸馏水溶解；②加入koh与hcl调节ph为7.3至7.5；按照20:3的质量比加入nacl与mgcl•6h2o调节盐度为1%至10%；并用蒸馏水定容到1l；③用121℃高压蒸汽灭菌20min。一种使用所述的苯并[a]芘降解菌降解苯并[a]芘的方法：①无机盐培养基中加入一定量的甲基-β-环糊精，使其在无机盐培养基的浓度为5g/l至20g/l；所述的无机盐培养基的盐度优选为1%；所述的甲基-β-环糊精在无机盐培养基的浓度优选为10g/l；②加入苯并[a]芘和苯并[a]芘降解菌的菌液；所述的苯并[a]芘在无机盐培养基的浓度优选为30mg/l；苯并[a]芘降解菌的菌液与无机盐培养基的体积比优选为1：9；③将步骤②得到的溶液在30℃、180r/min条件下避光震荡培养降解14天。所述的苯并[a]芘降解菌的用途还包括用于降解菲和芘。有益效果：本发明的苯并[a]芘降解菌，配合本发明中的无机盐培养液使用，可高效降解苯并[a]芘。该苯并[a]芘降解菌还能用于降解菲和芘，对微生物修复多环芳烃污染的环境具有重要意义。附图说明图1为ef-b8生物量与苯并[a]芘的降解曲线图；图2为ef-b8在不同盐度下对苯并[a]芘降解效果图；图3为ef-b8在不同浓度的甲基-β-环糊精d下对苯并[a]芘的降解效果图；图4为ef-b8对菲、芘的降解效果图。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1：苯并[a]芘降解菌的分离、纯化与鉴定。本发明采用苯并[a]芘为唯一碳源，逐步提高培养基中碳源（苯并[a]芘）浓度的方法进行富集并筛选出单一菌株。（1）取10g江苏油田附近石油污染土壤添加到100ml含有苯并[a]芘（初始浓度为5mg/l）的无机盐培养基，在30℃、180r/min条件下避光震荡培养两周；步骤2：移取步骤1中的菌液到苯并[a]芘浓度为10mg/l的无机盐培养基继续培养两周；步骤3：每2周取10ml上清液于新鲜无机盐培养基（含苯并[a]芘浓度增加5mg/l），连续富集6次。至无机盐培养基的苯并[a]芘浓度为30mg/l后，培养两周，取1ml菌液，分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六个梯度，取100μl不同稀释倍数的菌液涂布于含有30mg/l苯并[a]芘的固体平板上，每个稀释倍数的样品设3个平行样，倒置于恒温培养箱30℃培养72h，然后加入琼脂将无机盐培养基固化，根据菌落的不同形态进行菌株的分离、纯化获得降解菌株，将挑取的降解菌株进行平板划线，四次纯化，接种于液体无机盐培养基中培养，在30℃、180r/min条件下避光震荡培养两周，对比分离菌株的降解率，最后得出一株苯并[a]芘的高效降解菌ef-b8。菌株生物量与对苯并[a]芘的降解率如图1所示。（2）用fsatdnatmspinkitforsoildna提取试剂盒，从菌液中提取降解菌的dna，提取的基因dna取一定量进行pcr扩增验证后，储存至-20℃保存备用。基因的pcr扩增：上游引物27f：5′-agagtttgatcctggctcag-3′下游引物1492r：5′-ggttaccttgttacgactt-3′聚合酶链式反应（pcr）为40μm体系：基因组模板1μm，上下游引物各1μm，taq酶20μm，补充双蒸水（ddh2o）17μm至40μm，空白以双蒸水代替dna模板。pcr扩增程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环后，72℃修复延伸10min，10℃保存，待用。（3）pcr产物纯化、克隆、测序和分析：将pcr连接转化至感受态细胞，送至苏州泓迅生物科技公司进行测序，测定16srrna基因序列，如序列表，进行核苷酸序列blast比对，与肠球菌（enterococcusfaecalis）的16srrna同源性在99%。序列表acgacggcagtgattcgagctcggtacccggggatcctctagagatagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgcttctttcctcccgagtgcttgcactcaatcggaaagaggagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctacccatcagagggggataacacttggaaacaggtgctaataccgcataacagtttatgccgcatggcataagagtgaaaggcgctttcgggtgtcgctgatggatggacccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggccacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagagaagaacaaggacgttagtaactgaacgtcccctgacggtatctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggagagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaggaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagcaaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttggaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgaccactctagagatagagctttcccttcggggacaaagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattgttagttgccatcatttagttgggcactctagcgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggaagtacaacgagtcgctagaccgcgaggtcatgcaaatctcttaaagcttctctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtacctttttggagccagccgcctaaggtgggatagatgattggggcgaagtcgtaacaaggtaaccgtcgacctgcaggcatgcaagctggcgtaatcagtca实施例2：ef-b8的形态及生理化特征鉴定（1）淀粉水解试验培养基配制：在牛肉膏3g/l、蛋白胨10g//l、nacl5g/l组成的肉汤培养基中添加可溶性淀粉，使其在培养基中的浓度为0.2％，加入2％的琼脂，121℃灭菌20min，在无菌操作情况下倒入平板待用。鲁哥氏碘液：1g碘、2g碘化钾，先用少量的水将碘化钾溶解，再加入碘片，待碘溶解后，加水稀释至300ml。取菌株点接于平板上，30℃培养2～4天，形成菌落后，在平板上滴加鲁哥氏碘液，以铺满菌落周围。阳性反应(淀粉被水解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈；阴性反应则菌落周围没有透明圈。（2）v-p试验培养基配制：蛋白胨5g，葡萄糖5g，nacl,5g，蒸馏水1000ml，调节ph7.0～7.2，分装试管，每管装4～5ml，121℃灭菌20min。试剂：40％koh，6％α-萘酚纯酒精溶液。在无菌操作情况下，将菌株接种于上述培养基中，于30℃培养4天，取培养液2.5ml，先加入α-萘酚纯酒精溶液0.6ml，再加入40％koh水溶液0.2ml，摇动2～5min，阳性菌立即变红。如无红色出现，静置于30℃恒温箱，如2小时内仍不显现红色，可判定为阴性。（3）甲基红试验培养基配制：与v-p试验一致。试剂：甲基红0.02g，95％酒精60ml，蒸馏水40ml。在无菌操作情况下，将菌株接种于上述培养基中，于30℃培养4天，在培养液中滴加几滴甲基红，若培养基变红色，则为阳性，若培养基为黄色，为阴性。（4）tween80水解试验培养基配制：蛋白胨1g，nacl,0.5g，cacl2,0.01g，琼脂1.5g，蒸馏水100ml。121℃灭菌20min，冷却至50℃，加入tween80使其终浓度为1％，倒平板备用。在无菌操作情况下，挑取菌点接种于上述平板上，35℃培养2～4d，菌落周围有白色晕圈为阳性，否则为阴性。（5）接触酶活性在干净载玻片上滴加1滴3％h2o2，用接种环挑取试验菌1环，在h2o2中涂抹，若有气泡产生为阳性，否则为阴性。表1：菌株生理化指标特征生理化指标结果淀粉水解试验+v-p试验-甲基红试验-tween80水解试验+接触酶活性+注：+为阳性；-为阴性实施例3：ef-b8在不同盐度下对苯并[a]芘的降解能力。分别配制1%、3%、5%、10%的无机盐培养基，添加苯并[a]芘的丙酮溶液，完全挥发丙酮，使反应体系中苯并[a]芘的质量浓度为30mg/l。分别取10ml菌液接种到90ml的不同盐度的培养基中，待第14天测定苯并[a]芘的残余量。以培养基盐度为横坐标，以菌株对苯并[a]芘的降解率为纵坐标绘制柱状图，以三个平行样品的标准偏差为依据做误差线，结果显示于图2。ef-b8在1%-10%盐度范围中对苯并[a]芘有不同程度的降解能力，总体呈盐度增高降解率下降的趋势。1%、3%、5%盐况下对苯并[a]芘均有较高的降解能力，14天降解率分别达到63.96%、57.61%和49.52%，在高盐度条件下（10%盐度）降解率为27.13%。实施例4：ef-b8在不同甲基-β-环糊精(mcd)浓度下对苯并[a]芘的降解能力。分别称取一定量甲基-β-环糊精，使其溶到100ml培养基后浓度为5g/l、10g/l、15g/l、20g/l，以不加甲基-β-环糊精为对照，测定降解苯并[a]芘的能力。反应体系设三个平行样，并在30℃、180r/min条件下避光震荡培养。培养14天后，如图3所示，当mcd浓度为10g/l时，降解率最高，达到71.22%，随着浓度不断增大，降解能力又出现下降趋势，15g/l、20g/l时，降解率分别为53.49%、49.89%，表明添加一定量的mcd对苯并[a]芘或有增溶作用，在添加量为5g/l、10g/l时，对苯并[a]芘的降解有促进作用。实施例5：ef-b8对不同多环芳烃(phas)的降解分别取10ml贮备菌液接种到90ml的1%盐度无机盐培养基，用微量进样器经0.22μm微孔滤膜过滤，缓慢滴入菲（phe）、芘(pyr)、苯并[a]芘（bap）的丙酮溶液，使菲的浓度为100mg/l、芘的浓度为60mg/l、苯并[a]芘的浓度为30mg/l，并充分摇荡至丙酮挥发完全。反应体系均设三个平行样，并在30℃、180r/min条件下避光震荡培养。待第14天测定phas残余量。由图4所示，ef-b8除高效降解苯并[a]芘外，对菲、芘均有较高的降解能力。14天能将100mg/l的菲和60mg/l芘分别降解83.45%和70.80%，表明ef-b8对pahs的降解具有一定的广谱性。<110>南京工程学院<120>一种苯并[a]芘降解菌及其用法和用途以及制备所述苯并[a]芘降解菌的无机盐培养基及其制法<160>1<210>1<211>1605<212>dna<213>苯并[a]芘降解菌（ef-b8）<400>1acgacggcagtgattcgagctcggtacccggggatcctctagagatagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgcttctttcctcccgagtgcttgcactcaatcggaaagaggagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctacccatcagagggggataacacttggaaacaggtgctaataccgcataacagtttatgccgcatggcataagagtgaaaggcgctttcgggtgtcgctgatggatggacccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggccacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagagaagaacaaggacgttagtaactgaacgtcccctgacggtatctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggagagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaggaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagcaaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttggaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgaccactctagagatagagctttcccttcggggacaaagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattgttagttgccatcatttagttgggcactctagcgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggaagtacaacgagtcgctagaccgcgaggtcatgcaaatctcttaaagcttctctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtacctttttggagccagccgcctaaggtgggatagatgattggggcgaagtcgtaacaaggtaaccgtcgacctgcaggcatgcaagctggcgtaatcagtca当前第1页12