本发明涉及的是一种s-甲基-l-半胱氨酸的转化方法,尤其涉及的是一种s-甲基-l-半胱氨酸的酶法转化制备方法。
背景技术
s-甲基-l-半胱氨酸是一种非蛋白质组成的氨基酸,s-甲基-l-半胱氨酸是一种药物中间体,可作为抗氧化剂抑制蛋白质和肽的氧化,在生物组分分析中也具有一定作用。
《化学世界》,2003,7:370-372中公开了以l-半胱氨酸为原料,磷酸三甲酯为甲基化试剂合成了s-甲基-l-半胱氨酸的方法。美国专利us6147257,2000.中公开了一种以二甲基碳酸酯作甲基化试剂的方法,制备s-甲基-l-半胱氨酸步骤繁琐,反应时间长。
目前,s-甲基-l-半胱氨酸生产主要来源于化学合成法,该方法反应步骤多,操作难度大,生产成本高,不适合大规模工业化生产。而另一方面我国在氨基酸工业生产中,会产生大量不能直接用于食品和医药方面的富含l-丝氨酸的毛发酸水解液,该混合氨基酸料液直接分离制备l-丝氨酸成本高、效率低。
技术实现要素:
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供了一种s-甲基-l-半胱氨酸的酶法转化制备方法,提高反应的催化速率和转化率。
本发明是通过以下技术方案实现的,本发明包括以下步骤:
(1)将具有色氨酸合成酶活性的菌株在培养基中培养发酵,发酵液离心后得到含色氨酸合成酶的湿菌体;
(2)将上述湿菌体中加入转化液,所述转换液中包括:含l-丝氨酸的料液,磷酸吡哆醛和甲硫醇,乙醚、甲醇、乙醇、丙酮中的一种;在25~55℃,ph6~11条件下进行酶促反应,等电点结晶法分离得到s-甲基-l-半胱氨酸。
所述步骤(1)中,具有色氨酸合成酶活性的菌株选自大肠杆菌atcc15489、铜绿假单胞菌cgmccno:1.1129、施氏假单胞菌cgmccno:1.202、枯草芽孢杆菌cgmccno:1.1628中的一种。
所述步骤(1)中,培养基中的碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖中的一种或多种,培养基中总碳源质量浓度为10~40g/l;培养基中的氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、豆饼水解液中的一种或多种,培养基中总氮源质量浓度为5~35g/l。
所述步骤(2)中,所述含l-丝氨酸的料液中l-丝氨酸的浓度为0.5~40.5g/l。
所述含l-丝氨酸的料液来源于毛发酸水解液或纯l-丝氨酸液;毛发酸水解液中总氨基酸的重量百分比为5%~45%,其中l-丝氨酸在总氨基酸中的重量百分比为10%~90%。
所述步骤(2)中,所述的乙醚、甲醇、乙醇或丙酮,其浓度为0.001g/l~4.0g/l。
所述步骤(2)中,磷酸吡哆醛的浓度为0.2~0.8g/l,甲硫醇的浓度为0.22~18.5g/l。
所述步骤(2)中,等电点结晶法的具体方法如下:
将酶促反应后的转化液3000~5000r/min离心10~20min,去除菌体细胞;加热转化液,采用活性碳脱色,抽滤,滤液调至ph6~8,静置析出沉淀,真空抽滤,烘干得s-甲基-l-半胱氨酸粗品,采用乙醇洗涤,真空抽滤,烘干得s-甲基-l-半胱氨酸精品。
本发明相比现有技术具有以下优点:本发明采用含色氨酸合成酶的特定菌株,在优选的培养基中培养可以高效表达色氨酸合成酶,使酶法合成s-甲基-l-半胱氨酸有较高的催化速率和转化率,其中l-丝氨酸摩尔转化率达到95%以上;
本发明采用含l-丝氨酸的毛发酸水解液为反应原料,价格低廉,并充分利用了工业副产物,解决了混合氨基酸料液中l-丝氨酸高效分离的难题,同时也为大规模低成本生产s-甲基-l-半胱氨酸提供了更为丰富的原料,具有良好的经济效益和社会效益;
酶法合成s-甲基-l-半胱氨酸具有反应条件温和,酶立体选择性强,催化效率高,成本低,工艺流程简单等优点,适合工业化生产。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例包括以下步骤:
(1)将1000ml枯草芽孢杆菌cgmccno:1.1628在培养基中培养发酵,发酵液离心得到20g湿菌体,加入到500ml转化液中,转化液中含11g的l-丝氨酸、4.81g的甲硫醇、0.2g/l磷酸吡哆醛和0.5g/l乙醇,ph8.0,37℃酶促反应20h,反应结束后转化液中s-甲基-l-半胱氨酸为13.3g,对l-丝氨酸摩尔转化率为99%;
(2)将转化液4000r/min离心15min,去除菌体细胞,加热,活性碳脱色,抽滤,滤液调ph7左右,静置析出沉淀,真空抽滤,烘干得11.5gs-甲基-l-半胱氨酸粗品,质量浓度为95%的乙醇洗涤,真空抽滤,烘干得10.3gs-甲基-l-半胱氨酸精品,纯度为99.9%。
实施例2
本实施例包括以下步骤:
(1)将1000ml施氏假单胞菌cgmccno:1.202在培养基中培养发酵,发酵液离心得到湿菌体20g,加入到500ml转化液中,转化液中含21g的l-丝氨酸的毛发酸水解液、9.62g的甲硫醇、0.2g/l磷酸吡哆醛和0.01g/l丙酮,ph8.0,37℃酶促反应15h,反应结束后转化液中s-甲基-l-半胱氨酸为26.1g,对l-丝氨酸摩尔转化率为97%;
(2)将转化液5000r/min离心10min,去除菌体细胞,加热,活性碳脱色,抽滤,滤液调ph7左右,静置析出沉淀,真空抽滤,烘干得25.8gs-甲基-l-半胱氨酸粗品,质量浓度为95%的乙醇洗涤,真空抽滤,烘干得22.3gs-甲基-l-半胱氨酸精品,纯度为99.9%。
实施例3
本实施例包括以下步骤:
(1)将1000ml铜绿假单胞菌cgmccno:1.1129在培养基中培养发酵,发酵液离心得到15g湿菌体,加入到500ml转化液中,转化液中含11g的l-丝氨酸、4.81g甲硫醇、0.2g/l磷酸吡哆醛和0.5g/l乙醇,ph8.0,37℃酶促反应16h,反应结束后转化液中s-甲基-l-半胱氨酸为12.7g,对l-丝氨酸摩尔转化率为95%;
(2)将转化液3000r/min离心20min,去除菌体细胞,加热,活性碳脱色,抽滤,滤液调ph7左右,静置析出沉淀,真空抽滤,烘干得10.7gs-甲基-l-半胱氨酸粗品,质量浓度为95%的乙醇洗涤,真空抽滤,烘干得9.9gs-甲基-l-半胱氨酸精品,纯度为99.9%;
实施例4
本实施例包括以下步骤:
(1)将1000ml大肠杆菌atcc15489在培养基中培养发酵,发酵液离心得到12g湿菌体,加入到500ml转化液中,转化液中含21g的l-丝氨酸的毛发酸水解液、9.62g的甲硫醇、0.2g/l的磷酸吡哆醛和0.005g/l的甲醇,ph8.0,35℃酶促反应16h,反应结束后转化液中s-甲基-l-半胱氨酸为25.9g,对l-丝氨酸摩尔转化率为96%;
(2)将转化液4000r/min离心10min,去除菌体细胞,加热,活性碳脱色,抽滤,滤液调ph7左右,静置析出沉淀,真空抽滤,烘干得23.1gs-甲基-l-半胱氨酸粗品,质量浓度为95%的乙醇洗涤,真空抽滤,烘干得21.1gs-甲基-l-半胱氨酸精品,纯度为99.9%。