一种木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法与流程

本发明属于木质纤维素处理技术领域，具体涉及一种木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法。

背景技术

木质纤维素广泛存在于自然界中，是全球第四大能源物质，其资源化利用得到了世界各国的关注。木质纤维素是由纤维素、半纤维素和木质素三种组分相互联结、缠绕形成的稳固生物质，为了使木质纤维素更有利于后续资源化利用工序，首要操作是通过预处理打破木质纤维素的稳固结构，使其中的可利用碳源暴露。预处理方法包括碱法预处理、稀酸预处理、离子液体预处理、水热预处理等。这些预处理方法可以溶解和破坏木质纤维素的木质素或多糖成分，因此不可避免的会产生大量的富含碳源的预处理废液。通常这些废液被丢弃，造成大量碳源的损失和浪费，若排放到水体中还会对环境造成危害。

木质纤维素碱法预处理是应用最广泛的预处理技术之一，其作用机制是溶解破坏木质素成分。因此，碱法预处理废液中主要含有大量的木质素相关产物(碱法处理废液获得的主要成分就是木质素片段化合物)。早前已有报道pseudomonasputidakt2440等细菌可以利用碱法预处理废液中的木质素成分，并在细菌体内积累形成生物塑料前驱体——聚羟基脂肪酸酯，实现了碱法预处理废液的资源化。

然而，与碱法预处理不同，稀酸预处理主要作用于木质纤维素中的半纤维素和少量木质素成分，因此稀酸预处理废液中富含半纤维素的溶解产物(主要是木糖)，以及少量的木质素相关产物。若采用和碱法相同的细菌，则能够利用的木质素碳源含量较少，积累的产品量也不能满足要求。

若采用能够利用稀酸处理获得的半纤维素产物溶液的细菌，木质素的相关产物又会对细菌产生抑制作用，仍然难以达到理想的效果。因此，目前尚无有效的方法能够很好的对稀酸预处理废液进行资源化利用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种木质纤维素稀酸预处理废液的资源化利用的方法，具体包括采用一株芽孢杆菌直接利用木质纤维素稀酸预处理废液中的碳源，并将其转化为生物塑料——聚羟基脂肪酸酯。该方法所得生物塑料的产量高，避免了废液中可利用碳源的浪费以及对环境的污染，且兼具操作简单、反应条件温和、碳源利用率高等诸多优势。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，将保藏编号为cgmccno.15753的巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)b-10接种于木质纤维素酸法处理获得的废液中，培养后的菌体中含有聚羟基脂肪酸酯。

因为酸水解木质纤维素的半纤维素以及纤维素部分，半纤维素和纤维素为糖聚合物。因此，木质纤维素酸法处理获得的废液中主要成分是木糖为主的还原糖混合物。

木质纤维素酸法处理获得的废液需要灭菌处理。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，优选：初始接种量按照种子液占酸法处理废液体积比5-20％。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，优选：培养温度范围30-35℃。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，优选：时间范围30-60h。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，优选：转速范围120-150rpm。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，优选：在木质纤维素酸法处理产生的废液中添加供细菌代谢的无机盐。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，进一步优选添加的无机盐及浓度为(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，mgso40.2g/l，cacl20.01g/l，feso40.015g/l，mnso40.01g/l，kh2po41g/l。ph值为7.0-7.4。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，所述的木质纤维素的来源包括水稻秸秆、玉米秸秆、竹子、甘蔗渣中的一种或几种。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，优选：将木质纤维素粉碎，清洗，烘干后用于酸法处理。

进一步优选：将木质纤维素粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，所述的酸法处理使用的酸包括：硫酸、磷酸或盐酸。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，所述的酸法处理使用的硫酸的质量浓度为0.5～2％。优选0.5-1.5％。进一步优选0.5-1％。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，所述的酸法处理时木质纤维素与酸的固液比为3-8g/100ml。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，酸法处理时需要加热。优选100-121℃环境中处理。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，酸法处理时间至少15min。优选15-45min。进一步优选15-20min。

本发明酸法处理无论选择何种酸、酸的浓度、木质纤维素与酸的固液比、处理温度和时间，均是以最大程度溶出半纤维素为准。但酸浓度过高，处理时间过长等也可能使溶出的糖进一步转化为呋喃糠醛等有毒物质，进而抑制细胞的代谢并可能致死，因此可以根据实际情况选择合适的酸种类、浓度，以及固液比，处理温度和时间。

所述的木质纤维素酸法预处理废液的资源化利用方法，酸法处理得到的废液接种保藏编号为cgmccno.15753的巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)b-10，培养后，收集菌体，优选但不限于采用甲醇-氯仿法提取菌体内的聚羟基脂肪酸酯。

上述巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)分离自湖南省长沙市岳麓区岳麓山采集的新鲜土壤，命名为b-10，并于2018年5月11日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15753。

该菌株的生物学特征是：在lb固体平板培养基上菌落表面光滑，初期为浅黄色，随后逐渐变为蜡白色，边缘整齐，单个排列，会形成芽孢。能生产聚羟基脂肪酸酯。

本发明所提供的菌株巨大芽孢杆菌b-10是能利用木糖生物合成聚羟基脂肪酸脂的新菌株，为直接利用木质纤维素降解产物产聚羟基脂肪酸酯提供了可能性，为目前以木质纤维素为原料的生物合成技术以及纤维素和半纤维素的共利用提供了技术支持。

本发明提供的资源化利用的方法优势在于：

(1)对木质纤维素酸处理废液进行资源化处理，可减小废液对环境带来的污染。

(2)具有操作简单、反应条件温和、碳源利用率高等诸多优势。

(3)得到的聚羟基脂肪酸酯在可生物降解的包装材料、组织工程材料、缓释材料、电学材料以及医疗材料方面有广阔的应用前景，丰富了废弃生物质应用工艺的产品线和经济性。

本发明菌株保藏信息如下：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

保藏时间：2018年5月11日

保藏编号：cgmccno.15753。

分类命名：巨大芽孢杆菌bacillusmegaterium。

附图说明

图1为巨大芽孢杆菌b-10在lb固体培养基上的菌落特征图；

图2为聚羟基脂肪酸酯荧光显微镜图；

图3为聚羟基脂肪酸脂产品图；

图4为聚羟基脂肪酸酯的单体组成表征图；

图5为水稻秸秆酸预处理废液配成的培养基的外观图；

图6为巨大芽孢杆菌b-10处理木质纤维素酸处理废液后形成的聚羟基脂肪酸酯荧光显微镜图；

图7为巨大芽孢杆菌b-10处理木质纤维素酸处理废液后形成的聚羟基脂肪酸酯气质联用谱图；

图8为巨大芽孢杆菌b-10处理木质纤维素酸处理废液后形成的白色聚羟基脂肪酸酯数码照片图；

图9为b-10在单独含有木质素模型化合物阿魏酸、芥子酸和对香豆酸的离子培养基中，以及在木糖-离子培养基中加入阿魏酸、芥子酸和对香豆酸中的生长曲线。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非对本发明的限制。

实施例1：菌株筛选

(1)在湖南省长沙市岳麓区岳麓山脚采集的新鲜土壤样本，在样本内取5g鲜土加入10ml无菌水配成土壤溶液；取1ml土壤溶液于100ml秸秆酸处理液(含丰富糖原)配成的离子培养基中，放置温度30℃，振动频率为150rpm振荡培养箱中培养36h。

(2)对上述中的菌液，用酒精灯消毒过的接种环沾取并在lb固体培养基上划线接种，在温度为30℃的恒温培养箱中培养2d。结果在lb固体培养基中发现一种白色和一种蜡白色的菌落，黄色菌落为本发明提出的巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)b-10。

(3)用已灭菌的接种环从步骤(2)中lb固体培养基中挑取蜡白色独立的菌落，分别划线于2个lb固体培养基中，在温度35℃环境下培养2d，发现长出单一菌落。将纯化后的单菌于lb液体培养基中培养。获得菌液部分保种于-80℃冰箱内，部分保存于4℃冰箱内用于后续实验。

(4)产聚羟基脂肪酸酯液体培养基：木糖3～20g/l，(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，mgso40.2g/l，cacl20.01g/l，feso40.015g/l，mnso40.01g/l，kh2po41g/l，ph值为7.0～7.4。

实施例2：菌种鉴定

(1)将巨大芽孢杆菌培养于lb培养基中，其中lb培养基组成为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl5g/l。

(2)取培养的巨大芽孢杆菌种子液进行16srdna鉴定。

(3)步骤(2)所述的16srdna鉴定方法为：基因组dna的提取，在lb液体培养基中生长的菌体(约12～24小时)。取1μl菌液进行pcr基因扩增，pcr模板dna添加0.5μl调节到合适浓度，引物浓度为0.4μm，dntp浓度为0.2mm，dna聚合酶大约2.5u，反应总体积50μl，变性温度为94℃，退火温度为55℃，延伸温度72℃，共30个循环。pcr产物约为1.5kb左右，然后用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳进行dna的电泳检。经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，将检测合格的dna送基因平台测序。将本发明的菌株肠杆菌的16srdna序列与genbank中已登录(gb：mf614908.1)的16srdna序列进行同源比较，其16srdna序列与巨大芽孢杆菌菌属几株菌的16srdna进行比对，发现相似性高达99％，但不完全相同。结合该菌的形态学观察：该菌在lb平板培养加上菌落特点是表面光滑，蜡白色泛黄，有孢子产生，该菌应属于巨大芽孢杆菌菌属(图1)。

(4)其中步骤(3)所采用的tae：50倍tris-acetate-edta(2mtris-acetate，0.05medta，ph8.3).琼脂糖电泳凝胶：0.6g琼脂糖、1.2mltae缓冲液、59mlh2o。

实施例3：巨大芽孢杆菌利用木糖产聚羟基脂肪酸脂

(1)将保存在lb斜面的巨大芽孢杆菌接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到巨大芽孢杆菌的种子液；其中所述lb液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l；所述lb斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；

(2)将上一步所得到的巨大芽孢杆菌种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(3)将收集的巨大芽孢杆菌菌体按离心前菌液占培养基20％(体积比)接种量，接种于木糖无菌培养基中，30℃，150rpm，培养48h，收集菌体。其中木糖无菌培养基组成：木糖5g/l，(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，mgso40.2g/l，cacl20.01g/l，feso40.015g/l，mnso40.01g/l，kh2po41g/l，ph值为7.0～7.4。

通过本实施例的实施，收集2ml样品，12000rpm离心5min，弃上清液，并将细胞重新悬浮于150μl的去离子水和50μl的二甲基亚砜中。将5μl的尼罗红染料(0.15mg/ml)加入悬浮液中染色30min。然后用荧光显微镜进行观察，结果如附图2所示，证实在细菌细胞中形成了聚羟基脂肪酸酯的内含体。并得到聚羟基脂肪酸酯(图3)0.883g/l，通过该实施例得到的聚羟基脂肪酸酯转化率具有明显优势。

实施例4：巨大芽孢杆菌利用木糖产聚羟基脂肪酸脂

(1)将保存在lb斜面的巨大芽孢杆菌接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到巨大芽孢杆菌的种子液；其中所述lb液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l；所述lb斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；

(2)将上一步所得到的巨大芽孢杆菌种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(3)将收集的巨大芽孢杆菌菌体按离心前菌液占培养基20％(体积比)接种量，接种于木糖无菌培养基中，35℃，120rpm，培养60h，收集菌体。其中木糖无菌培养基组成：木糖10g/l，(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，mgso40.2g/l，cacl20.01g/l，feso40.015g/l，mnso40.01g/l，kh2po41g/l，ph值为7.0～7.4。

通过本实施例的实施，得到的聚羟基脂肪酸酯1.333g/l，通过该实施例得到的聚羟基脂肪酸酯转化率具有明显优势。

实施例5：巨大芽孢杆菌利用木糖产聚羟基脂肪酸脂

(1)将保存在lb斜面的巨大芽孢杆菌接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到巨大芽孢杆菌的种子液；其中所述lb液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l；所述lb斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；

(2)将上一步所得到的巨大芽孢杆菌种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(3)将收集的巨大芽孢杆菌菌体按离心前菌液占培养基20％(体积比)接种量，接种于木糖无菌培养基中，30℃，150rpm，培养60h，收集菌体。其中木糖无菌培养基组成：木糖15g/l，(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，mgso40.2g/l，cacl20.01g/l，feso40.015g/l，mnso40.01g/l，kh2po41g/l，ph值为7.0～7.4。

通过本实施例的实施，得到的聚羟基脂肪酸酯1.906mg/l，通过该实施例得到的聚羟基脂肪酸酯转化率具有明显优势。

实施例6：聚羟基脂肪酸酯鉴定

(1)挑取单菌落接种于上述装有实施例3的50ml的培养基250ml摇瓶，30～35℃培养时间大约36小时，取100ml菌液，12000rpm，4℃离心10min，弃上清液，沉淀菌体液在n2快速冷却并保存在-80℃冰箱一晚，再冷冻干燥。

(2)将上述冻干的菌体收集到螺口瓶加入1.7ml甲醇，0.3ml98％浓h2so4，稍微震荡后加入2ml氯仿，拧紧螺口瓶，涡旋30秒，震荡3-10分钟，100℃下热解140分钟。

(3)将上述样品冷却到室温后加入1ml去离子水，涡旋震荡5-10分钟，再3000rpm离心5分钟，分离水相和有机相。抽取下层有机相过0.45μm有机滤头，进行gc-ms检测。

(4)上述步骤(3)所述的gc-ms检测方法：使用gcqp2010ms(shimadzu，kyoto，japan)和hp-5msui柱(30m，0.32mmid，0.25μmdf)柱箱温度50℃，进样口温度275℃，维持时间20分钟，总运行时间30分钟，检测器温度250℃，汽化室温度240℃。经鉴定产物为3-羟基丁酸和2-羟基丁酸(是构成聚羟基脂肪酸酯的单体)，气相图谱与质谱图为图4所示。

实施例7巨大芽孢杆菌利用木质纤维素稀酸处理液产聚羟基脂肪酸脂

(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。

(2)将水稻秸秆按固液比5g/100ml加入浓度为0.5％的稀硫酸溶液中，静置于121℃恒温环境中40min，过滤分离，获得酸处理废液。

(3)将保存在lb斜面的巨大芽孢杆菌b-10接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到巨大芽孢杆菌的种子液；其中所述lb液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l；所述lb斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；

(4)将上一步所得到的巨大芽孢杆菌种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(5)将收集的巨大芽孢杆菌菌体按离心前菌液占培养基10％(体积比)接种量，接种于含酸处理废液的无菌培养基中，30℃培养48h，收集菌体。其中含酸处理废液的无菌培养基是在含酸处理废液中添加无机盐，无机盐种类和浓度为(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，mgso40.2g/l，cacl20.01g/l，feso40.015g/l，mnso40.01g/l，kh2po41g/l，ph值为7.0～7.4。

(6)将收集到的菌体采用甲醇-氯仿法提取菌体内积累的聚羟基脂肪酸酯。

通过本实施例的实施，酸处理废液中总糖的去除率达到59.59％。收集2ml样品，12000rpm离心5min，弃上清液，并将细胞重新悬浮于150μl的去离子水和50μl的二甲基亚砜中。将5μl的尼罗红染料(0.15mg/ml)加入悬浮液中染色30min。然后用荧光显微镜进行观察，结果附图6所示，证实在细菌细胞中形成了聚羟基脂肪酸酯的内含体。采用甲醇-氯仿法提取菌体内积累的聚羟基脂肪酸酯，得到聚羟基脂肪酸酯(如附图7)1.493g/l，采用气相色谱与质谱联用仪器测定得到该聚羟基脂肪酸酯为3-羟基丁酸(3hb)和2-羟基丁酸(2hb)的共聚物，通过该实施例得到的聚羟基脂肪酸酯转化率具有明显优势。

甲醇-氯仿法的具体操作如下：取菌液到离心管，1200rpm，4℃低温离心10分钟，取出上清液，保留菌体放入-80℃冰箱，遇冷后冷冻干燥24h，取出干燥粉末加入1ml三氯甲烷，剧烈搅拌后再加入三氯甲烷至7ml，放入摇床60℃，150rpm过夜。过夜后取出加入2ml水混合5min，再2500rpm离心分层。分层后取出下层有机相过0.45μm滤膜后n2到1ml，加入预冷的10倍体积的甲醇混合30min溶出聚羟基脂肪酸酯，离心后干燥，得到聚羟基脂肪酸酯纯物质。

实施例8巨大芽孢杆菌利用木质纤维素稀酸处理液产聚羟基脂肪酸脂

(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。

(2)将水稻秸秆按固液比5g/100ml加入浓度为0.5％的稀硫酸溶液中，静置于121℃恒温环境中20min，过滤分离，获得酸处理废液。

(3)将保存在lb斜面的巨大芽孢杆菌b-10接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到巨大芽孢杆菌的种子液；其中所述lb液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l；所述lb斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；

(4)将上一步所得到的巨大芽孢杆菌种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(5)将收集的巨大芽孢杆菌菌体按离心前菌液占培养基20％(体积比)接种量，接种于含酸处理废液的无菌培养基中，30℃培养36h，收集菌体。其中含酸处理废液的无菌培养基是在含酸处理废液中添加无机盐，添加的无机盐及浓度为(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，mgso40.2g/l，cacl20.01g/l，feso40.015g/l，mnso40.01g/l，kh2po41g/l，ph值为7.0～7.4。

(6)将收集到的菌体采用甲醇-氯仿法提取菌体内积累的聚羟基脂肪酸酯。

通过本实施例的实施，酸处理废液中总糖的去除率达到61.62％。得到的聚羟基脂肪酸酯1.395g/l，通过该实施例得到的聚羟基脂肪酸酯转化率具有明显优势。

实施例9巨大芽孢杆菌利用木质纤维素稀酸处理液产聚羟基脂肪酸脂

(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。

(2)将水稻秸秆按固液比3g/100ml加入浓度为1％的稀硫酸溶液中，静置于121℃恒温环境中20min，过滤分离，获得酸处理废液。

(3)将保存在lb斜面的巨大芽孢杆菌b-10接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到巨大芽孢杆菌的种子液；其中所述lb液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l；所述lb斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；

(4)将上一步所得到的巨大芽孢杆菌种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(5)将收集的巨大芽孢杆菌菌体按离心前菌液占培养基20％(体积比)接种量，接种于含酸处理废液的无菌培养基中，30℃培养48h，收集菌体。其中含酸处理废液的无菌培养基是在含酸处理废液中添加无机盐，添加的无机盐及浓度为(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，mgso40.2g/l，cacl20.01g/l，feso40.015g/l，mnso40.01g/l，kh2po41g/l，ph值为7.0～7.4。

(6)将收集到的菌体采用甲醇-氯仿法提取菌体内积累的聚羟基脂肪酸酯。

通过本实施例的实施，酸处理废液中总糖的去除率达到57.32％，得到聚羟基脂肪酸酯0.933g/l。酸处理的固液比、时间、酸浓度都影响半纤维素的溶出，该实施例的固液比小，同样100ml的酸液只有3g生物质，溶出的糖少，产量就相应较其他实施例降低。

实施例10：模型化合物培养实验

(1)从固体培养基上用接种环挑取单菌落到20ml的lb培养基中进行活化，活化好的b-10接入100mllb培养基放入温度30℃、转速120rpm的摇床培养，等待后续实验使用。

(2)配置木糖-离子培养基：木糖0.2g/l，(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，mgso40.2g/l，cacl20.01g/l，feso40.015g/l，mnso40.01g/l，kh2po41g/l，ph值为7.0～7.4；配置离子培养基：(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，mgso40.2g/l，cacl20.01g/l，feso40.015g/l，mnso40.01g/l，kh2po41g/l，ph值为7.0～7.4；

(3)在上一步配置的木糖-离子培养基中分别加入木质素模型化合物阿魏酸、芥子酸和对香豆酸，浓度为100mg/l。将培养好的b-10菌液离心收集菌体后分别加入含有模型化合物的木糖-离子培养基中，30℃培养48小时，分别在0、6、12、24、36、48小时记录od600值，并绘制生长曲线。

(4)在离子培养基中分别加入木质素模型化合物阿魏酸、芥子酸和对香豆酸，浓度为100mg/l。将培养好的b-10菌液离心收集菌体后分别加入含有模型化合物的离子培养基中，培养48小时，分别在0、6、12、24、36、48小时记录od600值，并绘制生长曲线。

(5)生长曲线如图9所示，b-10在单独含有木质素模型化合物阿魏酸、芥子酸和对香豆酸的离子培养基中没有表现出生长行为，而在木糖-离子培养基中加入阿魏酸、芥子酸和对香豆酸b-10能够保持生长趋势及代谢能力。

实施例11：巨大芽孢杆菌利用葡萄糖产聚羟基脂肪酸脂

(1)将保存在lb斜面的巨大芽孢杆菌接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到巨大芽孢杆菌的种子液；其中所述lb液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l；所述lb斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；

(2)将上一步所得到的巨大芽孢杆菌种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(3)将收集的巨大芽孢杆菌菌体按离心前菌液占培养基20％(体积比)接种量，接种于葡萄糖无菌培养基中，35℃，120rpm，培养36h，收集菌体。其中葡萄糖无菌培养基组成：葡萄糖10g/l，(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，mgso40.2g/l，cacl20.01g/l，feso40.015g/l，mnso40.01g/l，kh2po41g/l，ph值为7.0～7.4。

通过本实施例的实施，收集2ml样品，12000rpm离心5min，弃上清液，并将细胞重新悬浮于150μl的去离子水和50μl的二甲基亚砜中。将5μl的尼罗红染料(0.15mg/ml)加入悬浮液中染色30min。然后用荧光显微镜进行观察。观察到细菌体内有聚羟基脂肪酸酯的积累，证明其对葡萄糖也同样具有转化能力。

对比例1

(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。

(2)将水稻秸秆按固液比5g/100ml加入浓度为2％的稀硫酸溶液中，静置于121℃恒温环境中60min，过滤分离，获得酸处理废液。

(3)将保存在lb斜面的巨大芽孢杆菌接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到巨大芽孢杆菌的种子液；其中所述lb液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l；所述lb斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；

(4)将上一步所得到的巨大芽孢杆菌种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(5)将收集的巨大芽孢杆菌菌体按离心前菌液占培养基20％(体积比)接种量，接种于含酸处理废液的无菌培养基中，30℃培养12h，收集菌体。其中其中含酸处理废液的无菌培养基是在含酸处理废液中添加无机盐，添加的无机盐及浓度为(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，mgso40.2g/l，cacl20.01g/l，feso40.015g/l，mnso40.01g/l，kh2po41g/l，ph值为7.0～7.4。

通过本对比例的实施，酸处理废液中总糖的去除率仅为2.5％，且巨大芽孢杆菌体内不能积累聚羟基脂肪酸酯。该对比例中酸处理的强度较高，处理时间较长，以至于溶出的糖进一步转化为呋喃糠醛等有毒物质抑制了细胞的代谢并可能致死。

对比例2

(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。

(2)将水稻秸秆按固液比1g/100ml加入浓度为2％的稀硫酸溶液中，静置于121℃恒温环境中40min，过滤分离，获得酸处理废液。

(3)将保存在lb斜面的巨大芽孢杆菌接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到巨大芽孢杆菌的种子液；其中所述lb液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l；所述lb斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；

(4)将上一步所得到的巨大芽孢杆菌种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(5)将收集的巨大芽孢杆菌菌体按离心前菌液占培养基20％(体积比)接种量，接种于含酸处理废液的无菌培养基中，30℃培养60h，收集菌体。其中其中含酸处理废液的无菌培养基是在含酸处理废液中添加无机盐，添加的无机盐及浓度为(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，mgso40.2g/l，cacl20.01g/l，feso40.015g/l，mnso40.01g/l，kh2po41g/l，ph值为7.0～7.4。

通过本对比例的实施，酸处理废液中总糖的去除率仅为0.94％，且巨大芽孢杆菌体内不能积累聚羟基脂肪酸酯。由于该对比例中酸处理的强度较高，木质纤维素处理量少，以至于溶出的糖进一步转化为呋喃糠醛等有毒物质抑制了细胞的代谢并可能致死。

对比例3

本对比例即本发明所涉及资源化方法与专利(申请号：200510133634.5)进行对比。

专利(申请号：200510133634.5)公开了一种重组的产聚羟基脂肪酸酯菌gbr008及其表达载体，重组代尔夫菌在氧缺乏的条件下，换算得到该菌利用葡萄糖产聚羟基脂肪酸酯的产量为0.991g/l。相对于该专利的方法，本发明所资源化方法有如下优势：(1)本发明中所采用的巨大芽孢杆菌不需经过基因改造，大大降低该工艺的投资成本。(2)本发明中所采用的资源化方法得到的聚羟基脂肪酸酯产量高，转化率具有明显优势(3)本发明所采用的碳源为废弃的木质纤维素酸处理液。相比于葡萄糖，废弃的木质纤维素酸处理液成分复杂，处理难度高，转化难度高。同时，废弃木质纤维素酸处理液为底物，可大大降低该工艺的投资成本。