一种用于预防和治疗肠致病大肠杆菌感染的肽段的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于预防和治疗肠致病大肠杆菌感染的肽段。

背景技术：

目前对于肠致病性大肠杆菌的治疗均采用广谱抗生素治疗，无特异性针对该类细菌的抑制剂。采用抗生素治疗，容易产生耐药性，使耐药变异菌在人体内聚集，给以后的感染治疗带来困难。

肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenice.coli，epec)是引起全球婴幼儿腹泻和成人散发性腹泻的重要病原菌之一，目前研究表明epec主要通过黏附和脱落损伤(attachingandeffacinginjury,a/einjury，即a/e损伤)导致肠粘膜损伤。肠致病性大肠埃希菌epec感染的特点是病原菌能本能性粘附到宿主细胞膜，破坏细胞微绒毛，并在粘附细菌下诱导由细胞支架蛋白形成杯样基底膜，这种现象称之为“粘附与脱落损伤”。epec的粘附与脱落效应特征是依赖espb、espd和espa转运蛋白构成了对宿主细胞的紧密粘附，并在粘附细胞下清除细胞微绒毛，积累纤维肌动蛋白。espb蛋白可与espd蛋白相互作用而插入宿主细胞膜形成微孔，使得epec毒力因子可通过细胞膜上形成的微孔直接进入宿主细胞，入侵的毒力因子促使细菌粘附与抹平效应的形成。espb缺失的突变epec不能介导临近粘附细胞微绒毛的延伸，也不能阻止巨噬细胞的吞噬作用。由于espb蛋白是肠致病性大肠杆菌致病的关键蛋白，若能找到能抑制epec的致病作用的物质，将为epec治疗寻找新的策略，为未来预防和治疗epec做出重大贡献。

技术实现要素：

针对以上技术问题，本发明公开了一种用于预防和治疗肠致病大肠杆菌感染的肽段，证实能抑制epec的致病作用，可靶向性阻断epec的致病性，为研发预防和治疗epec的药物奠定了基础。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种用于预防和治疗肠致病大肠杆菌感染的肽段，其包括seqidno：1、seqidno：2，seqidno：3或seqidno：4的氨基酸序列。

本发明还提供了编码包含如上所述肽段的多肽的核酸分子。

本发明还提供了含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

本发明还提供了一种包含所述用于预防和治疗肠致病大肠杆菌感染的肽段的多肽的组合物。

进一步优选的，所述组合物还包含杀细菌剂。

进一步优选的，所述组合物还包含为实现杀细菌之外的功能与作用而添加的非多肽的成分。

本发明还提供了如上所述的多肽、如上所述的核酸分子或如上所述的组合物在制备药物中的用途，用于杀灭或抑制肠致病性大肠埃希菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

采用本发明的技术方案，包含所述用于预防和治疗肠致病大肠杆菌感染的肽段的多肽与espb蛋白的亲和力高于对照蛋白，且体外研究显示，用于预防和治疗肠致病大肠杆菌感染的多肽能够抑制epec与hep-2细胞的粘附，阻断espb的功能，从而减少epec对上皮细胞的吸附，为epec治疗提供了新的方向，为研发预防和治疗epec的药物奠定了基础。

附图说明

图1为本发明采用westernblot方法检测espb蛋白表达图。图中，a为构建的pet21b-espb表达质粒转染到大肠埃希菌后的表达情况图，鼠抗人6-组氨酸单克隆抗体为主要抗体，1为espb表达载体转染的细菌裂解产物，2为培养上清表达重组espb蛋白，1及2分别显示了espb表达载体转染的细菌裂解产物及培养上清表达重组espb蛋白情况。b为纯化的espb蛋白表达图。

图2为本发明12种筛选出来的阳性噬菌体及vcsm13对照与espb及6-组氨酸短肽亲和力大小用elisa方法的鉴定图，每个实验均重复3次以上，取其均数作为最终分析数据。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的技术方案作进一步的详细说明。

1.体外表达espb蛋白；

从e2348/69(o127：h6)菌株扩增espb片段，应用标准分子学方法将此基因片段插入pet21b表达载体bamhi和ecori位点，从而构建一个含有6个(his)组氨酸残端的pet21b-espb表达载体。通过向培养基中加入iptg诱导pet21b-espb表达载体转染的重组大肠埃希菌表达espb蛋白。加入1mm的iptg后离心收集细胞，应用qiagen公司a缓冲液悬浮细胞，所述a缓冲液为a缓冲液生产的20mmtris,500mmnacl，ph9。声波裂解法裂解细胞后将细胞悬液进行离心，收集上清用于ni²⁺-交换膜(qiagen公司)过滤。含有his标记的espb蛋白被洗脱液(qiagen公司)洗脱下来，应用鼠抗his单克隆抗体westernblot方法分析收集蛋白。bradford方法(bio-rad，hercules，ca，usa)定量收集溶液中重组his-espb蛋白浓度，之后储藏在-70℃的冰箱中。

2.espb特异性结合蛋白的筛选

应用12-mer随机库(newenglandbiolabs，ipswich，ma，usa)采用噬菌体m13上-筛选出espb特异性结合蛋白。将150μl混有10μg/mlespb蛋白及0.1m碳酸氢钠的溶液加入无菌聚苯乙烯有盖培养皿中，反复震荡直至培养皿表面完全湿润。包被有espb蛋白的培养皿用小牛蛋白血清去阻断后用0.05％pbst缓冲液洗涤。取10μl用pbst稀释的原液加入培养基，常温下孵育2h。包被的培养皿用用0.05％pbst洗涤后，剩下的粘附噬菌体被洗脱下来用于扩增。经过三轮扩增后，洗脱液在er2738培养基中得到扩增，用聚乙二醇沉淀纯化并按照试剂使用说明书定量。

3.elisa法筛选阳性噬菌体

用espb蛋白及对照6-组氨酸肽隔夜包被96孔板，阻断缓冲液阻断，每孔加入10¹⁴pfu的噬菌体克隆或对照样本，常温下孵育1h；加入辣根过氧化物酶标记的m13，常温下孵育1h；加入50μl/孔的联苯胺；20min后加入50μl/孔的2mh2so4终止反应；检测样本在450nm波长处的吸光度(a)值。如果样本的a值高于对照噬菌体及肽2倍以上，考虑目标蛋白与espb蛋白有较高的亲和力。

4.dna测序及肽链合成

根据newenglandbiolabs，ipswich，ma，usa试剂操作说明书12-mer随机库扩增阳性噬菌体中dna片段，并送sanger测序；之后应用bioedit序列比对编辑软件分析dna序列。目标肽链由sigma–aldrich公司合成，其纯度大于98％。6个组氨酸的c短添加到gly-gly-gly-ser空间结构上作为阴性对照。

5.细胞活性试验

hep-2细胞以2×10³/孔的密度接种到96孔培养板，过夜贴壁后换成含1％小牛血清的dmem培养基培养24小时，再用一系列梯度稀释的短肽孵育48小时。用mtt染色法分析细胞活性，490纳米处吸光值代表相对活性细胞数。

6.hep-2细胞抑制试验

参照infectimmun.2006；74(12):6920-8；jagricfoodchem.2013；61(11):2748-54.jfoodprot.2008；71(11):2272-7介绍的方法采用epece2348/69菌株进行抑制试验。试验之前，用4ml无糖胰蛋白酶培养基孵育epec菌株，之后用5％小牛血清的dmem培养液及1％sdmem培养液洗涤。将斜披培养皿上生长的epec细胞接种到新鲜的1％sdmem培养基，局部吸附。hep-2细胞悬浮在含10％小牛血清的gibco培养液中，以5×10⁴/孔细胞密度接种到24孔培养板中。向每10⁷细胞加入一系列浓度分别为10,50,100,and200μg/ml的短肽；阴性对照组则加入浓度为200μg/ml的6组氨酸寡肽。培养板在37℃co2孵箱中孵育30分钟，之后用pbs缓冲液清洗去除未贴壁细胞。培养皿用甲醇固定10分钟，干燥，采用giemsa法染色20分钟，之后以放大倍数为100×的对比显微镜下观察。在这种放大倍数下可以至少观察到100个连续hep-2。一个细胞若包含4个或4个以上epec菌认为是局部吸附阳性细胞，具备其表型特点；每连续的100个细胞中局部吸附细胞比例代表吸附率。每次试验均重复三次以上，并采用下面的公式计算减速比。

减速比＝(阴性对照组均数-实验组均数)/阳性对照组。

7.统计学分析

采用软件graphpadprismv5.01用来分析研究数据。两组之间的差异用t检验。多组间比较采用单因素方差分析。p<0.05认为是差异显著。

8.实验结果

如图1所示，构建的pet21b-espb表达质粒转染到大肠埃希菌后成功的表达了espb蛋白，并应用westernblot方法验证蛋白表达和纯化蛋白，验证结果如图2所示，由图2可见，在37kd处有一条明亮的条带，espb蛋白得到高表达。

对espb蛋白结合噬菌体进行富集实验，结果详见表1所示。由表1可见，ph.d.12蛋氨酸噬菌体展示技术用于筛选espb特异性结合蛋白，三轮亲和力选择试验结果表明能特异性结合espb蛋白的噬菌体均出现了富集现象，初步筛选出12个克隆与espb蛋白可能具有结合作用。

表1espb蛋白结合噬菌体富集实验结果

对12种筛选出来的阳性噬菌体及vcsm13对照与espb及6-组氨酸短肽亲和力大小用elisa方法鉴定，每个实验均重复3次以上，取其均数作为最终分析数据，结果如图2所示，由图2可见，每个噬菌体克隆均单独与espb蛋白孵育。

采用elisa方法分析筛选出对espb蛋白高亲和力的噬菌体peptide-6、peptide-7、peptide-8和peptide-12。依据sanger测序结果这四个肽段序列分别为：

peptide-6:yfpyshtsprqp；(如seqidno：1)

peptide-7:aykytsalpaea；(如seqidno：2)

peptide-8:sltlmnsplgas；(如seqidno：3)

peptide-12:mltlslnptnsa；(如seqidno：4)

对peptide-6、peptide-7、peptide-8和peptide-12分别进行mtt试验，mtt试验数据显示如表2所示。由表2可见，peptide-6、peptide-7、peptide-8和peptide-12对hep-2细胞均无明显毒性，且研究结果表明，随着浓度的增加，peptide-6可显著减少epec对hep-2细胞的吸附比例，当其浓度为100μg/ml时，与对照组相比，epec对hep-2吸附比例下降了40％。

表2多肽对epec粘附hep-2细胞的影响体外研究

采用本实施例的技术方案，我们采用了噬菌体显示技术寻找espb蛋白特异性结合多肽，3轮富集实验筛选了12种短肽，采用elisa方法鉴定出4条与espb具有较好的亲和力，这些多肽可用于治疗epec感染。

epec分泌的espa、espb和espd蛋白可在宿主细胞膜上形成针尖样微孔结构，我们可以选择espb特异结合蛋白，通过结合espb蛋白，阻断针尖样微孔的形成，从而抑制epec对宿主细胞的吸附。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。