一种PKS-NRPS杂合的大环内酯类化合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及用真菌hdn13-430(simplicilliumlamellicolahdn13-430)(保藏编号是:cgmcc13873保藏日期：2017年6月8日保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101)生产pks-nrps杂合的大环内酯类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在预防和治疗高血脂及相关并发症中的用途。

背景技术：

本发明人从真菌hdn13-430(simplicilliumlamellicolahdn13-430)液体发酵产物中分离出多个pks-nrps杂合的大环内脂类化合物。研究发现所示大环内酯类生物碱化合物具有显著的降脂活性，表明上述大环内酯类化合物具有进一步开发成新型降血脂药物的潜力。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种结构新颖的具有抑制脂肪代谢活性的新化合物。其结构式是

式ⅰ。

本发明的式ⅰ化合物可通过微生物发酵培养来获取含有该类化合物的发酵物，然后对发酵粗提物采用sephadexlh20凝胶柱层析、中压mplc和半制备hplc等方法分离纯化得到。

本发明的下述实施例中列举了利用真菌hdn13-430(simplicilliumlamellicolahdn13-430)制备本发明式ⅰ化合物的实例。

附图说明：

化合物ⅰ对油酸诱发的细胞内脂质积累的影响。图1是在不同药物浓度下hepg2细胞活力图；图2是通过358nm处的油红o染色测定脂质积累图；图3是化合物ⅰ对肝癌hepg2细胞总胆固醇（tc）调节图；图4化合物ⅰ对肝癌hepg2细胞总甘油三酯（tg）调节活性图。柱状图描绘了至少三次实验的平均值±sem。^##p<0.01，油酸组与空白组比较;*p<0.05，**p<0.01，试验组与油酸组比较。

具体实施方式：

在如下的实施例中所指的化合物ⅰ的化学结构(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)是：

化合物ⅰ

实施例1化合物ⅰ的发酵生产及分离精制。

1发酵生产

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取真菌hdn13-430(simplicilliumlamellicolahdn13-430)适量，接种到pda固体斜面培养基上，在28℃培养箱中培养7天，取斜面培养7天的真菌hdn13-430(simplicilliumlamellicolahdn13-430)适量，接种到装有300ml培养基[培养基组成（克/升）：麦芽糖20.0，葡萄糖10.0，甘露醇20.0，味精10.0，酵母膏3.0，玉米浆1.0，kh2po40.5，mgso4·7h2o0.3，ph调节至6.5]的1000ml锥型瓶中，在20℃条件下静置培养30天，获得发酵产物。

2浸膏的获得

发酵液用纱布将上清液和菌丝体分离。将菌丝体用丙酮处理三次，减压浓缩至无丙酮，所得水相用等量乙酸乙酯萃取三次。发酵液直接用等量乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩，得粗浸膏，共7.5克。

3化合物的分离精制

浸膏（7.5克）用甲醇溶解后，以甲醇为流动相进行lh20柱层析，分为5个流份。组分2先以甲醇-水为流动相进行c-18ods中压柱层析，梯度洗脱后再经反相半制备高效液相色谱（甲醇：水=70:30）得化合物ⅰ（15mg），化合物ⅰ为白色固体,分子式c25h32n2o5,hr-esi-msm/z441.2390[m+h]⁺,计算值441.2384)；ir(kbr)νmax3470,3040,2968,2932,1710,1596,1450,1381,1378,775cm^-1;¹hand¹³cnmr见表1。

表1化合物ⅰ的¹h和¹³cnmr数据（500和125mhz，incdcl3）^a

a)本表信号归属基于dept、hmqc及hmbc图谱解析结果。碳信号的多重度利用dept方法确定并分别用s（单重峰）、d（二重峰）、t（三重峰）和q（四重峰）、m（多重峰）表示。

b)此栏中的数字和代号分别代表在¹h-¹hcosy谱中与相应行中的¹h给出偶合相关信号的¹h核。

c)此栏中的数字和代号分别代表在hmbc谱中与相应行中的¹h给出偶合相关信号的¹³c核。

实施例2化合物的脂质调节作用活性测试。

1实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物ⅰ纯品。精密称取适量样品，用dmso配制成所需浓度的溶液，供给脂代谢活性使用。

细胞系及细胞的继代培养细胞系及细胞的继代培养，采用肝癌hepg2细胞株。用含10%胎牛血清的dmem培养基，并加入100μg/ml的青霉素和链霉素，在37℃、5%co2培养箱中继代培养。

脂质调节作用活性测试方法。

取对数生长期细胞，消化、计数，以适宜浓度接种到已放入无菌盖玻片的6孔板中，培养24小时至细胞完全贴壁。细胞生长汇合至70%-80%时，用100μm不饱和脂肪酸-油酸（oa）刺激细胞制成脂质堆积模型；给药组同时给予不同浓度的样品(1μmol/l)；阳性药实验组给药辛伐他汀（1μmol/l）。除空白组外，其它实验组需添加油酸100mmol/l共孵育24小时，24小时后，弃去培养基，用pbs洗2遍，加4%多聚甲醛在4℃固定12小时。每孔加油红o工作液20微升，室温染色15分钟，pbs洗净油红工作液，每孔加dmso150微升溶解附着脂质上染料，酶标仪358nm波长下测定od值。

细胞内总胆固醇（tc）测量

弃去培养液，用pbs洗2遍，收集细胞于管中；加200微升氯仿：异丙醇：np40（7：11：0.1）混合溶液，超声裂解细胞；13000转/分钟离心15分钟，取上清液于新管中50℃烘1小时，以除去氯仿；将样品放于真空浓缩离心机中抽干，除去剩余有机溶剂。试剂盒测定样品中tc含量，样品加200微升assaybuffer溶解，具体操作见cholesterol/cholesterylesterquantitationkit（biovision）说明书。bca试剂盒测定样品中蛋白含量。

细胞内总甘油三酯（tg）含量测定

收集细胞，加300微升5%np-40超声破碎细胞；将样品放到80-100℃水浴中缓慢加热2至5分钟至样品变浑浊，冷却至室温，重复3次。12000转/分钟离心2分钟，取上清液于新管中，加适量去离子水稀释样品。试剂盒测定样品中tg含量，具体操作按triglyceridequantificationkit（biovision）说明书进行。bca试剂盒测定样品蛋白含量。

2实验结果

用不饱和脂肪酸建立脂质堆积模型对所示化合物ⅰ降脂活性进行了研究，以辛伐他汀为阳性对照药，结果发现所述化合物ⅰ对细胞内的总胆固醇（tc）和总甘油三酯（tg）均具有明显降低作用。活性结果见附图。

3结论

化合物ⅰ活性筛选结果显示具有较好的降脂活性，可作为新型降血脂剂，用于预防和治疗高血脂及相关并发症。