一种兔圆小囊抗菌肽及其制备方法与流程

本发明涉及生物医药
技术领域：
，具体涉及一种兔圆小囊抗菌肽及其制备方法。
背景技术：
：对于目前存在抗生素使用过多，不合理等现象，导致诸多细菌产生了严重耐药性和耐受性，甚至出现细菌变异。为缓解对抗生素的依赖，减少对抗生素的使用，诸多医学界开始研究提取天然的抗菌物质。兔圆小囊为兔子特有的器官，集消化、免疫和神经内分泌为一体，位于回肠末端，是兔重要的肠相关淋巴组织，在兔圆小囊组织中发现有大量抗菌肽类物质分布。通过对圆小囊的组织液进行分离提纯的低分子粗提取物，对致病性大肠杆菌等具有抑菌作用，并且不会产生耐药性。目前，从兔圆小囊组织中提取抗菌肽主要是将兔圆小囊匀浆后隔水煮沸，再加入等体积乙酸在4℃下过夜浸提，离心得到上清液，调节ph值至7.0后再次离心取上清，即为抗菌肽粗提物；将所得抗菌肽粗提物以sephadexg100凝胶过滤柱纯化，即可得到兔圆小囊抗菌肽(王可洲，佘锐萍.兔圆小囊组织中抗菌肽类物质的分离纯化及抗菌活性研究[j].科学技术与工程，2003，3(2):151-154.)。现有的兔圆小囊抗菌肽制备方法较为复杂，采用凝胶过滤柱等方式进行纯化成本较高并且无法适宜大规模工业化生产。技术实现要素：有鉴于此，本发明为了解决现有的兔圆小囊抗菌肽制备方法较为复杂、成本较高的问题，提供了一种兔圆小囊抗菌肽的制备方法，操作简单，可有效缩短提取时间、提高提取效果，纯化成本低，更适宜大规模工业化生产。为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种兔圆小囊抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：(1)将兔圆小囊匀浆，将所得兔圆小囊匀浆液与乙酸溶液混合，2～5℃下浸提12～14h，得到浸提液；(2)将浸提液反复冻融4～6次，得到冻融液；(3)将冻融液依次进行多层过滤、微滤和超滤，得到超滤液；(4)调节超滤液的ph值为6.5～7.2，即得兔圆小囊抗菌肽。优选的，所述步骤(1)中，乙酸溶液的体积浓度为2～3％。优选的，所述步骤(1)中，兔圆小囊匀浆液与乙酸溶液的体积比为1:1.5～2。优选的，所述步骤(2)中，将浸提液分装后再进行冻融。优选的，步骤(2)所述冻融中，以液氮进行冰冻，在20～25℃下进行解冻。优选的，步骤(3)所述多层过滤中，所用过滤网密度在200～500目之间。优选的，所述微滤采用0.22～0.45μm规格的滤网进行；所述超滤采用6～8kd规格的滤网进行。优选的，所述微滤和超滤采用立式套筒过滤方式。优选的，所述步骤(3)中，多层过滤之前，将冻融液在45～55℃加热3～5min。本发明还提供了上述技术方案所述方法制备得到的兔圆小囊抗菌肽，所述抗菌肽的多肽含量≥1.0mg/ml，刺激指数不低于1.10。本发明提供了一种兔圆小囊抗菌肽的制备方法，将兔圆小囊匀浆，将所得兔圆小囊匀浆液与乙酸溶液混合，2～5℃下浸提12～14h，得到浸提液；将浸提液反复冻融4～6次，得到冻融液；将冻融液依次进行多层过滤、微滤和超滤，得到超滤液；调节超滤液的ph值为6.5～7.2，即得兔圆小囊抗菌肽。本发明所述制备方法所得兔圆小囊抗菌肽中多肽含量达到1.0mg/ml以上刺激指数均在1.10以上，即所述抗菌肽的纯度较高，从微滤到成品所需的提取时间大大减少，仅需3～4h。本发明提供的兔圆小囊抗菌肽制备方法采用依次进行多层过滤、为了和超滤的方式进行纯化，替代常规方法中的凝胶分离柱纯化的方式，不但能够简化操作、降低对操作人员专业化程度的要求，同时也能够降低成本，更有利于兔圆小囊抗菌肽的大规模工业化生产。在本发明的一些优选技术方案中，采用对浸提液分装后再反复冻融。分装体积越小则冻融时间越快，从而进一步缩短提取时间；分装能够缩短熔融时间，冻融速度越快则有利于提高兔圆小囊中的多肽被提取，提高冻融液中的游离多肽含量，进而提高最终得到的兔圆小囊抗菌肽浓度，提高提取率。在本发明的一些优选技术方案中，优选的先将冻融液在45～55℃下加热3～5min，再依次进行多次过滤、微滤和超滤。本发明对冻融液进行加热有利于粗蛋白等杂质的沉淀，提高分离效率，进而提高所得兔圆小囊抗菌肽的纯度。附图说明图1为单罐多层气压过滤机的结构示意图；图2为装有0.22μm滤芯的立式过滤套筒；图3为装有6kd超滤芯的立式过滤套筒；图4为本发明所述兔圆小囊抗菌肽对大肠杆菌的抑菌效果图。具体实施方式本发明提供了一种兔圆小囊抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：(1)将兔圆小囊匀浆，将所得兔圆小囊匀浆液与乙酸溶液混合，2～5℃下浸提12～14h，得到浸提液；(2)将浸提液反复冻融4～6次，得到冻融液；(3)将冻融液依次进行多层过滤、微滤和超滤，得到超滤液；(4)调节超滤液的ph值为6.5～7.2，即得兔圆小囊抗菌肽。本发明将兔圆小囊匀浆，将所得兔圆小囊匀浆液与乙酸溶液混合，2～5℃下浸提12～14h，得到浸提液。本发明得到的浸提液中包含液体部分和固体部分，不进行固液分离。本发明在对兔圆小囊匀浆前，优选的将兔圆小囊进行清洗和捣碎。在本发明中，所述清洗优选的依次采用纯水和注射用水清洗，以去除兔圆小囊中的脂肪、浆膜等杂质；本发明优选的，纯水洗涤3～5次，更优选为4次；本发明优选的，注射用水洗涤1～3次，更优选为2次。在本发明中，所述捣碎优选的采用捣碎机进行，捣碎的目的是为了更便于匀浆。本发明对所述兔圆小囊的来源无特殊限定，优选的采用新鲜的兔圆小囊作为制备原料；本发明所述新鲜的兔圆小囊是指离体不超过5h的兔圆小囊。在本发明中，本发明优选的采用捣碎机捣碎，所述捣碎转速优选为7000～10000r/min，更优选为8000r/min。在本发明中，所述匀浆优选的以匀浆机进行。在本发明中，所述乙酸溶液的体积浓度优选为2～3％，更优选为2.5％。在本发明中，当所述乙酸溶液的体积浓度为2～3％时，所述兔圆小囊匀浆液与乙酸溶液的体积比优选为1:1.5～2，更优选为1:1.75。乙酸溶液在本发明中作为提取溶液，酸性环境下有利于提高多肽的提取率。在本发明中，所述浸提温度优选为4℃，所述浸提时间优选为12.5～13h。低温下浸提更有利于兔圆小囊中的抗菌肽物质分离。得到浸提液后，本发明将所述浸提液反复冻融4～6次，得到冻融液本发明将圆小囊浸提液反复冻融是为了进一步使细胞破碎，反复冻融4～6次能提高细胞破碎程度，使小分子的圆小囊抗菌肽更多的渗出，以提高圆小囊的提取率，优选的进行分装。在本发明中，所述反复冻融次数优选为6次。在本发明中，所述反复冻融中，冰冻至浸提液冻实，解冻则以浸提液处于无冰状态为止。在本发明中，冰冻温度独立的优选为-20℃以下，更优选为-35～-30℃。本发明优选地采用液氮进行冰冻，液氮冰冻的速度更快，有利于提高细胞破碎程度。在本发明中，解冻温度优选为20～25℃，解冻方式包括但不限于微波解冻或水浴解冻等。利用液氮速冻能够进一步破坏细胞结构，提高抗菌肽中的多肽含量。为了进一步缩短冻融时间，提高提取效率，本发明优选的将浸提液分装再进行反复冻融；优选的，所述用于分装浸提液的容器容量为500～1000ml。在本发明中，所述用于分装浸提液的容器材质优选为塑料。本发明试验表明，采用500～1000ml的容器分装浸提液后再进行反复冻融，单次冰冻时间仅需要2.7～4.5h，单次解冻时间仅需1～1.5h；而浸提液不进行分装时，单次冰冻时间则需要6h，单次解冻时间则需要2h。分装体积越小则冻融时间越快，提高冻融速度更有利于提高兔圆小囊抗菌肽中的多肽含量。得到冻融液后，本发明将冻融液依次进行多层过滤、微滤和超滤，得到超滤液。本发明优选的在冻融液进行多层过滤前，对冻融液进行加热，所述加热温度优选为45～55℃，更优选为50℃；所述加热时间优选为3～5min，更优选为4min。本发明将冻融液加热有利于粗蛋白等杂质的沉淀，便于分离。在本发明中，所述多层过滤是指采用两层以上的滤网进行过滤；优选的，所述多层过滤时采用的滤网密度在200～500目之间。在本发明中，所述多层过滤优选为双层过滤，更优选的，所述双层过滤采用的滤网依次为200目和300目。本发明对浸提液进行双层过滤主要是为了去除脂肪颗粒等漂浮物。在本发明中，所述多层过滤优选的采用本发明自制的单罐多层气压过滤机进行，所述所述单罐多层气压过滤机如图1所示：1为罐体，2为压力表，3为阀门，4为高压空气入口，7为分离液收集罐；5和6代表多层过滤网，当进行2层以上过滤时可以增加过滤网的数量，在图1中为双层过滤时装入的200目过滤网5和300目过滤网6。本发明所述过滤网材质优选为不锈钢。本发明采用所述单罐多层气压过滤机进行多层过滤时，将待过滤的液体装入到罐体1中，打开阀门3，通过高压空气入口4向罐体内通入压缩空气以提高罐体内压力。罐体1内的待过滤液体受到压力压迫从上到下依次通过200目过滤网5和300目过滤网6(若为多层过滤则依次通过逐渐增大的多层过滤网)，所得分离液流入下方分离液收集罐7中。采用本发明提供的单罐多层气压过滤机进行多层过滤能够有效提高过滤速度，减少多层过滤时间，更为经济。在本发明中，所述微滤优选的以0.22～0.45μm规格的滤网过滤。在本发明中，所述微滤优选的采用立式过滤套筒进行过滤。在本发明中，所述超滤优选的以6～8kd规格的超滤装置进行；优选的，所述超滤采用立式过滤套筒进行超滤具体的如图2所示，装有0.22μm滤芯的立式过滤套筒，2为压力表，3为进口阀，9为排气阀，10为0.22μm规格的滤芯，11为排液阀。本发明优选的利用如图2所示的立式过滤套筒对分离液和壳聚糖的混合液进行微滤，分离液和壳聚糖的混合液进入如图2所示的立式过滤套筒进行微滤，当收集的透过液体积为原体积的2/3～3/4时停止收集，所得透过液即为微滤液。在本发明中，所述超滤优选的以6kd规格的超滤膜进行超滤。在在本发明中，所述超滤优选的采用立式过滤套筒进行超滤。具体的如图3所示，装有6kd超滤芯的立式过滤套筒，2为压力表，3为进口阀，9为排气阀，13为6kd规格的超滤芯，11为排液阀。本发明优选的利用如图3所示的立式过滤套筒对微滤液进行超滤，微滤液进入如图3所示的立式过滤套筒进行超滤，当收集的透过液体积为原体积的4/5～5/6时，对超滤截留物进行恒体积透析，所述恒体积透析至透析液体积达到超滤截留体积0.5～1倍时停止，合并透过液即得超滤液。本发明采用立式过滤套筒过滤方式，能够进一步提高纯化效率。本发明采用多层过滤、微滤、超滤逐级过滤的方式，方便从小试优化、中试放大到生成规模化转化，为研发到投产、再到扩大生产提供方便，有利于降低产品的研发成本，实现兔圆小囊抗菌肽提取的规模化、标准化生产。本发明依次采用0.22μm、6kd立式过滤套筒进行过滤，截留体积小，便于清洗。得到超滤液后，本发明将超滤液的ph值调节至6.5～7.2，即得兔圆小囊抗菌肽。本发明对超滤液的ph值进行调节是为了避免乙酸干扰兔圆小囊抗菌肽的抗菌作用。在本发明中，调节所述超滤液的ph值前还包括过滤除菌步骤。本发明优选的采用过滤除菌方式，所述过滤除菌优选的采用0.22μm规格的微孔滤膜。本发明所述兔圆小囊抗菌肽的制备方法能够有效缩短制备时间，简化操作步骤，降低成本，更适宜工业化应用。本发明还提供了一种上述技术方案所述方法制备得到的兔圆小囊抗菌肽，所述抗菌肽的多肽含量≥1.0mg/ml，刺激指数不低于1.10。本发明制备的兔圆小囊抗菌肽对大肠杆菌等微生物具有较好的抑制作用。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围实施例11)清洗步骤：将新鲜收集的兔圆小囊1.5kg，去除脂肪、浆膜，用纯水清洗5次，灭菌注射用水清洗2次，沥干得处理后兔圆小囊1.2kg。2)捣碎匀浆步骤：将处理后1.2kg的圆小囊用捣碎机捣碎，经胶体磨匀浆，得到匀浆液1.1kg。3)酸化浸提步骤：将匀浆液与体积浓度为3％的乙酸灭菌注射用水溶液按体积比1:2混合，边搅拌，80r/min，在4℃冷库中浸提12h，得到浸提液3.3kg。4)分装步骤：将浸提液分装于500ml的塑料瓶，共七瓶。5)液氮冰冻步骤：将分装完成的七瓶料液即刻置于液氮中冻存，规定时间24h。6)恒温水浴解冻：将冻实的七瓶料液置于恒温水浴锅中解冻，设定温度25℃，并反复冻融5次进行细胞破碎。7)蒸煮步骤：将纯水倒入双蒸锅夹层中，将冻融完成的料液倒入双蒸锅沸水浴，边搅拌边加热，升温到设定保温范围停止升温，按照设定保温时间进行保温，设定温度45℃，规定时间5min，得到料液3.2kg。8)固液分离步骤：将蒸煮完成的料液倒入单罐气压多层过滤机中，得到过滤液2l。9)微滤步骤：将过滤液采用立式套筒专用的0.22um滤芯进行微滤，收集澄清液1.5l。10)超滤步骤：将澄清液用立式套筒专用的8kd滤芯进行超滤，得到兔圆小囊抗菌肽粗制品1.25l。11)除菌步骤：将兔圆小囊抗菌肽粗制品采用氢氧化钠调ph值为6.53经0.22um除菌滤器除菌即兔圆小囊抗菌肽1.2l。12)本试验按照《中国药典》附录“蛋白质含量测定法”中“福林酚法(lowry法)”所得兔圆小囊抗菌肽含量为1.25mg/ml，参考现行《中国药典》通则中细胞增殖法/mtt比色法进行测定刺激指数(si)为1.18。所述《中国药典》附录“蛋白质含量测定法”中“福林酚法(lowry法)”测定兔圆小囊抗菌肽中多肽含量具体步骤如下：精密量取牛血清白蛋白对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5min，置冷水浴10min，按照紫外-可见分光光度法(现行《中国药典》通则)，在650nm波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程，相关系数不低于0.995。另精密量取待检样品溶液1.0ml，自“再分别加入碱性铜试液1.0ml”起，同法测定吸光度，根据吸光度从线性回归方程中求得待检样品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，求出兔圆小囊抗菌肽半成品或成品多肽含量。所述参考现行《中国药典》通则中细胞增殖法/mtt比色法测定兔圆小囊抗菌肽的刺激指数(si)具体步骤如下：1试剂1.1试剂配制(1)rpmi1640培养液取rpmi1640培养液(规格为1l)，加青霉素105iu和链霉素105iu，混匀，除菌过滤，4℃保存。(2)完全培养液量取新生牛血清10ml，加rpmi1640培养液至100ml，4℃保存。(3)维持培养液量取新生牛血清5ml，加rpmi1640培养液至100ml，4℃保存。(4)pbs精密称取氯化钠8.000g、氯化钾0.200g、磷酸氢二钠1.440g、磷酸二氢钾0.240g，加水溶解并稀释至1000ml，灭菌。(5)噻唑蓝(mtt)溶液精密称取mtt粉末0.100g，加pbs20ml使溶解，除菌过滤。4℃避光保存。(6)待检样品溶液的制备取兔圆小囊抗菌肽成品，用维持培养液配制成每1.0ml含多肽200μg，4℃保存。2检查法2.1猪脾淋巴细胞悬液的制备取新鲜猪脾脏，放置75％酒精中消毒后用pbs清洗数次，去除表面层组织后剪碎，加入pbs液研磨后经100目筛过滤，用适量pbs液洗涤细胞，1500r/min离心5min，弃去上清液，洗涤三次。用适量pbs液重悬沉淀细胞，将此溶液加入已含有分离液的离心管中，以2000r/min离心20min，小心吸出中间层的淋巴细胞，放入另一离心管中，加适量pbs液洗涤三次，再用适量的完全培养液重悬沉淀细胞，台盼蓝染色，镜检计数(细胞存活率＞95％)，用维持培养液将细胞浓度调节至1.0×106/ml。2.2兔圆小囊抗菌肽成品对猪脾淋巴细胞的增殖活性测定将猪脾淋巴细胞悬液，铺板于96孔细胞培养板，分别设试验组和对照组，每组5孔，每孔100μl，完成铺板的细胞培养板，1000r/min离心6min，小心吸弃25μl试验组培养上清液，再加入25μl待检样品溶液，于37℃、5％二氧化碳条件下培养44h。2.3检测各组每孔分别加入mtt溶液10μl，于37℃、5％co2条件下培养4h，2000r/min离心10min，小心吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜100μl，放置小型振荡器震匀10min后，放置于酶标仪，以630nm为参比波长，550nm为测定波长，测定吸光度，并记录吸光度a550nm。3结果判定按下列公式计算刺激指数(si)：试验样品溶液刺激指数(si)＝试验孔吸光度均值a550nm/对照孔吸光度均值a550nm。以刺激指数(si)作为兔圆小囊抗菌肽成品的效力指标，刺激指数应不低于1.10。当si≥1.10判定待检样品合格；当si＜1.10判定待检样品不合格。实施例21)清洗步骤：将新鲜收集的兔圆小囊1.4kg，去除脂肪、浆膜，用纯水清洗4次，灭菌注射用水清洗2次，沥干得处理后兔圆小囊1.1kg。2)捣碎匀浆步骤：将处理后1.1kg的圆小囊用捣碎机捣碎，经胶体磨匀浆，得到匀浆液1.0kg。3)酸化浸提步骤：将匀浆液与体积浓度为2％的乙酸灭菌注射用水溶液按体积比1:2混合，边搅拌，70r/min，在4℃冷库中浸提12h，得到浸提液3kg。4)分装步骤：将浸提液分装于1000ml的塑料瓶，共3瓶。5)液氮冰冻步骤：将分装完成的3瓶料液即刻置于液氮中冻存。6)恒温水浴解冻：将冻实的3瓶料液置于恒温水浴锅中解冻，设定温度25℃，并反复冻融6次进行细胞破碎。7)蒸煮步骤：将纯水倒入双蒸锅夹层中，将冻融完成的料液倒入双蒸锅沸水浴，边搅拌边加热，升温到设定保温范围停止升温，按照设定保温时间进行保温，设定温度50℃，规定时间3min，得到料液2.8kg。8)固液分离步骤：将蒸煮完成的料液倒入单罐气压多层过滤机中，得到过滤液1.7l。9)微滤步骤：将过滤液采用立式套筒专用的0.22um滤芯进行微滤微滤，收集澄清液1.3l。10)超滤步骤：将澄清液用立式套筒专用的8kd滤芯进行超滤，得到兔圆小囊抗菌肽粗制品1.18l。11)除菌步骤：将兔圆小囊抗菌肽粗制品采用氢氧化钠调ph值为7经0.22um除菌滤器除菌即兔圆小囊抗菌肽1.1l。12)本试验按照《中国药典》附录“蛋白质含量测定法”中“福林酚法(lowry法)”所得兔圆小囊抗菌肽中的多肽含量为1.19mg/ml，参考现行《中国药典》通则中细胞增殖法/mtt比色法进行测定刺激指数(si)为1.15。实施例31)清洗步骤：将新鲜收集的兔圆小囊1.6kg，去除脂肪、浆膜，用纯水清洗5次，灭菌注射用水清洗2次，沥干得处理后兔圆小囊1.3kg。2)捣碎匀浆步骤：将处理后1.3kg的圆小囊用捣碎机捣碎，经胶体磨匀浆，得到匀浆液1.2kg。3)酸化浸提步骤：将匀浆液与体积浓度为2.5％的乙酸灭菌注射用水溶液按体积比1:1.75混合，边搅拌，60r/min，在4℃冷库中浸提12h，得到浸提液2kg。4)分装步骤：将浸提液分装于1000ml的塑料瓶，共2瓶。5)液氮冰冻步骤：将分装完成的2瓶料液即刻置于液氮中冻存。6)恒温水浴解冻：将冻实的七瓶料液置于恒温水浴锅中解冻，设定温度25℃，并反复冻融6次进行细胞破碎。7)蒸煮步骤：将纯水倒入双蒸锅夹层中，将冻融完成的料液倒入双蒸锅沸水浴，边搅拌边加热，升温到设定保温范围停止升温，按照设定保温时间进行保温，设定温度55℃，规定时间3min，得到料液1.9kg。8)固液分离步骤：将蒸煮完成的料液倒入单罐气压多层过滤机中，得到过滤液1.2l。9)微滤步骤：将过滤液采用立式套筒专用的0.22um滤芯进行微滤，收集澄清液0.9l。10)超滤步骤：将澄清液用立式套筒专用的8kd滤芯进行超滤，得到兔圆小囊抗菌肽粗制品0.83l。11)除菌步骤：将兔圆小囊抗菌肽粗制品采用氢氧化钠调ph值为6.80经0.22um除菌滤器除菌即兔圆小囊抗菌肽0.8l。12)本试验按照《中国药典》附录“蛋白质含量测定法”中“福林酚法(lowry法)”所得兔圆小囊抗菌肽中的多肽含量为1.26mg/ml，参考现行《中国药典》通则中细胞增殖法/mtt比色法进行测定刺激指数(si)为1.19。实施例4兔圆小囊抗菌肽对大肠杆菌的抑制作用配制普通肉汤培养基；配制含有108cfu/ml的大肠杆菌菌悬液；配制80万单位的庆大霉素；将实施例1制备得到的兔圆小囊抗菌肽以注射用水稀释为1mg/ml浓度。分别按照下述分组配制成不同菌悬液：第一组：取普通肉汤培养基3ml、108cfu/ml的大肠杆菌菌悬液0.5ml以及1mg/ml的兔圆小囊抗菌肽1ml，得到试验组溶液，记为大h3；第二组：取普通肉汤培养基3ml、108cfu/ml的大肠杆菌菌悬液0.5ml以及80万单位的庆大霉素1ml，得到对照组溶液，记为大a4；第三组：取普通肉汤培养基4ml与108cfu/ml的大肠杆菌菌悬液0.5ml混合，得到空白组溶液，记为大h5。将三组得到的溶液在37℃下恒温培养18h，观察溶液混浊情况，结果如图4所示。由图4可以看出，大h5表示未添加抑菌物质的空白组，其中的大肠杆菌大量繁殖，溶液呈混浊状。大h3和大a4中的溶液均呈现澄清，表明庆大霉素与本发明制备得到的兔圆小囊抗菌肽均对大肠杆菌具有抑制作用，兔圆小囊抗菌肽可以作为抗生素的替代品，还能避免明显的耐药性。实施例5本次试验验证分装容量对冻融时间的影响。(1)按照实施例1中步骤1)～3)制备得到浸提液6l，均分为3组，每组2l。将2l浸提液分别分装于500ml、1000ml和2000ml的塑料瓶中，分别得到4瓶(三组)、2瓶(二组)和1瓶(一组)。(2)将上述得到的各瓶浸提液置于液氮中冰冻，记录单次冰冻时间；将冻实的各瓶浸提液分别置于25℃下恒温水浴解冻，记录单次解冻时间。共进行6次冻融。如表1所示，一组采用2000ml容量的塑料瓶，也就是未对浸提液进行分装，其单次冰冻时间为6h，单次解冻时间为2h，6次反复冻融共耗时48h。而二组采用1000ml容量的塑料瓶对浸提液进行分装，其单次冰冻时间为4.5h，单次解冻时间为1.5h，6次反复冻融共耗时36h。三组采用500ml容量的塑料瓶将浸提液分装为4瓶，单次冰冻时间为2.7h，单次解冻时间为1h，6次反复冻融共耗时22.2h。可以看出，随着分装体积减小，单次冻融时间也随之缩短，表明本发明将浸提液进行分装能够缩短反复冻融时间，实现速冻速溶。表1不同分装体积对冻融时间的影响实施例6本次试验验证分装浸提液对于兔圆小囊抗菌肽成品中多肽含量的影响。取实施例5中三个组别反复冻融得到的冻融液，分别按照实施例1步骤7)～11)制备兔圆小囊抗菌肽。按照《中国药典》附录“蛋白质含量测定法”中“福林酚法(lowry法)”对制得的兔圆小囊抗菌肽中多肽含量进行测定，结果如表2所示。表2不同分装体积对成品中多肽含量的影响分装体积/ml50010002000多肽mg/ml1.241.181.09由表2可以看出，不分装(2000ml分装体积)时制备的兔圆小囊抗菌肽中多肽含量低于分装后的(分装体积50ml、1000ml)。分装后的冻融时间缩短，通过速冻速溶更有利于兔圆小囊抗菌肽中多肽含量的提升。实施例7本次试验验证分装对兔圆小囊成品的刺激指数(si)的影响。取实施例6中制备得到的各组兔圆小囊抗菌肽成品，按照现行《中国药典》通则中细胞增殖法/mtt比色法进行测定刺激指数(si)。结果如表3所示：表3不同分装体积对兔圆小囊抗菌肽的刺激指数影响分装体积ml规定刺激指数(si)实测刺激指数(si)结果500si≥1.10si≥1.19合格1000si≥1.10si≥1.17合格2000si≥1.10si≥1.12合格结果显示，3组不同冻融的分装体积料液中的兔圆小囊肽成品对猪淋巴细胞的刺激指数(si)均大于1.10，符合规定，而对猪淋巴细胞的刺激指数越高说明圆小囊肽的效力就越好，纯度也就越高，抗菌多肽小分子的完整性越好。综上所述，可以看出本发明提供的兔圆小囊抗菌肽制备方法操作简单，对制备时的人员专业性要求低，更适宜大规模工业化生产。本发明所述制备方法得到的兔圆小囊抗菌肽得率高、所需制备时间短，对大肠杆菌等微生物有良好的抑制作用。本发明所述方法还能够通过对浸提液的分装进一步提高所得兔圆小囊抗菌肽的纯度、效力，并且进一步缩短制备时间。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12