一种线性肽合成方法与流程

本发明属于线性肽合成
技术领域：
，具体涉及一种由l型，d型氨基酸组成的具备了穿透细胞膜能力，抗肿瘤活性的线性肽。
背景技术：
：nc_hlhr_d1自然杂志(doi:10.1038/nature19791)记载，具有明显的热，酶稳定性。无生物活性。自然界中，野生型多肽稳定性差。全新设计多肽稀缺，生物活性难以控制，穿透细胞膜能力差。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种线性肽合成方法，本发明的有益效果是在保持原本稳定性的基础上，显著提高生物活性，具备穿透细胞膜能力，抗肿瘤活性。本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：步骤1：将2-chlorotritylchloride树脂用二氯甲烷、n，n-二甲基甲酰胺进行活化，后遵循固相合成方法得到直链肽p*llywrclqlrrrpraerkcrrrrrn；步骤2：使用三氟乙酸、水、苯酚和三异丙基硅烷的混合溶液对树脂进行切割，旋蒸除去三氟乙酸，加入冰乙醚，有白色固体析出，离心后的固体加水溶解，使用冻干机对其冻干，得到固体粉末；步骤3：构建其中的一对二硫键，7位，20位半胱氨酸选用的巯基保护基为三苯甲基。进一步，步骤1中用1：1的二氯甲烷、n，n-二甲基甲酰胺对树脂进行活化。进一步，步骤3中三氟乙酸：水：苯酚：三异丙基硅烷＝88：5：5：2。进一步，步骤4中对7位20位的二硫键进行构建：采用空气氧化法，取50mg的固体粉末，以0.2mg/ml的浓度溶解在150ml0.2m碳酸氢铵水溶液中，于250ml茄形瓶，电磁搅拌，室温条件下反应48h，使用冻干机得到白色固体粉末。附图说明图1是合成方法示意图；图2是uprol-10e与mdm2的大分子相互作用数据图；图3是uprol-10e对肿瘤细胞hct116p53+/+作用的柱状图；nutlin-3为阳性对照，uprol，uprol-4e为阴性对照。图4是uprol-10e体外血清稳定性实验，经过4小时的酶解，还有50％的保留量，证明稳定性好图5是uprol-10e标记荧光基团后，进入细胞核的情况。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。本发明技术方案如图1所示的合成路线：1、uprol-10e的合成：选用2-chlorotritylchloride树脂，用1：1的二氯甲烷、n，n-二甲基甲酰胺对树脂进行活化，后遵循固相合成方法得到直链肽p*llywrclqlrrrpraerkcrrrrrn，其中的11个氨基酸采用d型氨基酸，15个氨基酸采用l型氨基酸。通过修改序列，设计出全新线性结构，不仅保留其稳定性，还具备了穿透细胞膜能力，抗肿瘤活性。nc_hlhr_d1序列为pelqrkckeldtrpeaerkcreesdn。(小写字母为d型氨基酸缩写，大写字母为l型氨基酸)改造后uprol-10e的序列为p*llywrclqlrrrpraerkcrrrrrn。p*为合成非天然氨基酸。2、随后使用三氟乙酸(tfa)：水：苯酚：三异丙基硅烷＝88：5：5：2的20ml混合溶液对树脂进行切割，旋蒸除去三氟乙酸，加入冰乙醚，有白色固体析出，离心后的固体加水溶解，使用冻干机对其冻干，得到固体粉末。3、然后开始构建其中的一对二硫键，7位，20位半胱氨酸选用的巯基保护基为三苯甲基(trt)。对7位20位的二硫键进行构建：trt保护基在切割过程中被同时脱去，因此采用空气氧化法，取50mg的固体粉末，以0.2mg/ml的浓度溶入150ml0.2m碳酸氢铵水溶液，250ml茄形瓶，电磁搅拌，室温条件下反应48h，反应结束后进行hplc分离分析，同时辅以esi-ms检测，收集目标峰后，使用冻干机得到白色固体粉末。实验方法：借助arrayit，spotbot3针点平台中的spotbot3microarrayer控制软件将化合物至于生物芯片graft-to-pcl表面，紫外光交联15min将化合物交联于芯片表面。蛋白的初始浓度为0.1-100μm。用pbs缓冲液，按照一定的比例进行稀释，配置不同浓度的蛋白进样检测。得到的数据根据plexerasprdateanalysismodule(dam)分析软件进行数据分析与拟合，获得结合动力学常数。缓冲液(buffer)：1×pbs重生液：gly-hcl(ph＝2)进样流速1μl/s，进样时间180s；解离流速1μl/s，进样时间200s；重生流速2μl/s，重生时间200s。图2是uprol-10e与mdm2的大分子相互作用数据图；图3是uprol-10e对肿瘤细胞hct116p53+/+作用的柱状图；其中nutlin-3为阳性对照，uprol，uprol-4e为阴性对照。图4是uprol-10e体外血清稳定性实验，经过4小时的酶解，还有50％的保留量，证明稳定性好。图5是uprol-10e标记荧光基团后，进入细胞核的情况。表1是uprol-10e与mdm2蛋白结合动力学常数。表1sampleska(1/ms)kd(1/s)kd(m)uprol-10e-mdm25.19e46.38e-51.23e-9uprol-10e与p53的竞争性地与肿瘤细胞内的mdm2结合。起到抗肿瘤的作用。p53为肿瘤抑制蛋白(也称为p53蛋白或p53肿瘤蛋白)，属于最早发现的肿瘤抑制基因(或抑癌基因)之一。p53蛋白能调节细胞周期和避免细胞癌变发生。因此，p53蛋白被称为基因组守护者。总而言之，其角色为保持基因组的稳定性，避免突变发生。mdm2是一种人类中由mdm2基因编码的蛋白质。mdm2是p53肿瘤抑制因子的重要负调节因子。mdm2蛋白起到e3泛素连接酶的作用，其识别p53肿瘤抑制因子的n-末端反式激活结构域(tad)和p53转录激活的抑制剂。uprol-10e作为线性肽，合成产量大，合成难度小。uprol-10e的kd达到1.23e-9，说明与mdm2有强结合力。本发明的优点还在于：uprol-10e仍保持着与nc_hlhr_d1相当的稳定性而其还具备了透膜能力，针对p53的抗肿瘤活性。以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。当前第1页12