本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种鸡安卡拉病lamp引物组、试剂盒及其检测方法。
背景技术：
心包积水综合征(hydropericardiumsyndrome,hps)又称鸡安卡拉病，病原为鸡腺病毒(fowladenovirus,fadv)，属于无囊膜的线性单分子双股dna病毒。fadv血清型众多，分别为血清型1～7，8a，8b，9～11共12种，不同血清型会导致不同程度的包涵体肝炎。其中血清4型强毒株对雏鸡的致病能力较强，是导致hps发生的主要原因。腺病毒科(adenoviridae)分五个属，禽腺病毒属(adenovirus)是其中之一，禽腺病毒属又分为禽腺病毒a～e、鹅腺病毒a、隼腺病毒a、及火鸡腺病毒b共8个种。fadv-4和fadv-10同属于禽腺病毒c。
fadv呈世界性分布，1987年在安卡拉镇首次发生了鸡安卡拉病，1989年也报道了在墨西哥该病的发生，随后在印度、伊拉克、秘鲁、智利、厄瓜多尔、俄罗斯等地该病陆续的暴发。2015年6月以来，我国多数省份也发生了此类症状。该病的临床症状为发病鸡常表现为食欲不振、贫血、粗乱的羽毛、鸡冠颜色变浅、嗜睡发生率增高等，死亡率高达30％-90％，造成巨大的影响和经济损失。发病鸡主要表现为精神沉郁、羽毛逆立、排黄色稀粪，突然倒地后两腿划空，数分钟内死亡，剖检可见心包积有淡黄色透明的渗出液；肝脏肿胀、充血、质地变脆，色泽变暗，并出现坏死；肾苍白或暗黄色。
2000年日本的科学家notomi等人发明了一种新的核酸扩增技术环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)，lamp的特征是针对目标dna链上的6个区段设计4条不同的引物(fip,bip,f3,b3)，在链置换bstdna聚合酶的作用下于恒温60℃-65℃扩增60min左右，即可进行循环扩增，且效率可达109-1010个数量级。lamp反应具有较高的专一性，只有4条引物在靶基因中的6个不同区域完全匹配才能进行扩增。lamp反应产物的检测手段多种多样，有琼脂糖凝胶电泳检测、限制性酶切鉴定、白色沉淀肉眼观察法、实时浊度定量检测、钙黄绿素做荧光指示、sybrgreeni染色观察方法和核酸试纸条检测等。
技术实现要素：
本发明旨在提供提供一种简便快捷，对fadv灵敏、特异的lamp引物组。
本发明所采取的技术方案是：
一种鸡安卡拉病lamp引物组，包括引物fip、bip、f3、b3、lf和lb，各引物的序列如seqid№1～6所示。
上述引物组可应用于鸡安卡拉病lamp检测试剂盒。
所述鸡安卡拉病lamp检测试剂盒，具有lamp反应体系，包括：
2×反应液rm12.5μl，内引物fip、bip40μmol/l各1.0μl，外引物f3、b35μmol/l各1.0μl，bstdna聚合酶1.0μl，荧光染料ⅰ0.5μl。
本发明还公开了使用上述鸡安卡拉病lamp检测试剂盒的检测方法，包括步骤：
1)提取dna模板；
2)将lamp反应体系与2.0μl的dna模板混合，补水至25μl，然后加入20.0μl的石蜡油；
3)通过real-timepcrsystem设定反应条件63℃，30s，1个循环；60s，40个循环；每次循环结束时收集荧光信号。
其中，步骤1)所述dna模板的260/280比值为1.8～2.0，浓度在200～500ng/μl；步骤2)的lamp反应体系所使用的荧光染料为fam。
本发明公开了一种鸡安卡拉病lamp引物组、试剂盒及其检测方法。其引物组根据genbank中公布的fadv-4的核苷酸序列而设计，依托于lamp技术，该方法可使反应时间相比taqman法可缩短20min以上，为快速检测提供了技术支持，而且无需额外购置专用实验仪器或耗材，适配度高，可根据具体使用环境进行挑选。
附图说明
图1是所述鸡安卡拉病lamp检测试剂盒特异性试验结果图，图中fadv-1、fadv-2、fadv-10、阴性对照、鸡新城疫传染性支气管炎二联活疫苗的曲线重叠；
图2是所述鸡安卡拉病lamp检测试剂盒灵敏度试验结果图，图中标号1～9分别表示浓度为101至109的9个模板；
图3是实施例4第一次稳定性试验结果；
图4是实施例4第二次稳定性试验结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1，鸡安卡拉病lamp检测试剂盒，包括：
lamp引物组的引物和探针如下所示：
使用上述鸡安卡拉病lamp检测试剂盒的检测方法，包括步骤：
1)取fadv-4合成质粒稀释1000倍作为dna模板；
2)将lamp反应体系与2.0μl的dna模板混合，补水至25μl，然后加入20.0μl的石蜡油；
3)通过real-timepcrsystem设定反应条件63℃，30s，1个循环；60s，40个循环；每次循环结束时收集荧光信号。
其中，步骤1)所述dna模板的260/280比值为1.8～2.0，浓度在200～500ng/μl；步骤2)的lamp反应体系所使用的荧光染料为fam。
实施例2，lamp特异性试验
根据fadv-1、fadv-2、fadv-4、fadv-10的fiber基因全序列合成质粒；鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗，提取其rna并反转录成cdna后进行试验。将上述质粒和毒株反转录产物使用按实施例1的试剂盒进行检测。结果如图1所示，fadv-4被成功扩增，出现了明显的扩增曲线，而其它均未出现扩增曲线。
实施例3，lamp灵敏度试验
将fadv-4合成质粒为阳性标准品。用紫外分光光度计测定质粒浓度，根据阿伏伽德罗常数换算为目的基因的拷贝数，以10倍梯度由109拷贝/μl稀释至101拷贝/μl，对梯度稀释的阳性对照进行lamp反应检测。对阳性标准品以101为单位进行倍比稀释，将得到的浓度为109至101的9个模板使用上述反应体系和反应条件进行扩增，以验证该检测方法的灵敏度。结果如图2所示，在102拷贝级仍出现扩增曲线，时间≤20min，可检测到的最低稀释倍数为102拷贝/μl。
实施例4，lamp稳定性试验：
取fadv-4合成质粒稀释1000倍作为dna模板，分别进行两次试验，对获得的ct值进行分析，结果如图3和4所示，显示每组中20个重复样品结果均在9min左右时出现扩增曲线，且两组试验结果基本重合，重复性良好。
sequencelisting
<110>珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>一种鸡安卡拉病lamp引物组、试剂盒及其检测方法
<130>2018
<160>6
<170>patentinversion3.5
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