本发明涉及分子生物学dna标记技术与应用领域，具体涉及一种是通过dna标记技术构建等位基因图谱来快速准确鉴定蓝莓品种及其近缘种。
背景技术：
蓝莓(blueberry)原产于北美洲，是杜鹃花科(ericaceae)越橘属(vaccinium)植物。由于其果实具有很高的营养价值，自20世纪初期被驯化栽培以来，已在世界范围内被广泛种植。我国从1983年开始蓝莓的引种栽培，随着栽培技术不断提高，蓝莓产业发展迅猛，形成了东北地区、山东半岛、长江流域和云贵高原等4个主产区。
蓝莓分为栽培种和野生种，根据树体大小和需冷量的多少，蓝莓栽培种又可划分为北高丛蓝莓、南高丛蓝莓、半高丛蓝莓、矮丛蓝莓和兔眼蓝莓5个类型，每一种类型又包括了大量育成品种。目前全世界已报道的蓝莓品种有数百个，中国主栽的蓝莓品种几乎全部引自国外，且当前中国蓝莓产业中利用的品种主要有10余个。蓝莓的野生种广泛分布在我国西南和东北地区，野生种是选育蓝莓新品种的重要种质资源。蓝莓品种的正确识别和亲缘关系分析是蓝莓产业健康发展、科学开发及合理利用的重要前提，但我国蓝莓引种途径多，品种信息管理混乱；在生产过程中存在品种名音译、意译和自拟商品名同时存在的现象，导致种苗混乱，常出现以假乱真或以次充好的现象，使得蓝莓种植企业和种植户遭受重大经济损失。
传统的品种鉴别是基于蓝莓叶、花、果实和树姿进行的，这要求鉴定者有着丰富的蓝莓生产实践经验和扎实的植物分类学知识，而蓝莓的表型性状受栽培环境影响较大，导致这种鉴别方法准确度很低，鉴别错误的情况常常出现。蓝莓基因组dna是不受生长地点、地形、气候条件以及植株大小的稳定存在，因蓝莓种苗的主要繁育方式为组织培养和扦插，同一蓝莓品种的不同单株属于无性系，其基因组序列完全一致，这为蓝莓不同品种的鉴别提供了物质基础。
简单重复序列(simplesequencerepeat，ssr)，也称为串联重复序列，是基因组中广泛存在的一种共显性位点，具有多态性高，重复性好，易于检测的优点，通过利用已公布的表达序列标签、已完成测序的基因组序列和转录组序列可以获取ssr位点。尽管已有用于蓝莓品种及近缘种遗传图谱构建和功能基因的筛选的ssr标记，但适用于越橘属植物的est-ssr严重不足，截至2018年3月26日，genbank公布的越橘属表达序列标签(est)仅有22402条，尚未见等位基因图谱应用于蓝莓品种及其近缘种进行鉴定的报道。随着第二代测序技术的不断成熟，高通量序列的获取成本越来越低，测序周期越来越短，这为从高通量序列数据中筛选ssr位点提供了便利。因此，从转录组序列中筛选出高效准确鉴定蓝莓品种及其近缘种的ssr位点，不仅能够增加越橘属est-ssr分子标记的数量，还会为蓝莓品种及其近缘种的快速准确鉴定带来极大的便利，为蓝莓新品种的选育提供参考。
技术实现要素：
本发明为克服现有技术中越橘属est-ssr分子标记数量不足的缺点，构建越橘属植物的等位基因图谱，提供一种快速准确鉴定蓝莓品种及其近缘种的方法，增加越橘属分子标记的数量的同时，应用于蓝莓品种真伪的鉴定和亲缘关系分析，为今后的蓝莓新品种选育提供参考。
其是通过如下技术方案实现的：一种快速准确鉴定越橘属植物的检测方法，使用如下引物对进行检测，所述引物对的核苷酸序列如下：
vcssr11-f和vcssr11-r的核苷酸序列分别如seqidno:1、2所示；
vcssr14-f和vcssr14-r的核苷酸序列分别如seqidno:3、4所示；
vcssr19-f和vcssr19-r的核苷酸序列分别如seqidno:5、6所示；
vcssr28-f和vcssr28-r的核苷酸序列分别如seqidno:7、8所示；
vcssr33-f和vcssr33-r的核苷酸序列分别如seqidno:9、10所示。
进一步的，所述越橘属植物来自如下：伯克利、蓝丰、布里吉塔、艾克塔、埃利奥特、泽西、瑞卡、安娜、比洛克西、蓝雨、绿宝石、奥尼尔、薄雾、盛世、莱格西、珍珠、海岸、杜克、奥扎克蓝、夏普蓝、明星、蓝美人、蓝宝石、贵蓝、霍利斯特、麦克法林、贝恩、史蒂文森、苍山越橘、乌鸦果、江南越橘、云南越橘1、云南越橘2、云南越橘3、无梗越橘1、无梗越橘2、乌饭树1和乌饭树2。
此外本发明还提出一种越橘属植物等位基因图谱的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：越橘属植物dna的提取；
步骤2：基因组中简单重复序列位点分析，包括如下步骤：
步骤2.1pcr扩增：
以步骤1提取的dna为模板，使用权利要求1所述的引物对进行pcr扩增；
步骤2.2电泳检测：
取上述扩增产物电泳，紫外灯下拍照记录结果；
步骤2.3ssr基因分型和genemapper软件统计：
选取上述pcr产物与变性剂和内参混匀，使用pcr仪在95℃下变性5min，取出立即放置冰上，然后放入遗传分析仪进行分析，同时使用genemapper软件读取片段长度；
步骤3，遗传多样性分析和等位基因图谱构建
将genemapper统计得到的等位基因长度数据输入excel，根据特异等位基因长度构建其等位基因图谱。
进一步的，所述越橘属植物来自如下：伯克利、蓝丰、布里吉塔、艾克塔、埃利奥特、泽西、瑞卡、安娜、比洛克西、蓝雨、绿宝石、奥尼尔、薄雾、盛世、莱格西、珍珠、海岸、杜克、奥扎克蓝、夏普蓝、明星、蓝美人、蓝宝石、贵蓝、霍利斯特、麦克法林、贝恩、史蒂文森、苍山越橘、乌鸦果、江南越橘、云南越橘1、云南越橘2、云南越橘3、无梗越橘1、无梗越橘2、乌饭树1和乌饭树2。
进一步的，所述步骤2.1pcr扩增具体为：
以步骤1提取的dna为模板进行pcr扩增；
20μl反应体系包含：takarapremixrtaqtm10μl、正向引物0.1μl，反向引物0.5μl，荧光修饰的m13引物0.4μl，10ngdna模板，剩余体积使用双蒸水补齐；
反应程序：94℃预变性3min；94℃变性40s，54℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环后，改变循环条件为94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸40s，进行8个循环，最后72℃延伸8min。
进一步的，在所述正向引物的5'端统一加18bp的m13序列：5’-tgtaaaacgacggccagt-3’。
进一步的，所述荧光修饰的m13引物为5’端分别使用fam和hex两种荧光基团修饰的m13引物，其中m13引物的序列为5’-tgtaaaacgacggccagt-3’。
进一步的，所述步骤1的dna提取包括如下步骤：
步骤1.1配制dna提取液：2％ctab，0.1mtris，20mmedta，1.4mnacl，ph8.0；dna溶解缓冲液：10mmtris；1mmedta；ph＝8.0；
步骤1.2对越橘属植物材料进行如下处理：
①在1.5ml离心管中加入400μl的dna提取液和8μlβ-巯基乙醇，放置在65℃水浴中预热15min；
②取0.1g的蓝莓品种及其近缘种材料的新鲜叶片，在研钵放入少许聚乙烯比咯烷酮k30，加入液氮充分研磨；将研磨好的叶片转移至含dna提取液的离心管中，混匀后放入65℃水浴锅中水浴30min，每隔10min摇匀一次，使叶肉细胞充分裂解；
③水浴结束后，取出离心管冷却至室温；加入400μl预冷的体积比为24:1的氯仿/异戊醇混合溶液，充分混匀后在10000rpm下离心15min；
④用移液器小心吸取上清液，转移至新的1.5ml离心管中，加入400μl的异丙醇和40μl的3m的醋酸钠溶液，轻轻颠倒混匀，静置15min至产生絮状沉淀，然后在10000rpm下离心10min；
⑤离心后弃上清液，将底部白色沉淀即粗提dna小心取出，转入1.5ml离心管中，加入700μl70％的乙醇洗涤两次；离心后弃乙醇，用移液器吸干剩余乙醇，将白色沉淀物收集在离心管侧壁上，放入37℃鼓风干燥箱中烘干；
⑥加入500μldna溶解缓冲液将烘干后的dna重新溶解，使用移液器吸打混匀，待完全溶解后加入1μlrnase，用移液器轻轻吸打dna溶液，混匀后将离心管放入37℃保温箱中保温1h，降解提取液中的rna。
⑦取4μldna溶液在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，检测其完整性。取一半dna溶液，将其稀释至20ng·μl-1用于后续的pcr反应，剩余部分置于-20℃保存。
本发明相对于现有技术所具有的优点为：
1.本发明利用本课题组前期开发的高丛蓝莓‘布里吉塔’品种氯离子胁迫植株的叶片转录组序列中寻找ssr位点，经筛选得到5个具有多态性的通用型ssr位点。
2.本发明筛选出5个ssr位点在38个蓝莓品种及其近缘种中有多态性，能够根据等位基因图谱准确的对蓝莓品种或资源真伪作出判断，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的5个ssr位点应用于更多蓝莓品种及其近缘种上，参照本方法扩充等位基因图谱，丰富可用的等位基因图谱数量。
3.本发明的5个ssr位点来自于高丛蓝莓品种‘布里吉塔’氯离子胁迫植株的叶片转录组，是与功能基因或转录因子同时表达的序列，这为研究这些ssr位点可能具有的功能奠定了良好的基础。
4.本发明提供了一种快速准确鉴定蓝莓品种及其近缘种的方法，本发明通过对蓝莓基因组中5个简单重复序列(simplesequencerepeat，ssr)位点的扩增和基因型分析，可以快速准确的对38份蓝莓品种和近缘种进行鉴别，也可以对蓝莓品种及其近缘种进行亲缘关系分析。ssr位点的扩增共有5个引物对，可在检测过程中同时使用。
5.本发明建立了38份蓝莓品种及其近缘种的等位基因图谱，该图谱不受植株种植环境和栽培措施的影响，是蓝莓品种及近缘种稳定存在的分子身份证，可以直接将本发明所建立的方法和提供的5个引物对应用于更多越橘属植物上，进行种质资源鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为标记vcssr11、vcssr28和vcssr33在部分越橘属植物材料中的pcr扩增产物电泳结果。其中m为dl2000dnamarker(takara，大连)，自上向下分别为长度2000、1000、750、500、250和100bp的标准dna条带，浓度为50ng·μl-1。样品1到8分别为蓝莓品种‘伯克利’、‘蓝丰’、‘艾克塔’、‘比洛克西’、‘蓝雨’、‘绿宝石’、‘海岸’和‘蓝美人’，9和10分别为蔓越莓品种‘麦克法林’和‘史蒂文森’，11和12分别是越橘属野生种苍山越橘和乌鸦果。
图2为蓝莓品种及其近缘种等位基因图谱。通过pcr扩增得到不同越橘属植物基因组5个ssr位点后，对其pcr产物进行毛细管电泳，根据荧光内标，使用genemapper软件分别统计5个ssr位点上等位基因大小，以“数字1/数字2”表示，例如vcssr11位点上，‘瑞卡’的等位基因图谱为“308/344”，苍山越橘为“316/316”，以此类推，构建了38份越橘属植物材料的特异等位基因图谱。
图3为不同蓝莓品种及其近缘种的亲缘关系聚类树。38份种质可以聚为5组。组i包括9个蓝莓品种，其中北高丛蓝莓和南高丛蓝莓品种各4个，同时包含1个兔眼蓝莓品种(‘蓝宝石’)。组ii与组i情况相似，包含北高丛蓝莓和南高丛蓝莓品种各4个；‘泽西’、‘蓝丰’和‘瑞卡’3个北高丛蓝莓品种的亲缘关系非常紧密。6份种质聚在组iii中，其中以4个蔓越莓品种为主，此外包括北高丛蓝莓品种(‘蓝雨’)和南高丛蓝莓品种(‘莱格西’)各1个。组iv中为10份越橘属野生种种质。其他6份种质聚在组v中，由2个兔眼蓝莓品种(‘蓝美人’和‘贵蓝’)、3个南高丛蓝莓品种(‘薄雾’、‘奥扎克蓝’和‘安娜’)以及1个北高丛蓝莓品种(‘艾克塔’)组成。
具体实施方式
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明中的由高丛蓝莓‘布里吉塔’氯离子胁迫植株叶片转录组序列开发的5个ssr位点及等位基因图谱是通过下述方法得到的：
(1)利用本课题组前期开发的高丛蓝莓‘布里吉塔’氯离子胁迫植株叶片转录组序列和misa软件寻找ssr位点，每条ssr序列产生5条引物。使用软件batchprimer3设计引物，引物筛选条件如下：引物长度18-28bp，tm值55-65℃，预期扩增产物长度100-500bp。随机挑选并合成55条引物，使用‘布里吉塔’对55条引物进行pcr扩增验证，选取条带清晰、大小吻合的引物用作后续分析。在设计好的正向引物的5’端统一加18bp的通用序列(m13-tgtaaaacgacggccagt)，另外合成5'端使用fam和hex两种荧光基团修饰的m13引物(序列为5’-tgtaaaacgacggccagt-3’)。引物委托上海英潍捷基贸易有限公司合成；
(2)使用改良ctab(十六烷基三乙基溴化铵，hexadecytrimethylammoniumbromide)法提取蓝莓品种及其近缘种材料的基因组dna(即后续具体做法中的dna提取)；
(3)以38份越橘属植物材料的基因组dna为模板进行pcr扩增：在20μl反应体系中分别加入takarapremixtaqtm10μl、正向引物0.1μl，反向引物0.5μl，荧光修饰的m13引物0.4μl，10ngdna模板。使用eppendorfmastercycler进行pcr扩增，具体步骤为：94℃预变性3min；94℃变性40s，54℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环后，改变循环条件为94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸40s，进行8个循环，最后72℃延伸8min。将5μlpcr产物与1μl6×loadingbuffer混匀后在含有0.5μg/μleb的1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外灯下拍照记录结果。
(4)将约100ng的pcr产物与12μl变性剂和0.25μl内参混匀，使用eppendorfmastercyclerpcr仪在95℃下变性5min，取出立即放置冰上5min，然后放入abi3130遗传分析仪进行分析，使用genemapperversion4.0统计5个ssr位点上对应的等位基因大小，使用microsoftexcel2013分析越橘属不同材料的特异等位基因。
实施例1，
本发明中，等位基因图谱构建方法如下：
一、dna提取
(1)配制dna提取液：2％ctab，0.1mtris，20mmedta，1.4mnacl，ph8.0；dna溶解缓冲液：10mmtris；1mmedta；ph＝8.0；
(2)对蓝莓品种及其近缘种材料进行如下处理：
①在1.5ml离心管中加入400μl的dna提取液和8μlβ-巯基乙醇，放置在65℃水浴中预热15min；
②取0.1g蓝莓品种及其近缘种材料的新鲜叶片，在研钵放入少许聚乙烯比咯烷酮k30(pvp-k30)，加入液氮充分研磨；将研磨好的叶片转移至含dna提取液的离心管中，混匀后放入65℃水浴锅中水浴30min，每隔10min摇匀一次，使叶肉细胞充分裂解；
③水浴结束后，取出离心管冷却至室温；加入400μl预冷的体积比为24:1的氯仿/异戊醇混合溶液，充分混匀后在10000rpm下离心15min；
④用移液器小心吸取上清液，转移至新的1.5ml离心管中，加入400μl的异丙醇和40μl的3m的醋酸钠溶液，轻轻颠倒混匀，静置15min至产生絮状沉淀，然后在10000rpm下离心10min；
⑤离心后弃上清液，将底部白色沉淀即粗提dna小心取出，转入1.5ml离心管中，加入700μl70％的乙醇洗涤两次；离心后弃乙醇，用移液器吸干剩余乙醇，将白色沉淀物收集在离心管侧壁上，放入37℃鼓风干燥箱中烘干；
⑥加入500μldna溶解缓冲液将烘干后的dna重新溶解，使用移液器吸打混匀，待完全溶解后加入1μlrnase，用移液器轻轻吸打dna溶液，混匀后将离心管放入37℃保温箱中保温1h，降解提取液中的rna。
⑦取4μldna溶液在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，检测其完整性。取一半dna溶液，将其稀释至20ng·μl-1用于后续的pcr反应，剩余部分置于-20℃保存。
二、基因组中简单重复序列位点分析
1、pcr扩增
(1)20μl反应体系包含：
takarapremixtaqtm10μl、正向引物0.1μl，反向引物0.5μl，荧光修饰的m13引物0.4μl，10ngdna模板(通过上述dna提取方法提取的越橘属植物材料的dna)和双蒸水。
(2)反应程序：
94℃预变性3min；94℃变性40s，54℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环后，改变循环条件为94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸40s，进行8个循环，最后72℃延伸8min。
2、电泳检测：
取上述扩增产物5μl，加入1μl6×loadingbuffer；在含有0.5μg/μleb的1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下拍照记录结果。
3、ssr基因分型和genemapper软件统计：
将约100ng的pcr产物与12μl变性剂和0.25μl内参混匀，使用eppendorfmastercyclerpcr仪在95℃下变性5min，取出立即放置冰上5min，然后放入abi3130遗传分析仪进行分析，同时使用genemapper软件读取片段长度。
三、等位基因图谱构建
将genemapper统计得到的等位基因长度数据输入microsoftexcel2013，根据特异等位基因长度构建其等位基因图谱。
试验结果：本发明共发现5个ssr位点在38个不同越橘属植物材料上表现多态性，引物序列具体见表1。
表1用于扩增越橘属植物基因组中ssr位点的引物序列
图1为部分越橘属植物材料基因组中ssr位点vcssr11、vcssr28和vcssr33的pcr扩增产物电泳结果。
参考图2，利用vcssr11、vcssr14、vcssr19、vcssr28和vcssr33这5个ssr位点构建了38份越橘属植物的等位基因图谱，特异等位基因可有效鉴别出38份种质，包括21个高丛蓝莓品种、3个兔眼蓝莓品种、10个越橘属野生种和4个蔓越莓品种(图2)。当前38份越橘属植物涵盖了我国主栽的蓝莓品种，若当前蓝莓品种或其近缘种材料不确定时，可以使用本发明中的5个ssr位点对待检测样品的基因组dna进行pcr扩增，把相应位点的等位基因组成对应到本发明中的等位基因图谱即可确定待检样品的真伪。
图3为不同蓝莓品种及其近缘种的亲缘关系聚类树。38份种质可以聚为5组。组i包括9个蓝莓品种，其中北高丛蓝莓和南高丛蓝莓品种各4个，同时包含1个兔眼蓝莓品种(‘蓝宝石’)。组ii与组i情况相似，包含北高丛蓝莓和南高丛蓝莓品种各4个；‘泽西’、‘蓝丰’和‘瑞卡’3个北高丛蓝莓品种的亲缘关系非常紧密。6份种质聚在组iii中，其中以4个蔓越莓品种为主，此外包括北高丛蓝莓品种(‘蓝雨’)和南高丛蓝莓品种(‘莱格西’)各1个。组iv中为10份越橘属野生种种质。其他6份种质聚在组v中，由2个兔眼蓝莓品种(‘蓝美人’和‘贵蓝’)、3个南高丛蓝莓品种(‘薄雾’、‘奥扎克蓝’和‘安娜’)以及1个北高丛蓝莓品种(‘艾克塔’)组成。
本发明所涉及的蓝莓品种几乎囊括了中国的所有主栽品种，利用5个ssr位点所构建的蓝莓品种及其近缘种的等位基因图谱具备拓展空间，在给定已知品种时，便可利用5个ssr位点中的1个或多个组合补充新加入材料的特异等位基因。待检测蓝莓品种若不在本例列出的38个，亦可利用本发明提供的5个ssr位点评估待检测品种与已知品种的亲缘关系，为品种鉴定提供参考。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110>浙江师范大学
<120>一种快速准确鉴定越橘属植物的检测方法
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gctccctctttcgcttcttt20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
aaaaatcaggttcggttcca20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cagtttgcacatcacccttg20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
atggatacatggaccttgcc20
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
ccaaccctcgtactcttcca20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
cccacctcagaaaaccgata20
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
gcagcgaaccctaaactcaa20
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
acggagctggctcacactat20
<210>9
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
ggtttgggtttgcctctctc20
<210>10
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
acgccgtgatctgcagtag19