本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种基于转录组序列开发菊芋ssr分子标记引物的方法。
背景技术：
菊芋又称洋姜、鬼子姜、姜不辣，属菊科向日葵属，是一种能形成较大地下块茎的栽培植物。其块茎中富含的果聚糖是益生元的主要成分之一，具有极高的经济价值及营养保健价值。菊芋适应性很强，在我国分布广泛，北方省份有丰富的地方品种，是菊芋新品种选育的重要种质资源。目前针对菊芋种质资源遗传多样性的研究多集中于审定品种及主栽品种，从而造成地方品种居群遗传结构方面的认识和评价不足。
针对菊芋遗传多样性研究所采用的分子标记方法有rapd、issr、srap及ssr。其中ssr标记的引物信息主要来自与同属植物向日葵，这些标记具有一定的通用性，但在不同种之间还是有一定的保守性，在菊芋中表现为多态性不高。常规est-ssr标记数据来源多为ncbi公共数据库中的cdna片段，由于ncbi中收录的菊芋cdna片段数量太少，查找的ssr位点数量不足，无法符合est-ssr的开发要求。近年来，根据高通量测序建立的转录组测序可以快速有效的获取大量具有基因信息的ssr标记，并且其来自于基因的转录区，其中的特异性片段多与基因功能有关。目前在等作物中通过转录组开发的ssr标记已有报道，但对于菊芋转录组开发的研究还未见报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于转录组序列开发菊芋ssr分子标记引物的方法，转录组开发的ssr引物序列来源自其转录区域，相较与现有的基因组ssr其针对性更强，特异性更高，且价格低廉，开发相对较为容易。
为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案：一种基于转录组序列开发菊芋ssr分子标记引物的方法，其特征在于：所述基于转录组序列开发菊芋ssr分子标记引物的方法包括如下步骤：
(1)采取花期的根(粗壮根根尖1cm、幼嫩根根尖1cm)、茎(茎基部1cm、茎尖0.5cm)、叶(第一片真叶0.1g、幼嫩叶0.1g)、花(花瓣0.1g、花粉0.1g)和块茎(纵切表皮部0.1g、块茎中央0.1g)提取rna并等量组成混合样品后，用hiseqtm2500测序仪进行转录组测序，待测序完成采用trinity进行序列组装，得到63089条unigene，作为分析背景数据；
(2)利用ctab法提取菊芋资源dna供检测转录组开发的ssr标记有效性；
(3)利用软件misa对菊芋转录组数据中的unigene进行搜索，设置搜索标准：最小重复数二核苷酸6次、三核苷酸5次、四核苷酸4次、五核苷酸4次、六核苷酸4次，设置ssr位点间隔最小为100bp；
(4)用primer3软件对ssr重复单元的上下游序列进行引物设计与评价，每条ssr设计3对引物。引物序列长度16-25bp，预期扩增的片段长度120～300bp，退火温度55～65℃；
(5)引物设计过程中避免出现引物二聚体、发卡结构及错配等引物二级结构，从中挑选200对符合用于pcr扩增的引物由华大基因有限公司合成，引物筛选及扩增的pcr反应体系25ul：dna模板50ng，2×pcrmastermix(tiangen)12.5ul，上下游引物1ul，ddh2o9.5ul；
(6)扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳2h，银染法显色，以ssr条带的出现频率和ssr的分布距离评价est-ssr，ssr出现频率人工读带，对电泳图上可重复的清晰条带记为“1”，对模糊不清或者缺失的条带记为“0”，建立原始数据矩阵，利用软件ntsys2.10e的upgma法进行聚类分析绘图。
采用以上技术方案的有益效果是：该基于转录组序列开发菊芋ssr分子标记引物的方法通过对菊芋品种“青芋1号”的各个器官部位进行转录组测序，利用表达基因的序列数据进行ssr位点的挖掘，对菊芋中ssr的分布及组成特点进行分析，开发ssr引物，并对其在菊芋中的可用性进行初步评价，以期利用ssr标记方法对菊芋种质资源多样性分析、种质资源评价及核心种质资源的发掘奠定基础。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
图1是菊芋ssr分子标记引物的电泳图。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明基于转录组序列开发菊芋ssr分子标记引物的方法的优选实施方式。
图1出示本发明基于转录组序列开发菊芋ssr分子标记引物的方法的具体实施方式：
菊芋转录组数据来源于本课题组2016年对“青芋1号”进行illumina高通量测序结果。2016年3月份将该品种种植于青海大学农林科学院园艺所实验地，采取花期的根(粗壮根根尖1cm、幼嫩根根尖1cm)、茎(茎基部1cm、茎尖0.5cm)、叶(第一片真叶0.1g、幼嫩叶0.1g)、花(花瓣0.1g、花粉0.1g)和块茎(纵切表皮部0.1g、块茎中央0.1g)提取rna并等量组成混合样品后，委托广州基迪奥生物科技有限公司使用hiseqtm2500测序仪进行转录组测序，待测序完成采用trinity进行序列组装，得到63089条unigene，作为分析背景数据。利用ctab法提取菊芋资源dna供检测转录组开发的ssr标记有效性。
利用软件misa对菊芋转录组数据中的unigene进行搜索，设置搜索标准：最小重复数二核苷酸6次、三核苷酸5次、四核苷酸4次、五核苷酸4次、六核苷酸4次，设置ssr位点间隔最小为100bp。用primer3软件对ssr重复单元的上下游序列进行引物设计与评价，每条ssr设计3对引物。引物序列长度16-25bp，预期扩增的片段长度120～300bp，退火温度55～65℃。引物设计过程中避免出现引物二聚体、发卡结构及错配等引物二级结构。从中挑选200对符合用于pcr扩增的引物由华大基因有限公司合成。引物筛选及扩增的pcr反应体系25ul：dna模板50ng，2×pcrmastermix(tiangen)12.5ul，上下游引物1ul，ddh2o9.5ul。扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳2h，银染法显色。以ssr条带的出现频率和ssr的分布距离评价est-ssr。ssr出现频率人工读带，对电泳图上可重复的清晰条带记为“1”，对模糊不清或者缺失的条带记为“0”，建立原始数据矩阵。利用软件ntsys2.10e的upgma法进行聚类分析绘图。
菊芋转录组数据表
以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。